專利名稱：一種用畢赤酵母工程菌降解植物的木質(zhì)素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及構(gòu)建和應(yīng)用微生物工程菌的方法。具體是應(yīng)用微生物工程菌降解植物原料的木質(zhì)素的方法。
背景技術(shù)：
猛過(guò)氧化物酶(Manganese Peroxidase, MnP)、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(LigninPeroxidase, LiP)和漆酶(Laccase)具有共同降解木質(zhì)素的作用。植物資源不斷再生，十分豐富。植物的基本成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。其中在制造沼氣和乙醇業(yè)中有用的成分是纖維素，次之是半纖維素。前者由葡萄糖構(gòu)成，而后者由戊糖構(gòu)成。這些糖都是轉(zhuǎn)化為乙醇和沼氣的物質(zhì)。但是纖維素分子之間被木質(zhì)素鑲嵌，被鑲嵌著的纖維素不能被水解。木質(zhì)素是廣泛存在于植物體中的無(wú)定形的、分子結(jié)構(gòu)中含有氧代苯丙醇或其衍生物結(jié)構(gòu)單元的芳香性高聚物，形成纖維支架，結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定。欲利用纖維素則必須先降解木質(zhì)素。當(dāng)前用于降解木質(zhì)素的方法有物理、化學(xué)和生物的方法。物理法主要是機(jī)械粉碎法、高溫?zé)峤忸A(yù)處理以及輻射預(yù)處理等，但是物理法耗能大，并且需要特殊設(shè)備；化學(xué)法主要是酸或堿處理的方法?；瘜W(xué)處理法具有工藝簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，但是處理后的纖維素和半纖維素?fù)p失大，并且產(chǎn)生大量的酸堿廢氣物污染環(huán)境。與化學(xué)法和物理法相t匕，當(dāng)前應(yīng)用的生物法主要是應(yīng)用天然的表達(dá)分泌降解木質(zhì)素的酶的白腐真菌與植物原料作用而降解植物原料中的木質(zhì)素。應(yīng)用白腐真菌降解植物的木質(zhì)素的優(yōu)勢(shì)在于，白腐真菌具有完整的降解木質(zhì)素的酶系(錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶)，其不足之處是白腐真菌所含的錳過(guò)氧化物酶基因、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因和漆酶基因只是單拷貝，表達(dá)的酶的產(chǎn)量少，并且，白腐真菌生長(zhǎng)緩慢，降解木質(zhì)素的周期長(zhǎng)。畢赤酵母(Pichia pastoris)是常用于生產(chǎn)重組蛋白的微生物。畢赤酵母營(yíng)養(yǎng)要求低，能將表達(dá)的蛋白分泌到胞外，并且它具有組成型強(qiáng)啟動(dòng)子:三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子(PGAP)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明構(gòu)建含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌；用含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌與植物原料作用，通過(guò)工程菌分泌錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶而降解植物原料的木質(zhì)素。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:1.克隆基因:通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR或PCR技術(shù)從含錳過(guò)氧化物酶基因、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因、漆酶基因的微生物中分別克隆錳過(guò)氧化物酶基因、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因和漆酶基因。2.通過(guò)PCR擴(kuò)增或DNA序列合成而獲得構(gòu)建表達(dá)載體所需的啟動(dòng)子，重組序列，信號(hào)肽，轉(zhuǎn)錄終止子和抗 性基因表達(dá)框架的DNA序列。
3.通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體(附圖1)。4.將以上構(gòu)建的畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母。根據(jù)表達(dá)載體上的G418抗性篩選高拷貝重組子作為含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌。5.將以上構(gòu)建的含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架畢赤酵母工程菌應(yīng)用于降解植物的木質(zhì)素。本發(fā)明構(gòu)建了含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌，將這種畢赤酵母工程菌與植物原料作用，降解植物的木質(zhì)素的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)于:由于工程菌的構(gòu)建選擇了強(qiáng)的啟動(dòng)子調(diào)控基因，生產(chǎn)性能好的微生物作為工程菌構(gòu)建的對(duì)象，并且選擇高拷貝的重組子作為工程菌，所以，本發(fā)明構(gòu)建的含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌不僅具備畢赤酵母本身的營(yíng)養(yǎng)要求低、生長(zhǎng)繁殖迅速等特點(diǎn)，還具備工程菌的良好表達(dá)分泌降解木質(zhì)素的酶系(錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶)的功能，這種含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌對(duì)木質(zhì)素的降解作用強(qiáng)于當(dāng)前應(yīng)用于降解植物的木質(zhì)素的天然的表達(dá)分泌木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶和漆酶的天然的微生物。


