專利名稱：抗人白細(xì)胞介素-4的單克隆抗體及產(chǎn)生白細(xì)胞介素-4的雜交瘤的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及單克隆抗體及其相關(guān)的雜交瘤，更具體地說是涉及特異于人白細(xì)胞介素-4的單克隆抗體。
人白細(xì)胞介素-4(IL-4)首先是由Yokota等人(Proc.Natl.Acad.Sci.，83∶5894-5898，1986)克隆并鑒定的。IL-4是一種作用于免疫系統(tǒng)許多成分的高度多向性的淋巴激活素。它具有T細(xì)胞生長因子(TCGF)活性和B細(xì)胞生長因子活性。它能夠增強(qiáng)白細(xì)胞介素-2(IL-2)的TCGF活性和粒性白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的集落生成活性。它誘導(dǎo)IgG1和IgE的優(yōu)先產(chǎn)生，并誘導(dǎo)人白細(xì)胞Ⅱ類DR抗原的表達(dá)。這些活性提示IL-4具有幾種可能的治療應(yīng)用，如作為IL-2抗腫瘤治療的增強(qiáng)劑，作為GM-CSF刺激的骨髓再生增強(qiáng)劑，或作為裸核淋巴細(xì)胞綜合癥的治療劑(Touraine，Lancet，319-321(1981，2，1);Touraine and Betuel，Human Immunology，2∶147-153(1981);Sullivan et al.，J.Clin.Invest.，76∶75-79(1985))。
IL-4的IgE誘導(dǎo)活性可能對變態(tài)反應(yīng)性疾病患者具有重要意義。IL-4拮抗劑的可得性可為使用具有許多有害副作用的糖皮質(zhì)類固醇(特別是在長期使用的情況下)提供一種替代物(參見GoodmanandGillman，ThePharmacologicalBasisofTher-apeutics，6thEd.，MacMillanPublishingCompany，NewYork，1980)。特別是，通過產(chǎn)生抗個(gè)體基因型抗體(例如，美國專利4，731，237)或通過模擬型篩選(如Geysenetal.，J.Immunol.Meth.，102∶259-274，1987;PCT專利申請WO86/00991和WO86/06487)來強(qiáng)烈阻斷對人IL-4特異的單克隆抗體，為構(gòu)建拮抗劑提供了一種方法。
任何涉及藥物的治療方法，其重要之處就在于是否能夠預(yù)計(jì)和/或監(jiān)測病人血液或其他體液中的藥物濃度。單克隆抗體被廣泛地用于這一目的(例如Springer，ed.，HybridomaTechnologyintheBiosciencesandMedicine，PlenumPress，N.Y.，1985;美國專利4，562，003、4，486，530和4，255，329)。
在遺傳改造的蛋白質(zhì)如IL-4的生產(chǎn)中，一個(gè)主要的問題是從轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和/或其培養(yǎng)上清液中分離所表達(dá)的蛋白質(zhì)。常用的分離方法包括使粗品一次或多次通過免疫吸附柱。特異于欲純化蛋白質(zhì)的單克隆抗體是這種吸附柱的關(guān)鍵性組成部分。也可用這類單克隆抗體來檢驗(yàn)由特定方法(如“Western”印跡分析法)進(jìn)行純化的程度(Burnette，Anal.Biochem.，112∶195-203，1981)。
由上述情況可以看出，通過改進(jìn)現(xiàn)有的純化方法，并提供監(jiān)測血液、尿等體液中IL-4濃度的方法，將有利于IL-4特異性單克隆和/或多克隆抗體在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。
本發(fā)明提供用于檢測、純化、測定和/或抑制人IL-4的化合物和組合物。這些化合物和組合物是由產(chǎn)生人IL-4特異性單克隆抗體的雜交瘤中得到的。本發(fā)明的化合物和組合物包括雜交瘤本身、由雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體、重鏈和輕鏈可變區(qū)多肽及這些抗體的其他片段，如包含輕鏈與重鏈通過天然二硫鍵而連接的半分子、Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段等。本發(fā)明還包括使用上述化合物和組合物檢測、純化和測定人IL-4濃度的方法，以及實(shí)施這些方法的試劑盒。特別是，本發(fā)明包括雜交瘤IC1·llB4.6和MP4.25D2.11及其單克隆抗體和由其衍生的產(chǎn)物。
本發(fā)明的組合物也可用作人IL-4的激動劑或拮抗劑。具體地說，包含拮抗性抗IL-4抗體(如MP4.25D2.11的單克隆抗體)片段的組合物可用作治療特異反應(yīng)性疾病的治療劑。
本發(fā)明的組合物還包括自雜交瘤ICl.llB4.6和MP4.25D2.11中提取的信使RNA(mRNA)。這些mRNA可用于在細(xì)菌、酵母或其他宿主中克隆和表達(dá)ICl.llB4.6和MP4.25D2.11抗體的片段。
抗體包含通過二硫橋連接在一起的多肽鏈集合體。稱為輕鏈和重鏈的兩條多肽主鏈構(gòu)成抗體的所有主要結(jié)構(gòu)類別(同型物)。重鏈和輕鏈都進(jìn)一步分為稱作可變區(qū)和恒定區(qū)的一些亞區(qū)。重鏈包括單個(gè)的可變區(qū)和三個(gè)不同的恒定區(qū)，輕鏈則包括單個(gè)可變區(qū)(不同于重鏈的可變區(qū))和單個(gè)的恒定區(qū)(不同于重鏈的恒定區(qū))。重鏈和輕鏈的可變區(qū)負(fù)責(zé)抗體的結(jié)合特異性。
本文所用的術(shù)語“重鏈可變區(qū)”是指一種多肽，(1)其長度為110至125個(gè)氨基酸;(2)其氨基酸順序相應(yīng)于本發(fā)明單克隆抗體從重鏈N末端氨基酸開始的重鏈氨基酸順序。同樣，術(shù)語“輕鏈可變區(qū)”是指一種多肽，(1)其長度為95至115個(gè)氨基酸;(2)其氨基酸順序相應(yīng)于本發(fā)明單克隆抗體從輕鏈N末端氨基酸開始的輕鏈氨基酸順序。
