專利名稱：降解氯苯類(lèi)化合物的細(xì)菌和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及廢水生物處理，具體屬于可降解氯苯類(lèi)化合物的細(xì)菌以及利用該細(xì)菌降解水中氯苯類(lèi)化合物的方法。
背景技術(shù)：
隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，進(jìn)入環(huán)境中的人工合成化合物越來(lái)越多，其中鹵代芳香族化合物所占的比例也日趨增大。鹵代芳香族化合物是芳香族化合物分子或其衍生物分子中一個(gè)或幾個(gè)氫原子被鹵素原子取代之后的產(chǎn)物。由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變使原化合物的性質(zhì)發(fā)生了很大的變化，特別是生物降解性明顯地降低。環(huán)境中最常見(jiàn)的為氯代芳香化合物，如氯苯、氯酚、氯代苯氧酸、氯代聯(lián)苯等幾類(lèi)。這些化合物廣泛用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，是一類(lèi)污染面廣、毒性較大、難生物降解、大多是具有“三致”作用的化合物。美國(guó)環(huán)保局(EPA)公布的129種優(yōu)先控制污染物中有25種是氯苯類(lèi)化合物。如何有效地消除氯苯類(lèi)化合物對(duì)環(huán)境的影響，是目前眾多研究者關(guān)注的問(wèn)題，在利用微生物對(duì)其進(jìn)行生物降解的研究方面，到目前為止，已經(jīng)國(guó)外已有研究者從土壤、水體和底泥中分離獲得了能夠降解氯代芳香化合物的微生物，但這些微生物對(duì)氯苯類(lèi)化合物的耐受濃度較低，只能處理水中較低濃度的氯苯類(lèi)化合物，如Jechorek，M等用Methylocystis sp.GB 14 DSM 12955菌，在T＝20-30℃、pH＝6.8條件下厭氧降解氯苯的適宜濃度范圍為20-40mg/L(文獻(xiàn)參見(jiàn)Jechorek，M，Wendlandt K.-D，Beck M.Cometaabolicdegradation of chlorinated aromatic compounds.Journal of Biotechnology，2003，102(1)，93-98)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠承受并能有效降解水中高濃度氯苯類(lèi)化合物的微生物以及用這種微生物降解氯苯類(lèi)化合物的方法。
本發(fā)明提供一種可降解氯苯類(lèi)化合物的細(xì)菌，其特征在于，它是光合細(xì)菌。所述的光合細(xì)菌是紅螺菌屬(Rhodospirillium)，如深紅紅螺菌(Rhodospirillium rubrum)；紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)，如沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、綠色紅假單胞菌(Rhodopseudomonas viridis)、綠硫紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sulfoviridis)、海洋紅假單胞菌(Rhodopseudomonas marina)；紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)，如球形紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)中的任意一株菌或它門(mén)的任意組合。
上述光合細(xì)菌由山西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院光合細(xì)菌研究室分離、鑒定并保存。地址山西省太原市塢城路92號(hào)山西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院。
這些光合細(xì)菌菌種的文獻(xiàn)出處張肇銘，鄧松錄，趙良啟等.紫色非硫光合細(xì)菌的研究A.球形紅假單胞菌的分離、鑒定和生理特性的研究.山西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1984，(4)54-59；姚竹云，張肇銘.幾株光合細(xì)菌的表型特征及其DNA-DNA同源性分析.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，1996，2(1)84-89；張肇銘，楊素萍，趙春貴.沼澤紅假單胞菌的分離鑒定研究.山西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1992，(4)379-385；楊素萍，張肇銘，趙春貴.綠色紅假單胞菌和綠硫紅假單胞菌的分離與鑒定.微生物學(xué)報(bào)，1995，35(2)91-96。