附圖1.畢赤酵母表達(dá)載體。P.畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子；S.MFa因子信號(hào)肽；genel.錳過(guò)氧化物酶基因；gene2.木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因；gene3.漆酶基因；T.轉(zhuǎn)錄終止子序列；G418.G418基因表達(dá)框架；ColEl.大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；AMP.氨芐青霉素基因表達(dá)框架；P.pastoris rDNA.畢赤酵母的rDNA序列。附圖2.掃描電鏡拍的畢赤酵母工程菌與水稻秸桿作用4天后的水稻秸桿的照片。附圖3.掃描電鏡拍的含錳過(guò)氧化物酶基因、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因和漆酶基因的白腐真菌與水稻秸桿作用4天后的水稻秸桿的照片。附圖4.掃描電鏡拍的氨水與水稻秸桿作用4天后的水稻秸桿的照片。附圖5.掃描電鏡拍的畢赤酵母與水稻秸桿作用4天后的水稻秸桿的照片。附圖6.掃描電鏡拍的水稻秸桿的照片。
具體實(shí)施例方式下面采用非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例一1.1獲得酶基因及構(gòu)建表達(dá)載體所需的相關(guān)原件(1)PCR擴(kuò)增畢赤酵母的磷酸甘油醛脫氫的啟動(dòng)子序列用蝸牛酶裂解畢赤酵母的細(xì)胞壁，提取畢赤酵母基因組DNA，應(yīng)用上游引物(5，TTTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGT3 )和下游引物(5 GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTT3 )進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是其三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子序列。(2) PCR擴(kuò)增枯草芽孢桿菌的漆酶基因用蝸牛酶裂解枯草芽孢桿菌的細(xì)胞壁，提取枯草芽孢桿菌基因組DNA，應(yīng)用上游引物(5’ AACCTAGGATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC3’ )和下游引物(5 AAGCGGCCGCCTATTTATGGGGATCAGTTATA3’ )進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是枯草芽孢桿菌的漆酶基因序列。(3)應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增白腐真菌的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因和錳過(guò)氧化物酶基因應(yīng)用RNA提取試劑盒提取白腐真菌(白腐真菌模式菌種-黃孢原毛平革菌)的總RNA,以總RNA為模板，應(yīng)用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以上述合成的cDNA為模板，應(yīng)用引物 1(5’ AAGAATTCGCCACCTGTTCCAACGGCAAGACCGTC3> )和引物 2(5’ AAGCGGCCGCCTAAGCACCCGGAGGCGGAGGGATGCG3’ )進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因序列；以上述合成的cDNA為模板,應(yīng)用引物 3 (5 ’ CCGAATTCGCGGTCTGCCCCGACGGCACCCGCGTCA3 ’)和引物 4 (5 ’ TTGCGGCCGCCTATGCGGGACCGTTGAACTGGACACC3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的錳過(guò)氧化物酶基因序列(4)應(yīng)用PCR擴(kuò)增畢赤酵母的rDNA序列提取畢赤酵母基因組DNA，以基因組DNA為模板，應(yīng)用上游引物(5’ CCGGTACCaggttcacctacggaaaccttg3，)和下游引物(5，CCTTCGAAtgtctcaaagattaagccatgc3’ )進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是畢赤酵母基因組中的rDNA序列。說(shuō)明:①畢赤酵母和枯草芽孢桿菌基因組DNA提取方法:將菌細(xì)胞加于9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L山梨醇溶解)于30°C振搖30分鐘，然后按照常規(guī)的細(xì)菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA。②引物5’端的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基).