所用的術(shù)語Fab、Fc、F(ab)2及Fv各有其標(biāo)準(zhǔn)的免疫學(xué)含義(見Klein，Immunology，John Wiley，New York，1982;Parham，Chapter14，inWeir，ed.Immunochemistry，4thEd.，BlackwellScientificPublishers，Oxford，1986)。
本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”是指能與人IL-4特異結(jié)合的免疫球蛋白的同源群體。應(yīng)明確的是，人IL-4可具有一個(gè)或多個(gè)下述的抗原決定簇(1)由人IL-4內(nèi)幾條單一肽鏈組成的肽抗原決定簇;(2)由一個(gè)以上空間上接近的肽鏈組成的構(gòu)象抗原決定簇，這些肽鏈各自的氨基酸順序在人IL-4多肽順序上的位置并不相互銜接;(3)由翻譯后共價(jià)連接到人IL-4上的整個(gè)或部分分子結(jié)構(gòu)(如糖基等)組成的翻譯后抗原決定簇。本發(fā)明的抗體可以針對一個(gè)或多個(gè)上述決定簇。
本文所使用的術(shù)語“結(jié)合組合物”是指含有這樣兩條多肽鏈的組合物(1)這兩條肽鏈有效結(jié)合時(shí)，呈對人IL-4有高度結(jié)合親合性的構(gòu)象;(2)它們得自于產(chǎn)生人IL-4特異性單克隆抗體的雜交瘤。術(shù)語“有效結(jié)合”旨在指明這兩條多肽鏈在結(jié)合時(shí)能以各種方式彼此相對定位，這些方式包括在天然抗體片段如Fab或Fv中結(jié)合，或借助于羧基末端的遺傳改造的含半胱氨酸連接肽而結(jié)合。這兩個(gè)多肽鏈通常相當(dāng)于人IL-4特異性單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)。


圖1圖解顯示了適于在細(xì)菌宿主內(nèi)表達(dá)非糖基化人IL-4的表達(dá)載體;
圖2圖示了人IL-4最后純化步驟的215nm光吸收圖譜;
圖3(A部分和B部分)顯示了對結(jié)合于Daudi細(xì)胞上的125I-CHO HuIL-4的中和作用。
用已知技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的雜交瘤。該方法通常包括使一種可持久傳代的細(xì)胞系與一種可產(chǎn)生所需抗體的B淋巴細(xì)胞融合。另外，亦可使用非融合技術(shù)來產(chǎn)生持久存活的抗體生成細(xì)胞系，如利用病毒誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化作用(Casali，etal.，“HumanMonoclonalsfromAntigen-SpecificSelectionofBLymphocytesandTransformationbyEBV”，Science，234∶476-479，1986)，這也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。持久存活的細(xì)胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞，特別是嚙齒動物、牛和人的骨髓瘤細(xì)胞。從方便和可得性考慮，最常用的是大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。
從注射了靶抗原的哺乳動物來獲得適當(dāng)淋巴細(xì)胞的技術(shù)是熟知的。一般說來，如果需要人的細(xì)胞，可使用外周血淋巴細(xì)胞(PBL);如果需要非人類哺乳動物細(xì)胞，則使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。給宿主哺乳動物反復(fù)注射純化的抗原，并使該哺乳動物產(chǎn)生所需的抗體生成細(xì)胞，然后收集這些細(xì)胞與持久存活的細(xì)胞系進(jìn)行融合。細(xì)胞融合技術(shù)也是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的，一般包括將細(xì)胞與融合劑如聚乙二醇混合。用標(biāo)準(zhǔn)方法如HAT選擇法選擇雜交瘤細(xì)胞。使用Western吸印法、ELISA法、RIA法等標(biāo)準(zhǔn)的免疫分析法分析這些雜交瘤的培養(yǎng)基以選擇出分泌所需抗體的雜交瘤。使用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)(Tijssen，PracticeandTheoryofEnzymeImmun-oassays，Elsevier，Amsterdam，1985)由培養(yǎng)基中回收抗體。在應(yīng)用任一種上述技術(shù)時(shí)有許多文獻(xiàn)可供參考(Kohleretal.，HybridomaTechniques，ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，1980;Tijssen，PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays，Elsevier，
Amsterdam，1985;Campbell，MonoclonalAntibodyTechnology，Elsevier，Amsterdam，1984;Hurrell，MonoclonalHybridomaAntibodiesTechniquesandApplications，CRCPress，BocaRaton，F(xiàn)L，1982;等等)。
抗體片段的應(yīng)用和產(chǎn)生也是熟知的。如Fab片段(Tijssen，PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays，Elsevier，Amsterdam，1985)和Fv片段(Hochmanetal.，Biochemistry，12∶1130-1135，1973;Sharonetal.，Biochemistry，15∶1591-1594，1976;Ehrlichetal.，美國專利4，355，023)以及抗體半分子(Auditore-Hargreaves，美國專利4，470，925)。此外，可借助已知技術(shù)用本發(fā)明的這些化合物和組合物構(gòu)建雙特異性抗體，如通過雜交瘤的進(jìn)一步融合(即形成所謂四重雜交瘤)(quadromas))(Reading，美國專利4，474，493)或半分子的化學(xué)再連接(Brennanetal.，Science，229∶81-83，1985)。