關(guān)于球形紅細(xì)菌的說(shuō)明根據(jù)Bergey細(xì)菌鑒定手冊(cè)第八版(1975)，球形紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)名稱為球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroides)，但是1989年出版的Bergey系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)以及1992年出版的Bergey細(xì)菌鑒定手冊(cè)第九版將該光合細(xì)菌命名為球形紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)。
本發(fā)明提供一種降解氯苯類(lèi)化合物的方法，包括如下步驟(1)在無(wú)菌條件下，將光合細(xì)菌培養(yǎng)基中加入氯苯類(lèi)化合物，配成含有20-100mg/L氯苯類(lèi)化合物的培養(yǎng)液；(2)在上述培養(yǎng)液中按體積比5％-50％接入光合細(xì)菌，在20-45℃、光照1000-3000Lx、厭氧條件下，馴化培養(yǎng)3-30天，作為馴化菌種；(3)在無(wú)菌條件下，將馴化菌種按體積比5％-30％接入含20-200mg/L氯苯類(lèi)化合物的培養(yǎng)液中，在20-45℃、光照1000-3000Lx厭氧或微好氧條件下培養(yǎng)48-136h；或在20-45℃、自然光或黑暗、好氧條件下，培養(yǎng)4-120h；水中氯苯類(lèi)化合物降解率可達(dá)96-100％。
所述的馴化菌種也可進(jìn)行固定化。所述固定方法可采用包埋法。
所述的氯苯類(lèi)化合物可以是氯苯、二氯苯、三氯苯、四氯苯、五氯苯、六氯苯。
所述的光合細(xì)菌培養(yǎng)基的主要成分及配比范圍為MgSO40.2-0.5g，CaSO40.05-0.1g，NH4SO40.1-1.0g，蘋(píng)果酸0.5-2.0g，KH2PO40.5-1.0g，K2HPO40.5-1.5g，酵母膏0.5-1.5g，蒸餾水1000mL，pH6.5-7.5。優(yōu)選配比為MgSO40.2g，CaSO40.076g，NH4SO40.1g，蘋(píng)果酸1.0g， KH2PO40.6g，K2HPO40.9g，酵母膏1g，蒸餾水1000mL，pH7.0。該培養(yǎng)基適合光合細(xì)菌生長(zhǎng)并能有效降解氯苯類(lèi)化合物。所述的培養(yǎng)基也可以采用普通的其它光合細(xì)菌培養(yǎng)基。
本發(fā)明所述的細(xì)菌可用于含有氯苯類(lèi)化合物廢水的處理。
本發(fā)明降解完氯苯后的菌體，經(jīng)收集可用作有機(jī)肥料或飼料添加劑。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1.本發(fā)明采用光合細(xì)菌對(duì)氯苯類(lèi)化合物進(jìn)行降解，它不僅能在厭氧、微好氧光照的條件下以低級(jí)脂肪酸、多種二羧酸、醇類(lèi)、糖類(lèi)、芳香族化合物等低分子有機(jī)物作為光合作用的電子供體，氯苯類(lèi)化合物作為電子受體以共代謝方式進(jìn)行降解，而且能在好氧黑暗及自然光的條件下，利用二加氧酶的作用，對(duì)氯苯類(lèi)化合物進(jìn)行好氧降解。因此，利用光合細(xì)菌能在多種環(huán)境條件下降解氯苯類(lèi)化合物，利于實(shí)際應(yīng)用。
2.利用光合細(xì)菌降解氯苯類(lèi)化合物，處理效率高，處理效率可達(dá)90％以上，成本低，操作簡(jiǎn)便，易于工業(yè)化實(shí)施。
3.光合細(xì)菌對(duì)氯苯類(lèi)化合物耐受濃度高，可承受并處理氯苯類(lèi)化合物濃度為200mg/L的廢水。
4.光合細(xì)菌降解完氯苯類(lèi)化合物后的菌體，可直接用作有機(jī)肥料和飼料添加劑，沒(méi)有二次污染產(chǎn)生。


圖1光合細(xì)菌球形紅細(xì)菌厭氧降解氯苯0h的GC-MS分析2光合細(xì)菌球形紅細(xì)菌厭氧降解氯苯64h的GC-MS分析3光合細(xì)菌球形紅細(xì)菌厭氧降解氯苯136h的GC-MS分析4固定化深紅紅螺菌降解氯苯動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)裝置5不同好氧條件下固定化深紅紅螺菌降解氯苯曲線圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1培養(yǎng)基MgSO40.2g，CaSO40.076g，NH4SO40.1g，蘋(píng)果酸1.0g，KH2PO40.6g，K2HPO40.9g，酵母膏1g，蒸餾水1000mL，pH7.0。