(5)合成如下氨芐青霉素抗性基因序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒(méi)有下劃線的是氨芐青霉素抗性基因序列]5， AAGGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCAT AGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTG CAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAG GGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAG CTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTG TCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCC CCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGC A GTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTT TCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTG CCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAAC GTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGC AAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAAGCTTGG3>(6)合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒(méi)有下劃線的是G418抗性基因序列]CCATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCAA⑦合成MFa因子信號(hào)肽[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒(méi)有下劃線的是α因子信號(hào)肽序列]:TTGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTGG⑧合成轉(zhuǎn)錄終止子序 列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)出個(gè)堿基)，沒(méi)有下劃線的是轉(zhuǎn)錄終止子序列]:TTACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTT TATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATC AGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTT CTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATC GATGG1.2構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體(I)由專業(yè)的DNA序列合成公式合成大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的兩條堿基互補(bǔ)的雙鏈，并且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過(guò)T4DNA連接酶的作用使其環(huán)化，形成DNA克隆載體。將這克隆載體命名為H)。(2)通過(guò)DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，將畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列、α因子信號(hào)肽DNA序列、白腐真菌的錳過(guò)氧化物酶基因序列和轉(zhuǎn)錄終止子序列依次重組于H)載體的多克隆位點(diǎn)。此載體稱為roi。(3)通過(guò)DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，將畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列、α因子信號(hào)肽DNA序列、白腐真菌的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因序列和轉(zhuǎn)錄終止子序列依次重組于ro載體的多克隆位點(diǎn)。此載體稱為ro2。(4)通過(guò)DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，將畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列、α因子信號(hào)肽DNA序列、枯草芽孢桿菌的漆酶基因序列和轉(zhuǎn)錄終止子序列依次重組于H)載體的多克隆位點(diǎn)。此載體稱為T(mén)O3。(5)通過(guò)DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，切取PD2和PD3載體的表達(dá)框架，并將切下的表達(dá)框架依次插入于roi的多克隆位點(diǎn)。此載體稱為roi23。(6)通過(guò)DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用依次將氨芐青霉素基因表達(dá)框架、G418基因表達(dá)框架和畢赤酵母的rDNA序列重組于PD123載體的多克隆位點(diǎn)，從而完成表達(dá)載體的構(gòu)建(附圖1)。1.3構(gòu)建畢赤酵母工程菌用常規(guī)的氯化鈣方法制備大腸桿菌感受態(tài)，將以上構(gòu)建的表達(dá)載體(附圖1)轉(zhuǎn)化于大腸桿菌，提取質(zhì)粒(載體)DNA。按照常規(guī)方法制備畢赤酵母感受態(tài)，用常規(guī)的電轉(zhuǎn)化方法分別將其表達(dá)載體(附圖1)轉(zhuǎn)化畢赤酵母，將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化作用的畢赤酵母細(xì)胞涂布于含G418濃度為SOOOyg/ml的YH)瓊脂(2 %蛋白胨，I %酵母提取物，2 %葡萄糖，1.5 %瓊脂粉)平板，30°C培養(yǎng)3天。將在含G418濃度為700 μ g/ml的YPD瓊脂平板上生長(zhǎng)的克隆轉(zhuǎn)種于G418濃度為20000 μ g/ml的YPD瓊脂平板上，30°C培養(yǎng)3天。挑選能在G418濃度為20000 μ g/ml的YPD瓊脂平板上生長(zhǎng)的克隆進(jìn)行搖瓶發(fā)酵表達(dá)，根據(jù)SDS-PAGE電泳初步分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)。用離子交換和分子篩層析方法分離純化各種目標(biāo)蛋白，然后將分離純化的目標(biāo)蛋白用蛋白印跡法進(jìn)行驗(yàn)證(說(shuō)明.