本發(fā)明的雜交瘤和單克隆抗體是針對用重組方法產(chǎn)生的成熟人IL-4的糖基化或非糖基化形式而產(chǎn)生的。一般說來，人IL-4的非糖基化形式是在大腸桿菌(E.coli)中產(chǎn)生的，而糖基化形式是在CVl或COS猴細(xì)胞、小鼠L細(xì)胞等哺乳動物細(xì)胞宿主中產(chǎn)生的。用重組方法產(chǎn)生的成熟人IL-4是通過用標(biāo)準(zhǔn)方法將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞而產(chǎn)生的(Maniatisetal.，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，1982;OkayamaandBerg，Mol.Cell.Biol.，2∶161-171，1982和3∶280-289，1983;Hamer，GeneticEngineering，2∶83-100，1980;美國專利4，599，308;Kaufmanetal.，Mol.Cell.Biol.，2∶1304-1319，1982;等等)。
一旦知道或可以得到編碼所需蛋白質(zhì)的核苷酸順序，即使用本領(lǐng)域熟知的方法構(gòu)建細(xì)菌或哺乳動物表達(dá)載體。如DeBoer公開了用于細(xì)菌表達(dá)載體的一些啟動子(見美國專利4，511，433);Goeddel等人(美國專利4，601，980)和Riggs(美國專利4，431，739)公開了用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)哺乳動物蛋白質(zhì)的方法;Riggs(上述文獻(xiàn))、Ferretti等人(Proc.Natl.Acad.Sci.，83∶599-603，1986)、Sproat等人(NucleicAcidsRes.，13∶2959-2977，1985)和Mullenbach等人(J.Biol.Chem.，261∶719-722，1986)公開了構(gòu)建在細(xì)菌中表達(dá)的合成基因的方法。因此，上述文獻(xiàn)均列為本文參考文獻(xiàn)。Yokota等人(文獻(xiàn)同上)公開了成熟人IL-4的氨基酸順序;Yokota等人(文獻(xiàn)同上)所描述的、由pcD載體攜帶的編碼人IL-4的cDNA寄存在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD)，登記號為67029。許多細(xì)菌表達(dá)載體和宿主細(xì)胞可以由市場上購得或通過ATCC得到。用以免疫宿主動物的人IL-4最好是從已用上述pcD載體短暫轉(zhuǎn)染的COS、CVl蛐∈驦細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中分離。
還可用重組方法制得本發(fā)明雜交瘤特有的抗體和抗體片段，特別是ICl.llB4.6，即提取信使RNA，構(gòu)建cDNA文庫，篩選編碼抗體分子片段的克隆(Walletal.，NucleicAcidsRes.，5∶3113-3128，1978;Zalsutetal.，NucleicAcidsResearch，8∶3591-3601，1980;Cabillyetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，81∶3273-3277，1984;Bossetal.，NucleicAcidsResearch，12∶3791-3806，1984;Amsteretal.，NucleicAcidsResearch，8∶2055-2065，1980;Mooreetal.，美國專利4，642，234)。特別是可用這些技術(shù)生產(chǎn)種間單克隆抗體，其中一個(gè)種的抗體結(jié)合，區(qū)與另一個(gè)種的抗體非結(jié)合區(qū)相結(jié)合(Liuetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，84∶3439-3443，1987)。
用單克隆抗體進(jìn)行純化和測定是熟知的，如用于親合層析(AffinityChromatography∶PrinciplesandMethods，Pharmacia，Orebro，Sweden，1979;Secheretal.，Nature，285∶446-450，1980和美國專利4，423，147;歐洲專利申請0190711(1986年8月13日))和免疫分析技術(shù)(Tijssen，文獻(xiàn)同上;美國專利4，486，530;Burnette，文獻(xiàn)同上)。人IL-4可用親合層析法由樣品如已用人IL-4表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中提取來進(jìn)行純化。本文將這樣一種純化方法稱為免疫純化法。該方法一般包括使人IL-4特異性單克隆抗體共價(jià)連接到置于柱內(nèi)或容器內(nèi)的固相載體(本文稱為免疫吸附劑)上，然后使樣品通過。樣品中的人IL-4優(yōu)先與已連接的單克隆抗體的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，而樣品中的其余材料則從柱或容器中洗出。然后用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如低PH、高鹽濃度等方法從免疫吸附劑上洗脫出人IL-4。