降解步驟培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌，將光合細(xì)菌培養(yǎng)基中加入氯苯類(lèi)化合物，制備成含有40mg/L氯苯類(lèi)化合物的培養(yǎng)液；在上述培養(yǎng)液中按體積比10％接入球形紅細(xì)菌，在30℃、2000Lx光照培養(yǎng)箱中厭氧馴化培養(yǎng)3天，作為馴化菌種；在無(wú)菌條件下，將25mL馴化菌種的懸液以10000r/min離心10min，棄上清液，菌體用磷酸緩沖液洗滌2次后加入250mL含100mg/L氯苯的培養(yǎng)液中，在30℃、2000Lx光照培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取樣，樣品經(jīng)10000r/min離心10min后，取上清液測(cè)氯苯濃度和降解產(chǎn)物。
氯苯濃度采用高效液相色譜法(SHIMADZU LC-10ATVP)測(cè)定.分離柱為Nova2Pak C18，4Lm，3.9mm×150mm；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；流動(dòng)相為甲醇/水(體積比為75∶25)；流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10μL。
降解產(chǎn)物用美國(guó)Agilent公司HP 6890 GC-5973 N MSDGC-MS聯(lián)用儀分析.氣相條件，以高純氦氣(99.999％)為載氣，恒流10mL/min；分流進(jìn)樣，分流比1∶20；進(jìn)樣口溫度230℃；柱溫起始為60℃，以5℃/min至160℃，色譜質(zhì)譜傳輸溫度250℃.質(zhì)譜條件，離子源溫度230℃；倍增電壓1200V；發(fā)射電子能70eV；全掃描范圍為50-350amu。吹掃捕集條件，高純氦氣，吹掃流速40mL/min，吹掃時(shí)間10min，解吸溫度225℃，解吸時(shí)間8min，烘烤時(shí)間10min，烘烤溫度225℃。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明球形紅細(xì)菌在厭氧條件下處理136h，氯苯去除率可達(dá)96.4％；GC-MS分析球形紅細(xì)菌降解氯苯在處理時(shí)間0h、64h、和136h時(shí)的產(chǎn)物(圖1、圖2、圖3)可知，降解產(chǎn)物主要為CHCl3、CHCl2和CH2ClCH2Cl。
實(shí)施例2無(wú)菌條件下，將沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)馴化菌種接種量10％、含氯苯濃度為100mg/L的培養(yǎng)液在30℃、140r/m的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中好氧培養(yǎng)，其它實(shí)驗(yàn)條件和步驟同實(shí)施例1。結(jié)果表明沼澤紅假單胞菌在好氧條件下當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間僅2h時(shí)，氯苯去除率就達(dá)77％，6h氯苯完全被降解，去除率為100％；GC-MS分析沼澤紅假單胞菌好氧降解氯苯在處理時(shí)間0h、6h、和108h時(shí)的產(chǎn)物可知，降解中間產(chǎn)物主要為CHCl3。
實(shí)施例3無(wú)菌條件下，在含100mg/L的鄰二氯苯培養(yǎng)液中加入接種量10％的球形紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)馴化菌種，進(jìn)行厭氧降解鄰二氯苯的實(shí)驗(yàn)，其它實(shí)驗(yàn)條件和步驟同實(shí)施例1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明球形紅細(xì)菌在厭氧條件下104h內(nèi)能完全降解鄰二氯苯，GC-MS分析球形紅細(xì)菌降解鄰二氯苯在處理時(shí)間0h、54h、和104h時(shí)的產(chǎn)物可知，主要降解過(guò)程為二氯苯首先脫氯生成氯苯，然后進(jìn)一步被降解成CHCl3。
實(shí)施例4菌種的馴化將10％深紅紅螺菌(Rhodospirillium rubrum)原始菌液接入氯苯含量為40mg/L的馴化培養(yǎng)基，在30℃、2000Lx光照培養(yǎng)箱中厭氧馴化培養(yǎng)3天，作為馴化菌種。
將經(jīng)離心脫水后的深紅紅螺菌菌體30g加入到1000mL40℃已完全溶解的10％聚乙烯醇溶液中均勻混合，通過(guò)注射器針頭將上述混合液滴入10％過(guò)飽和硼酸溶液中，形成3mm左右的小球，18h后取出固定化微生物小球，用生理鹽水沖洗干凈，在無(wú)菌條件下放入培養(yǎng)基中活化24h備用。