蛋白印跡:委托專業(yè)的多肽合成服務(wù)公司分別合成以上所述的錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶蛋白序列C端的35個(gè)氨基酸序列，將這些合成的多肽分別注射于家兔制備抗這些多肽的抗體而應(yīng)用于蛋白印跡)證明以上所述的3種基因在畢赤酵母中表達(dá)和分泌到胞外。用常規(guī)方法進(jìn)行酶活性測(cè)定，結(jié)果證明在畢赤酵母中表達(dá)分泌的重組漆酶具有漆酶 活性、在畢赤酵母中表達(dá)分泌的重組木質(zhì)素過(guò)氧化物酶具有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性和在畢赤酵母中表達(dá)分泌的重組錳過(guò)氧化物酶具有錳過(guò)氧化物酶活性。挑選高G418抗性的重組子作為畢赤酵母工程菌。1.4應(yīng)用畢赤酵母工程菌與植物作用，降解植物的木質(zhì)素(I)將畢赤酵母工程菌接種于YH)液體培養(yǎng)基(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖)中培養(yǎng)至0D_ = 6，取IOOOmL菌液接種于5000克(濕重)經(jīng)過(guò)粉碎的水稻秸桿中，混勻，于30°C放置4天。用常規(guī)的硫酸法測(cè)定其經(jīng)過(guò)畢赤酵母工程菌作用的水稻秸桿殘留木質(zhì)素的含量為4.0%。(2)將具有表達(dá)分泌錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶的通常應(yīng)用于植物原料發(fā)酵沼氣和乙醇的預(yù)處理(降解木質(zhì)素)的白腐真菌模式菌種-黃孢原毛平革菌接種于馬鈴薯培養(yǎng)基(20%馬鈴薯，2%葡萄糖)中培養(yǎng)至0D_ = 6，取IOOOmL菌液接種于5000克(濕重)經(jīng)過(guò)粉碎的水稻秸桿中，混勻，于30°C放置4天，用常規(guī)的硫酸法測(cè)定其經(jīng)過(guò)白腐真菌作用的水稻秸桿殘留木質(zhì)素的含量為9.8%。(3)將畢赤酵母接種于YPD液體培養(yǎng)基(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖)中培養(yǎng)至OD6tltl = 6，取IOOOmL菌液接種于5000克(濕重)經(jīng)過(guò)粉碎的水稻秸桿中，混勻，于30°C放置4天。用常規(guī)的硫酸法測(cè)定經(jīng)過(guò)畢赤酵母作用的水稻秸桿殘留的木質(zhì)素的含量為 14.7%0
(4)將2600g經(jīng)過(guò)粉碎的水稻秸桿與3400mL5%氨水混勻，于30°C放置4天，用常規(guī)的硫酸法測(cè)定其經(jīng)過(guò)氨水作用的水稻秸桿殘留木質(zhì)素的含量為10.1%。(5)用常規(guī)的硫酸法測(cè)定天然的水稻秸桿的木質(zhì)素的含量為15.1%統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，畢赤酵母工程菌降解植物的木質(zhì)素的效果極顯著強(qiáng)于畢赤酵母(P < 0.001)、極顯著強(qiáng)于白腐真菌(P < 0.001)和極顯著強(qiáng)于氨水(P < 0.001)的降解植物的木質(zhì)素的效果。實(shí)施例二2.1獲得酶基因及構(gòu)建表達(dá)載體所需的相關(guān)原件(I)PCR擴(kuò)增畢赤酵母的磷酸甘油醛脫氫的啟動(dòng)子序列用蝸牛酶裂解畢赤酵母的細(xì)胞壁，提取畢赤酵母基因組DNA，應(yīng)用上游引物(5，TTTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGT3 )和下游引物(5 GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTT3 )進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是其三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子序列。(2) PCR擴(kuò)增枯草芽孢桿菌的漆酶基因用蝸牛酶裂解枯草芽孢桿菌的細(xì)胞壁，提取枯草芽孢桿菌基因組DNA，應(yīng)用上游引物(5’ AACCTAGGATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC3’ )和下游引物(5 AAGCGGCCGCCTATTTATGGGGATCAGTTATA3’ )進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是枯草芽孢桿菌的漆酶基因序列。(3)應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增白腐真菌的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因和錳過(guò)氧化物酶基因
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應(yīng)用RNA提取試劑盒提取白腐真菌菌(白腐真菌模式菌種-黃孢原毛平革菌)的總RNA，以總RNA為模板，應(yīng)用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以上述合成的cDNA為模板,應(yīng)用引物 I (5，AAGAATTCGCCACCTGTTCCAACGGCAAGACCGTC3> )和引物 2(5’ AAGCGGCCGCCTAAGCACCCGGAGGCGGAGGGATGCG3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增.獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因序列；以上述合成的cDNA為模板，應(yīng)用引物 3 (5 ’ CCGAATTCGCGGTCTGCCCCGACGGCACCCGCGTCA3 ’)和引物 4 (5 ’ TTGCGGCCGCCTATGCGGGACCGTTGAACTGGACACC3 )進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是白腐真菌的錳過(guò)氧化物酶基因序列(4)應(yīng)用PCR擴(kuò)增畢赤酵母的rDNA序列提取畢赤酵母基因組DNA，以基因組DNA為模板，應(yīng)用上游引物(5’ CCGGTACCaggttcacctacggaaaccttg3，)和下游引物(5，CCTTCGAAtgtctcaaagattaagccatgc3’ )進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列分析和用NCBI提供的BLAST軟件分析證明是畢赤酵母基因組中的rDNA序列。說(shuō)明:①畢赤酵母和枯草芽孢桿菌基因組DNA提取方法:將菌細(xì)胞加于9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L山梨醇溶解)于30°C振搖30分鐘，然后按照常規(guī)的細(xì)菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA。②引物5’端的8個(gè)堿基是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(有下劃線的6個(gè)堿基).