“兩位點(diǎn)”或“夾心”免疫分析法(美國專利4，486，530，該專利列為本文參考文獻(xiàn))是本發(fā)明優(yōu)選的免疫分析法。這些方法包括使用兩組不同的抗IL-4抗體，其中至少有一組含有本發(fā)明的單克隆抗體，如由ICl·llB4.6產(chǎn)生的單克隆抗體。將其中一組的抗體連接在固相載體表面。然后使連接的抗體與可能含有人IL-4的樣品接觸。IL-4分子即結(jié)合到連接的抗體上。接著向結(jié)合的IL-4加入第二組抗體，這些抗體與一個(gè)或多個(gè)與結(jié)合了第一組抗體的抗原決定簇不同的抗原決定簇相結(jié)合。然后用與第二組抗體有關(guān)的間接或直接信號產(chǎn)生方法來檢測IL-4。例如，抗體可直接與信號產(chǎn)生部分如酶、稀土金屬螯合劑或有機(jī)染料相結(jié)合，也可通過附加抗體或高親合性復(fù)合物(如抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物)間接與一個(gè)或多個(gè)信號產(chǎn)生部分連接。將樣品產(chǎn)生的信號與含有已知濃度人IL-4的，IL-4標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的信號相比較，定量測定IL-4的濃度。
本發(fā)明包括用于免疫分析特別是夾心法免疫分析的試劑盒。這種試劑盒包括(1)一固相載體;(2)單克隆的并且能夠與人IL-4的第一抗原決定簇結(jié)合的第一抗體;(3)選自能與人IL-4的第二抗原決定簇結(jié)合的單克隆抗體和對人IL-4特異的多克隆抗體(本文稱之為“多克隆抗體組合物”)的第二抗體;(4)一種與這三種抗體之一相聯(lián)的信號產(chǎn)生體。依據(jù)特定的實(shí)施方案，試劑盒可包含由三種抗IL-4抗體中選出的兩種，或者是對第一抗原決定簇特異的單克隆抗體和對第二抗原決定簇特異的單克隆抗體，或者是對第一或第二抗原決定簇特異的單克隆抗體和一種多克隆抗體組合物?？贵w可以是溶液或凍干形式。使用試劑盒時(shí)可將其中一組抗體加于固相載體的表面，也可以預(yù)先連接到固相載體上。信號產(chǎn)生體可以與兩種類型抗體中的一種預(yù)先聯(lián)接，也可能需要在使用前與緩沖液、抗體-酶結(jié)合物、酶底物等一種或多種組分結(jié)合。許多類型的信號產(chǎn)生體都可加以利用并可構(gòu)成試劑盒的一個(gè)或多個(gè)組分。Tijssen(文獻(xiàn)同上)描述了各種信號產(chǎn)生體。本發(fā)明的試劑盒還可包括其他試劑，如用于降低對固相表面的非特異性結(jié)合的阻斷劑、洗滌劑和酶底物等。固相表面可以是微量滴定板、微球體等形式，可由適于固定蛋白質(zhì)的聚氯乙烯、聚苯乙烯等材料制成。本文將這些具有固相表面的材料稱為“載體”。催饣虺噬鐨緯傻拿缸詈檬切藕挪宓囊桓鱟櫸幀６庵置缸詈醚∽雜詮躉錈?、碱谢涀酸酯秘?fù)挺 半乳糖苷酶。這些酶的底物和反應(yīng)條件是本領(lǐng)域中熟知的(Tijssen，文獻(xiàn)同上)。
也可使用本發(fā)明的組合物作為針對IL-4相關(guān)疾病的醫(yī)藥組合物的成分?？墒褂冒哂屑幼饔玫膯慰寺】贵w(或其結(jié)合片段)的醫(yī)藥組合物來增強(qiáng)IL-4的活性。也可使用包含具有阻斷作用或拮抗作用的單克隆抗體(或其結(jié)合片段)的組合物來抑制IL-4的活性。這種組合物含有至少一種治療量的本發(fā)明單克隆抗體(或其結(jié)合片段)和一種醫(yī)藥上適用的載體。醫(yī)藥載體可以是任何適于向病人體內(nèi)釋放本發(fā)明組合物的可配伍的無毒物質(zhì)。載體中可包含無菌水、醇、脂肪、蠟和惰性固體。還可向醫(yī)藥組合物中摻入醫(yī)藥上可接受的助劑(緩沖劑、分散劑)。一般說來，適于胃腸道外給藥的藥物組合物是熟知的(Remington′sPharmaceuticalScience，15thEd.，MackPublishingCompany，Easton，PA，1980)。另外，可借助可植入的藥物釋放系統(tǒng)將本發(fā)明的組合物引入病人體內(nèi)(Urquhartetal.，Ann.Rev.Pharmacol.，Toxicol.，24∶199-236，1984)。
實(shí)施例下列實(shí)施例旨在舉例闡明本發(fā)明。載體和宿主的選擇以及試劑的濃度、溫度和其他變量的值只是舉例說明本發(fā)明的應(yīng)用，而不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例I.用pcD-人IL-4轉(zhuǎn)染COS7猴細(xì)胞以產(chǎn)生糖基化的人IL-4表達(dá)載體pcD-人IL-4和宿主細(xì)胞COS7得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，登記號分別為67029和CRL1651。擴(kuò)增pcD-人IL-4克隆，純化質(zhì)粒DNA，然后用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染COS7。將大約1×106個(gè)COS7細(xì)胞接種于含有Dulbecco改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DME)、10%胎牛血清和4mML-谷氨酰胺的100mm組織培養(yǎng)皿上。接種約24小時(shí)后，由平皿中吸出培養(yǎng)基并用緩沖的(50mM Tris)無血清DME將細(xì)胞洗兩次。向各平皿內(nèi)加入4ml緩沖的無血清DME(含4mML-谷氨酰胺)、80μl DEAE-葡聚糖和5μg pcD-人IL-4DNA。細(xì)胞在該混合物中于30℃保溫4小時(shí)，然后吸出混合物并用緩沖的無血清DME將細(xì)胞洗滌一次。洗滌后向各平皿內(nèi)加入5ml含4mML-谷氨酰胺、100μM氯喹和2%胎牛血清的DME，并將細(xì)胞保溫3小時(shí)，然后用緩沖的無血清DME洗兩次。接著，加入5ml含4mML-谷氨酰胺和4%胎牛血清的DME，并將細(xì)胞于37℃保溫24小時(shí)。然后將細(xì)胞用DME或PBS洗1-3次，加入5ml無血清DME(含4mML-谷氨酰胺)，細(xì)胞于37℃保溫，5天后收集培養(yǎng)上清液。