固定化深紅紅螺菌(Rhodospirillium rubrum)降解氯苯實(shí)驗(yàn)在反應(yīng)器中加入含200mg/L氯苯的模擬廢水(氯苯模擬廢水成分為實(shí)施例1所述培養(yǎng)基按200mg/L加入氯苯)1500mL、固定化深紅紅螺菌小球14g/L、水力停留時(shí)間24h、pH＝7.0、T＝30℃、自然光在廢水的DO分別為7.3、5.49、4.87、1.26mg/L條件下，進(jìn)行固定化深紅紅螺菌降解氯苯的動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)裝置見(jiàn)圖4。每隔一定時(shí)間取上清液測(cè)氯苯濃度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。圖5表明，氯苯的去除率不僅隨廢水的DO增加而增加，而且隨著廢水的DO的增加，達(dá)到氯苯的最高去除率的時(shí)間逐漸縮短。當(dāng)廢水的DO為7.3、5.49、4.87、1.26mg/L時(shí)，達(dá)到氯苯最高去除率的時(shí)間依次為48h、96h、96h、120h。當(dāng)DO為7.3mg/L時(shí)，氯苯去除率最高為90.0％。
實(shí)施例5首先將海洋紅假單胞菌(Rhodopseudomonas marina)和球形紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)1∶1(體積比)混合并按實(shí)施例1步驟進(jìn)行馴化培養(yǎng)；然后將馴化培養(yǎng)好的混合菌種以12％接種量接入含1，2，4，5-四氯苯80mg/L的培養(yǎng)基中，在30℃、2000Lx光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行厭氧降解四氯苯的實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)時(shí)間72h，去除率達(dá)88％。
權(quán)利要求
1.種可降解氯苯類(lèi)化合物的細(xì)菌，其特征在于，它是光合細(xì)菌。
2.按照權(quán)利要求1所述的可降解氯苯類(lèi)化合物的細(xì)菌，其特征在于，所述的光合細(xì)菌是紅螺菌屬(Rhodospirillium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅細(xì)菌(Rhodobacter)屬中的任意一株菌或它門(mén)的任意組合。
3.一種用權(quán)利要求1所述的細(xì)菌降解氯苯類(lèi)化合物的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)在無(wú)菌條件下，將光合細(xì)菌培養(yǎng)基中加入氯苯類(lèi)化合物，配成含有20-100mg/L氯苯類(lèi)化合物的培養(yǎng)液；(2)在上述培養(yǎng)液中按體積比5％-50％接入光合細(xì)菌，在20-45℃、光照1000-3000Lx、厭氧條件下，馴化培養(yǎng)3-30天，作為馴化菌種；(3)在無(wú)菌條件下，將馴化菌種按體積比5％-30％接入含20-200mg/L氯苯類(lèi)化合物的培養(yǎng)液中，在20-45℃、光照1000-3000Lx厭氧或微好氧條件下培養(yǎng)48-136h；或在20-45℃、自然光或黑暗、好氧條件下，培養(yǎng)4-120h。
4.按照權(quán)利要求3所述的降解氯苯類(lèi)化合物的方法，其特征在于，所述的馴化菌種也可進(jìn)行固定化。
5.按照權(quán)利要求3所述的降解氯苯類(lèi)化合物的方法，其特征在于，所述的氯苯類(lèi)化合物是氯苯、二氯苯、三氯苯、四氯苯、五氯苯或六氯苯。
6.按照權(quán)利要求3所述的降解氯苯類(lèi)化合物的方法，其特征在于，所述的光合細(xì)菌培養(yǎng)基的主要成分及配比為MgSO40.2-0.5g，CaSO40.05-0.1g，NH4SO40.1-1g，蘋(píng)果酸0.5-2g，KH2PO40.5-1g，K2HPO40.5-1.5g，酵母膏0.5-1.5g，蒸餾水1000mL，pH6.5-7.5。
7.按照權(quán)利要求1所述細(xì)菌的用途，用于含有氯苯類(lèi)化合物廢水的處理。
全文摘要
一種可降解氯苯類(lèi)化合物的細(xì)菌，它是光合細(xì)菌。利用該細(xì)菌在水中降解氯苯類(lèi)化合物的方法，步驟包括在含氯苯類(lèi)化合物的光合細(xì)菌培養(yǎng)液中馴化菌種；將馴化菌種接入含20－200mg/L氯苯類(lèi)化合物的光合細(xì)菌培養(yǎng)液中，在20－45℃、光照1000－3000Lx厭氧或微好氧條件下培養(yǎng)48－136h；或在20－45℃、自然光或黑暗、好氧條件下，培養(yǎng)4－120h，均可有效降解氯苯類(lèi)化合物。該細(xì)菌可用于含有氯苯類(lèi)化合物廢水的處理。
文檔編號(hào)A62D3/00GK1970739SQ20061010211
公開(kāi)日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2006年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月31日
發(fā)明者王玉芬, 張肇銘, 貢俊, 楊官娥 申請(qǐng)人:山西大學(xué)