實(shí)施例Ⅱ.由COS7轉(zhuǎn)染上清液中純化糖基化的人IL-4A.用于純化的生物學(xué)檢測法在由實(shí)施例1中制得的上清液進(jìn)行純化時(shí)，用T細(xì)胞生長因子(TCGF)活性來檢測人IL-4。已有文獻(xiàn)述及幾種檢測TCGF活性的標(biāo)準(zhǔn)檢測法(Devos et al.，Nucleic Acids Research，11∶4307-4323，1983;Thurman et al.，J.Biol.Response Modifiers，5∶85-107，1986;Robert-Guroff et al.，Chapterg in Guroff，Ed.Growth and Maturation Factors，John Wiley，New York，1984)。TCGF檢測法一般是基于一種因子促進(jìn)外周T淋巴細(xì)胞或IL-2依賴性T細(xì)胞系增殖的能力而建立的(Gillis et al.，J.Immunol.，120∶2027，1978)?？墒褂秒皹?biāo)記的胸苷摻入或比色法等標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來測定細(xì)胞增殖(Mosmann，J.Immunol.Meth.，65∶55-63，1983)。按下述步驟檢測人IL-4的TCGF活性取健康供血者的血液置于加有肝素的試管內(nèi)，在Ficoll-Hypaque上鋪層，如在15ml離心管內(nèi)每3ml Ficoll-Hypaque加5ml血液。以3000×g離心20分鐘后，吸出界面上的細(xì)胞，用含有RPMI 1640(其中含有10%胎牛血清、50μM2-巰基乙醇、20μg/ml植物凝集素(PHA)和重組人IL-2)的生長培養(yǎng)基稀釋。37℃下保溫5-10天后，洗滌PHA刺激的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)并用于2天比色分析(Mossman，文獻(xiàn)同上)。利用上述生長培養(yǎng)基在96孔微量滴定板中，對IL-4標(biāo)準(zhǔn)品(pcD-人IL-4轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞的上清液)或待測組分進(jìn)行兩倍逐級稀釋，使終體積為50μl/孔。各孔內(nèi)加入50μl PHA刺激的PBL(濃度約4-8×106個(gè)細(xì)胞/ml)，將滴定板于37℃保溫2天。然后按Mosmann的方法(文獻(xiàn)同上)測定細(xì)胞生長。
這里所用的一個(gè)單位是一個(gè)孔(0.1ml)中，在48小時(shí)內(nèi)刺激2×104個(gè)PHA刺激的PBL達(dá)到50%最大增殖的因子的量。
B、純化依次應(yīng)用陽離子交換層析、凝膠過濾和反相高壓液相層析進(jìn)行純化。
離心除去COS-7細(xì)胞，將上清液經(jīng)超濾濃縮約10倍并保存于-80℃待進(jìn)一步處理。通過檢測IL-4刺激植物凝集素誘導(dǎo)的人外周血淋巴細(xì)胞增殖的能力，即通過用上述標(biāo)準(zhǔn)檢測法檢測TCGF活性，來測定該蛋白的效價(jià)。將TCGF活性約為104-106單位/ml、蛋白質(zhì)含量約為15-20mg/ml的濃縮COS-7上清液對50mM HEPES鈉(PH7.0)透析24小時(shí)(此間更換兩次液體，每次均為濃縮物體積的約10-15倍)。將透析液加至用50mM HEPES鈉(pH7.0)預(yù)平衡的S-Sepharose柱上(1×2.5cm)(流速0.2ml/分)。用15倍柱體積的平衡緩沖液洗柱，然后用20倍柱體積的線性氯化鈉梯度(0至0.5M氯化鈉、50mM HEPES鈉，pH7.0)洗脫。用5倍柱體積的50mM HEPES鈉、0.5MNaCl(pH7.0)常液終止洗脫。分別以1.5ml和1.8ml為1份分兩批收集各組分。發(fā)現(xiàn)兩次層析均在300mM和500mM氯化鈉濃度之間洗脫出IL-4效價(jià)。
合并從S-Sepharose柱洗脫出的含IL-4效價(jià)組分，總體積分別為9.0和10.8ml。用AmiconYM5膜(截留分子量5000)經(jīng)超濾將兩者都濃縮到1.9ml。由該步驟回收的蛋白質(zhì)約有80%。將濃縮的IL-4溶液加到用50mMHEPES、0.4MNaCl(pH7.0)預(yù)平衡的SephadexG-100柱(1.1×58cm)上，并用同一緩沖液以0.15ml/分的流速洗脫。總共收集50份(1.0ml/份)并分析IL-4效價(jià)。在表觀分子量為22，000道爾頓處觀察到一生物活性峰。用牛血清白蛋白(65，000道爾頓)、碳酸酐酶(30，000道爾頓)和細(xì)胞色素C(11，700道爾頓)標(biāo)定SephadexG-100柱，以測定表觀分子量。
將從Sephadex G-100柱洗脫出的含IL-4活性組分真空濃縮3-4倍，并注入Vydac C-4防護(hù)柱(4.6×20mm)。在35℃柱溫下，以1.0ml/分的流速在15分鐘內(nèi)產(chǎn)生0至72%(V/V)乙腈(溶于0.1%(V/V)三氟乙酸(TFA))線性梯度。于214nm處檢測所得的三個(gè)峰，其保留時(shí)間分別為7.82和8.7分鐘(分別為圖2中峰1、2和3)。從峰2(洗脫時(shí)間8.2分鐘)中取40μl樣品凍干并再溶解于含10%胎牛血清的基本必需培養(yǎng)基中。該溶液顯示有陽性TCGF反應(yīng)。從峰2中取300μl等分樣品蒸發(fā)至干并重新溶解于200μl 0.1%(W/V)十二烷基硫酸鈉(SDS)中。用200μl1%(V/V)TFA稀釋2μl樣品并再次層析。該樣品的HPLC證明在215nm處有一單峰。測得峰2物質(zhì)的活性約為7×108單位/mg。
實(shí)施例Ⅲ.在大腸桿菌中生產(chǎn)非糖基化的人IL-4用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Maniatisetal.，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryNewYork，1982)構(gòu)建表示為TRPCll的大腸桿菌表達(dá)載體。
將合成的相符RBS片段連接到ClaⅠ連接子(ATGCAT)上并將所得片段克隆到ClaⅠ限制的pMTllhc(已被預(yù)先修飾而含有ClaⅠ位點(diǎn))中，從而構(gòu)建出TRPCll載體。pMTllhc為pBR322的小的(2.3千堿基)、高拷貝AMPR、TETS衍生物，它攜有πVX質(zhì)粒(Maniatis等，文獻(xiàn)同上)的EcoRⅠ-HindⅢ多連接子區(qū)。用EcoRⅠ和BamHⅠ限制pMT11hc、填平所得粘性末端并與ClaⅠ連接子(CATCGATG)連接，從而恢復(fù)EcoRⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)，并用ClaⅠ位點(diǎn)置換SmaⅠ位點(diǎn)，這樣，pMTllhc就被修飾而含有ClaⅠ位點(diǎn)。
TRPCll構(gòu)建中的一個(gè)轉(zhuǎn)化體具有鄰接ClaⅠ位點(diǎn)的串聯(lián)RBS順序。用PstⅠ消化該質(zhì)粒，用Bal31核酸酶處理，用EcoRⅠ限制，在所有四種三磷酸脫氧核苷酸存在下用T4DNA聚合酶處理，從而除去其中一個(gè)ClaⅠ位點(diǎn)和第二個(gè)RBS順序拷貝的一部分。用聚丙烯酰胺凝膠電泳法回收所得到的30-40bp片段，并克隆到SmaⅠ限制的PUC12中。然后將衍生自pKC101(Nichols et al.，in Methods in Enzymology，101155，Academic Press，N.Y.1983)的攜帶大腸桿菌trpP的248bp EcoRⅠ片段克隆到EcoRⅠ位點(diǎn)中，即完成TRPCll的構(gòu)建(見圖1)。
使用TRPCll作為人IL-4cDNA的載體。首先用ClaⅠ和BamHⅠ消化，純化后在標(biāo)準(zhǔn)連接溶液中將其與pcD-125(寄存于ATCC，登記號為67029)的EcoRV/BamHⅠ片段混合。標(biāo)準(zhǔn)連接溶液中含有0.1μM下列合成連接子5′-CGATGCACAAGTGCGAT-3′TACGTGTTCACGCTA
使用標(biāo)準(zhǔn)的氯化鈣法直接用連接溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌AB1899，增殖后鋪平板。用標(biāo)記的寡核苷酸探針選擇含IL-4cDNA插入片段的菌落。在L-培養(yǎng)液中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，使其表達(dá)IL-4。
實(shí)施例Ⅳ.由大腸桿菌產(chǎn)生的聚集體中純化非糖基化的人IL-4培養(yǎng)1升大腸桿菌AB1899(lon-)的培養(yǎng)物(得自Yale University E.coli Genetics Center，New Haven，CT)至OD560＝2(約為1.6×109細(xì)胞/ml)。于4℃下以4500×g離心15分鐘收集細(xì)胞。將沉淀重新懸浮于30ml含有50mM NaCl、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)和0.1mM苯基甲基硫基氟(PMSF)的50mM Tris緩沖液(pH8.0)中。純化前加入EDTA和PMSF旨在抑制可能降解人IL-4的蛋白酶活性。接著用超聲波處理細(xì)胞(70瓦50次脈沖(50%))，在4℃下以25，000×g離心15分鐘。將沉淀物溶于十二烷基硫酸鈉后進(jìn)行電泳分離，用考馬斯藍(lán)染色后將凝膠條帶圖形與陰性對照作比較，表明上述沉淀物的主要蛋白質(zhì)組分是IL-4。
除去上清液后，將沉淀物重新懸浮于含有5M鹽酸胍、2mM谷胱甘肽(還原型)和0.2mM谷胱甘肽(氧化型)的Tris緩沖液(50mMTris、50mMNaCl、1mMEDTA、0.1mMPMSF，pH8.0;每克沉淀物加9ml)中。室溫下放置約1小時(shí)后，用含有2mM谷胱甘肽(還原型)和0.2mM谷胱甘肽(氧化型)的Tris緩沖液(pH8.0)將溶液稀釋9倍。在稀釋、透析或濃縮步驟中如果形成沉淀，則在進(jìn)一步處理之前離心除去這些沉淀物。然后將全部溶液對3升磷酸鹽緩沖液過夜透析3次。用AmiconYM5超濾膜濃縮透析液(即保留在透析袋內(nèi)的物質(zhì))(達(dá)到終濃度8mg/ml)，并進(jìn)行凝膠過濾層析(柱P30(BioRad)、1.5×90cm;洗脫緩沖液為PBS;流速8ml/小時(shí))。每隔15分鐘收集一份。合并第23-27份并用反相HPLC法進(jìn)一步分析。分析結(jié)果表明合并的各管含有95%純?nèi)薎L-4。1升培養(yǎng)物(OD560＝2)所得人IL-4產(chǎn)率為2mg，比活性為5×107單位/mg。
實(shí)施例Ⅴ.雜交瘤ICl·llb4.6的產(chǎn)生取雄性Lewis大鼠腹腔內(nèi)(i.p.)注射用1ml完全弗氏佐劑(CFA)乳化的1ml人IL-4溶液。人IL-4溶液由濃度為14μg/ml溶于10mM Tris-HCl、0.5MNaCl(pH7.4)中的人IL-4組成。人IL-4是依照實(shí)施例Ⅰ和Ⅱ產(chǎn)生的，其比活性為2×107單位/mg。首次免疫兩周后，大鼠腹腔內(nèi)再次注射用1ml CFA乳化的1ml人IL-4溶液。第2次注射3個(gè)月后，給大鼠靜脈注射1ml人IL-4溶液(15μg)作加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)注射4天后處死大鼠，收集血液，分離脾臟作細(xì)胞融合。利用聚乙二醇(PEG)以1∶1的比例使脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞P3X63-Ag8.653(ATCCCRL 1580)融合。將細(xì)胞懸浮液(懸浮于HAT培養(yǎng)基中，3.5×105細(xì)胞/ml)分置于40個(gè)96孔微量滴定板中。10天后測試雜交瘤上清液與直接固定于微量滴定板上的人IL-4結(jié)合的能力(間接ELISA)或與結(jié)合于固定化免抗人IL-4的多克隆IgG部分的人IL-4結(jié)合的能力。用標(biāo)準(zhǔn)方法以過氧化物酶結(jié)合的羊抗大鼠免疫球蛋白來檢測已結(jié)合的抗體。利用極限稀釋法克隆可分泌與IL-4反應(yīng)的抗體的雜交瘤。ICl·llB4.6就是一種用這些方法篩選的雜交瘤。經(jīng)測定，由ICl·llB4.6產(chǎn)生的抗體為IgG2a同型抗體?？捎脴?biāo)準(zhǔn)的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)保存和培養(yǎng)雜交瘤(如在含10%DMSO的培養(yǎng)基中于-70℃下保存并在含有10%胎牛血清并添加了1mM谷氨酰胺和50mM2-巰基乙醇的RPMI1640中培養(yǎng))。
實(shí)施例Ⅵ.雜交瘤MP4.25D2.11的產(chǎn)生基本上按照實(shí)施例Ⅴ的椒ú詠渙鍪占鋝⑸稈∷塹撓腥薎L-4特異性的抗體。然后用標(biāo)準(zhǔn)的體外檢測法，根據(jù)其抗體阻斷人IL-4的TCGF活性的能力，進(jìn)一步篩選所收集的雜交瘤(如實(shí)施例Ⅱ所述)。從所鑒定的幾種有阻斷作用的單克隆抗體中選擇出由MP4.25D2.11產(chǎn)生的抗體，該抗體具有最高效價(jià)的阻斷活性。由MP4.25D2.11產(chǎn)生的抗體被確定為大鼠IgG1。
實(shí)施例Ⅶ.人IL-4的夾心檢測法于37℃下使100μl兔多克隆抗人IL-4抗體(在蛋白A親合層析柱上純化的在PBS中的溶液，濃度為10μg/ml)在96孔聚氯乙烯微量滴定板的各孔表面上吸附2小時(shí)(PBS的組成為8.0gNaCl、0.2gKH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O和0.2gKCl，加蒸餾水至1升，pH為7.4)。用PBS-吐溫(完全按PBS制備，此外每升加0.5ml吐溫20)洗滴定板以除去未結(jié)合的抗體，然后以逐步降低IL-4濃度的順序，在兩排孔內(nèi)(每排12個(gè)孔)加入雙份作逐級稀釋(用PBS)的純化的大腸桿菌產(chǎn)生的人IL-4，其濃度范圍為1000pg/ml至15pg/ml。在其余孔內(nèi)加入下列樣品(1)得自人T細(xì)胞克隆如ClLy1+2-/9(ATCC CRL 8179)的培養(yǎng)上清液;(2)用pcD-人IL-4轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的培養(yǎng)上清液;(3)含有不同濃度的COS-7產(chǎn)生的純IL-4的人血清;(4)含有人IL-1α、IL-2、IL-3、IFN-γ、IFN-α2b、GM-CSF和BSF-2的樣品。所有樣品均于室溫下保溫2小時(shí)。用PBS-吐溫洗滌后，向各孔內(nèi)加入ICl·llB4.6的1∶10稀釋的培養(yǎng)上清液(100μl/孔)，于室溫下保溫1小時(shí)。保溫后洗滴定板，加入過氧化物酶結(jié)合的羊抗大鼠抗體，于室溫下保溫1小時(shí)，然后再洗滴定板。接著加入過氧化物酶底物ABTS，并通過檢測各孔內(nèi)光密度來測定人IL-4濃度。結(jié)果表明，該檢測法可以檢測出人血清中濃度低至50pg/ml的哺乳動物產(chǎn)生的人IL-4，但該檢測法檢測不到任何一種上面所列出的淋巴激活素。
下列表A和圖3A顯示11B4F(ab)、IgG和粗上清液(未純化的抗體)抑制125I-HuIL-4與Daudi細(xì)胞結(jié)合的能力。所有三種制劑抑制結(jié)合的最大程度都達(dá)70%。對照組單克隆抗體GL117 F(ab)、IgG和粗上清液不影響結(jié)合(對照抗體是針對同一個(gè)體基因型的無關(guān)抗原的抗體)。純化的11B4IgG或F(ab)產(chǎn)生50%結(jié)合抑制作用所需的濃度范圍為10-100ng/ml。
下列表B和圖3B顯示在該檢測法中25D2.11F(ab)抑制結(jié)合的能力。該制劑產(chǎn)生90%抑制，并在濃度為10-15ng/ml時(shí)產(chǎn)生50%最大作用。
圖3A和3B中X軸為濃度(ng/ml)(對數(shù)標(biāo)度)，Y軸為抑制百分比。
在這些實(shí)驗(yàn)中，HuIL-4是用中國倉鼠卵細(xì)胞制得的，在下列兩表中表示為CHO-HuIL-4。
表AllB4對與Daudi細(xì)胞結(jié)合的125I-CHO-HuIL-4的中和作用結(jié)合結(jié)合樣品ng/ml百分比樣品ng/ml百分比llB4F(ab)128.1llB4IgG101025.341011.710054.2810071.01100067.9450073.661000064.56100069.54llB4上清液100GL117F(ab)1010045.1102.4100067.91000250074.310003.7500073.6100005.8GL117IgG10GL117上清液107.51001004.71001.8100001000025005.510000050000表B25D2.11F(ab)片段對與Daudi細(xì)胞結(jié)合的125I-CHO-HuIL-4的中和作用ng/ml抑制百分比ng/ml抑制百分比3000901554.11500901030.751000847.510.560773.003067.4
本發(fā)明前述實(shí)施方案旨在描述本發(fā)明。它們并不包羅一切或把本發(fā)明限定于所公開的具體內(nèi)容，而且顯然可以依據(jù)上述技術(shù)方案作出許多修改和變化。選擇和描述這些實(shí)施方案是為了更好地解釋本發(fā)明的原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使本領(lǐng)域其他技術(shù)人員能夠更好地依據(jù)各種實(shí)施方案來利用本發(fā)明，并根據(jù)需要和具體要求作出各種修改。本發(fā)明的范圍是由所附的權(quán)利要求書來限定的。
申請人已將雜交瘤ICl·llB4.6和MP4.25D2.11寄存在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD，USA，ATCC)，登記號分別是HB9550和HB9809。按照《布達(dá)佩斯條約》和ATCC的“用于專利目的的培養(yǎng)物保藏”協(xié)議作了上述保藏。這可確保美國專利和商標(biāo)局局長可依照35USC122和37CFR1.14而得到保藏物，公眾則可在授予美國專利后得到保藏物，這要求保藏物是存活的。保藏系的可得性不應(yīng)被看作是允許在違背任何政府當(dāng)局根據(jù)其專利法而授予的權(quán)利的情況下實(shí)施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種對人白細(xì)胞介素-4特異的單克隆抗體。
2.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其特征在于，它對非糖基化人白細(xì)胞介素-4是特異的。
3.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其特征在于，它對糖基化人白細(xì)胞介素-4是特異的。
4.權(quán)利要求3的單克隆抗體，其特征在于，它是由雜交瘤ICl·llB4.6產(chǎn)生的。
5.一種權(quán)利要求1的單克隆抗體，其特征在于，它能夠阻斷人白細(xì)胞介素-4的生物活性。
6.權(quán)利要求5的單克隆抗體，其特征在于，它是由雜交瘤MP4.25D2.11產(chǎn)生的。
7.一種能分泌對人白細(xì)胞介素-4特異的單克隆抗體的雜交瘤。
8.權(quán)利要求7的雜交瘤，其特征在于，它能夠分泌對非糖基化人白細(xì)胞介素-4特異的單克隆抗體。
9.權(quán)利要求7的雜交瘤，其特征在于，它能夠分泌對糖基化人白細(xì)胞介素-4特異的單克隆抗體。
10.一種權(quán)利要求9的雜交瘤，即ICl·llB4.6或MP4.25D2.11。
11.一種多肽，其特征在于，它包括對人白細(xì)胞介素-4特異的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)。
12.權(quán)利要求11的多肽，其特征在于，所述單克隆抗體是由雜交瘤ICl·llB4.6或雜交瘤MP4.25D2.11產(chǎn)生的。
13.一種多肽，其特征在于，它包括對人白細(xì)胞介素-4特異的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)。
14.權(quán)利要求13的多肽，其特征在于，所述單克隆抗體是由雜交瘤ICl·llB4.6或雜交瘤MP4.25D2.11產(chǎn)生的。
15.一種對人白細(xì)胞介素-4特異的結(jié)合組合物，其特征在于，它包括對人白細(xì)胞介素-4特異的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。
16.權(quán)利要求15的結(jié)合組合物，其特征在于，所述單克隆抗體是由雜交瘤ICl·llB4.6或雜交瘤MP4.25D2.11產(chǎn)生的。
17.一種檢測可能含有人白細(xì)胞介素-4的樣品中是否存在人白細(xì)胞介素-4的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟提供對人白細(xì)胞介素-4上的第一抗原決定簇特異的第一單克隆抗體;提供一種第二抗體，該抗體選自對人白細(xì)胞介素-4特異的多克隆抗體組合物和對人白細(xì)胞介素-4上第二抗原決定簇特異的第二單克隆抗體，其中第二抗原決定簇不同于第一抗原決定簇;提供一種能與第一單克隆抗體或第二抗體有效結(jié)合的信號產(chǎn)生體，所產(chǎn)生的信號強(qiáng)度或者僅與第一單克隆抗體的量有關(guān)，或者僅與第二抗體的量有關(guān);將第一單克隆抗體或第二抗體連接到載體上，形成抗體-載體結(jié)合物;使樣品與抗體-載體結(jié)合物接觸，從而使樣品中的人白細(xì)胞介素-4結(jié)合到抗體-載體結(jié)合物上;如果抗體-載體結(jié)合物包括第二抗體，使與信號產(chǎn)生體有效結(jié)合的第一單克隆抗體與結(jié)合到抗體-載體結(jié)合物上的人白細(xì)胞介素-4相接觸;或者如果抗體-載體結(jié)合物包括第一タ寺固?，使与信号产生体有效结合的翟滯抗体与结合祴晒?載體結(jié)合物上的人白細(xì)胞介素-4接觸;測定由信號產(chǎn)生體產(chǎn)生的信號。
18.權(quán)利要求17的方法，其特征在于，所述抗體-載體結(jié)合物包括所述第一單克隆抗體，所述第二抗體是所述的對人白細(xì)胞介素-4特異的多克隆抗體組合物。
19.權(quán)利要求18的方法，其特征在于，所述第一單克隆抗體是由雜交瘤ICl·llB4.6或雜交瘤MP4.25D2.11產(chǎn)生的單克隆抗體。
20.權(quán)利要求17的方法，其特征在于，所述抗體-載體結(jié)合物包括所述第二抗體，所述第二抗體是對人白細(xì)胞介素-4特異的所述多克隆抗體組合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其特征在于，所述第一單克隆抗體是由雜交瘤ICl·llB4.6或雜交瘤MP4.25D2.11產(chǎn)生的單克隆抗體。
22.一種檢測可能含有人白細(xì)胞介素-4的樣品是否存在人白細(xì)胞介素-4的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括一種對人白細(xì)胞介素-4上的第一抗原決定簇特異的第一單克隆抗體;一種第二抗體，該抗體選自對人白細(xì)胞介素-4特異的多克隆抗體組合物和對人白細(xì)胞介素-4上第二抗原決定簇特異的第二單克隆抗體，第二抗原決定簇不同于第一抗原決定簇;一種載體;一種信號產(chǎn)生體。
23.權(quán)利要求22的試劑盒，其特征在于，所述第一單克隆抗體是由雜交瘤ICl·llB4.6或雜交瘤MP4.25D2.11產(chǎn)生的單克隆抗體，所述第二抗體是對人白細(xì)胞介素-4特異的所述多克隆抗體組合物。
24.權(quán)利要求23的試劑盒，其特征在于，所述信號產(chǎn)生體包括一種與所述第一單克隆抗體有效結(jié)合的酶，該酶選自過氧化物酶、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酯酶。
25.一種從含有人白細(xì)胞介素-4的樣品中提取人白細(xì)胞介素-4的免疫純化方法，其特征在于，該方法包括使樣品通過含有對人白細(xì)胞介素-4特異的單克隆抗體的免疫吸附柱。
26.權(quán)利要求25的免疫純化方法，其特征在于，所述單克隆抗體是由雜交瘤ICl·llB4.6或雜交瘤MP4.25D2.11產(chǎn)生的。
全文摘要
本發(fā)明提供對人白細(xì)胞介素-4特異的單克隆抗體。還提供了用于檢測、測定和免疫純化人白細(xì)胞介素-4，以及阻斷人白細(xì)胞介素-4生物活性的試劑盒和方法。
文檔編號C12N15/70GK1032816SQ8810735
公開日1989年5月10日 申請日期1988年10月26日 優(yōu)先權(quán)日1987年10月26日
發(fā)明者約翰S·阿伯拉姆斯, 伊莎貝爾·克雷蒂安, 弗蘭克·D·李, 邁克爾K·皮爾斯 申請人:先靈生物技術(shù)公司