(5)合成如下氨芐青霉素抗性基因序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒(méi)有下劃線的是氨芐青霉素抗性基因序列]5， AAGGTACCTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCAT AGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATMCTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTG CAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAG GGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAG CTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTG TCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCC CCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGT °C AGAAGTAAGTTGGCCGC AGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTT TCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTG CCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAAC GTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGC AAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAAGCTTGG3>(6)合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒(méi)有下劃線的是G418抗性基因序列]CCATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCAA⑦合成MFa因子信號(hào)肽[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(6個(gè)堿基)，沒(méi)有下劃線的是α因子信號(hào)肽序列]:TTGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTGG⑧合成轉(zhuǎn)錄終止子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護(hù)堿基(2個(gè)堿基)和DNA限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)出個(gè)堿基)，沒(méi)有下劃線的是轉(zhuǎn)錄終止子序列]:TTACTAG TCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTT TATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATC AGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTT CTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATC GATGG2.2構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體(I)由專業(yè)的DNA序列合成公式合成大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的兩條堿基互補(bǔ)的雙鏈，并且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過(guò)T4DNA連接酶的作用使其環(huán)化，形成DNA克隆載體。將這克隆載體命名為H)。(2)通過(guò)DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，將畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列、α因子信號(hào)肽DNA序列、白腐真菌的錳過(guò)氧化物酶基因序列和轉(zhuǎn)錄終止子序列依次重組于H)載體的多克隆位點(diǎn)。此載體稱為roi。(3)通過(guò)DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，將畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列、α因子信號(hào)肽DNA序列、白腐真菌的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因序列和轉(zhuǎn)錄終止子序列依次重組于H)載體的多克隆位點(diǎn)。此載體稱為T(mén)O2。(4)通過(guò)DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，將畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子DNA序列、α因子信號(hào)肽DNA序列、枯草芽孢桿菌的漆酶基因序列和轉(zhuǎn)錄終止子序列依次重組于H)載體的多克隆位點(diǎn)。此載體稱為T(mén)O3。

(5)通過(guò)DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，切取PD2和PD3載體的表達(dá)框架，并將切下的表達(dá)框架依次插入于roi的多克隆位點(diǎn)。此載體稱為roi23。(6)通過(guò)DNA限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用依次將氨芐青霉素基因表達(dá)框架、G418基因表達(dá)框架和畢赤酵母的rDNA序列重組于PD123載體的多克隆位點(diǎn)，從而完成表達(dá)載體的構(gòu)建(附圖1)。2.3構(gòu)建畢赤酵母工程菌用常規(guī)的氯化鈣方法制備大腸桿菌感受態(tài)，將以上構(gòu)建的表達(dá)載體(附圖1)轉(zhuǎn)化于大腸桿菌，提取質(zhì)粒(載體)DNA。按照常規(guī)方法制備畢赤酵母感受態(tài)，用常規(guī)的電轉(zhuǎn)化方法分別將其表達(dá)載體(附圖1)轉(zhuǎn)化畢赤酵母，將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化作用的畢赤酵母細(xì)胞涂布于含G418濃度為5000 μ g/ml的YPD瓊脂平板(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖)，30°C培養(yǎng)3天。將在含G418濃度為700 μ g/ml的YPD瓊脂平板上生長(zhǎng)的克隆轉(zhuǎn)種于G418濃度為20000 μ g/ml的YPD瓊脂平板上，30°C培養(yǎng)3天。挑選能在G418濃度為20000 μ g/ml的YPD瓊脂平板上生長(zhǎng)的克隆進(jìn)行搖瓶發(fā)酵表達(dá)，根據(jù)SDS-PAGE電泳初步分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)。用離子交換和分子篩層析方法分離純化各種目標(biāo)蛋白，然后將分離純化的目標(biāo)蛋白用蛋白印跡法進(jìn)行驗(yàn)證(說(shuō)明.蛋白印跡:委托專業(yè)的多肽合成服務(wù)公司分別合成以上所述的錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶蛋白序列C端的35個(gè)氨基酸序列，將這些合成的多肽分別注射于家兔制備抗這些多肽的抗體而應(yīng)用于蛋白印跡)證明以上所述的3種基因在畢赤酵母中表達(dá)和分泌到胞外。用常規(guī)方法進(jìn)行酶活性測(cè)定，結(jié)果證明在畢赤酵母中表達(dá)分泌的重組漆酶具有漆酶活性、在畢赤酵母中表達(dá)分泌的重組木質(zhì)素過(guò)氧化物酶具有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性和在畢赤酵母中表達(dá)分泌的重組錳過(guò)氧化物酶具有錳過(guò)氧化物酶活性。挑選高G418抗性的重組子作為畢赤酵母工程菌。2.4應(yīng)用畢赤酵母工程菌與植物作用，降解植物的木質(zhì)素(I)將畢赤酵母工程菌接種于YH)液體培養(yǎng)基(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖)中培養(yǎng)至0D_ = 6，取IOOOmL菌液接種于5000克(濕重)經(jīng)過(guò)粉碎的水稻秸桿中，混勻，于30°C放置4天，用掃描電鏡觀察證明水稻秸桿的細(xì)胞壁的僅殘留少量木質(zhì)素(附圖2)。(2)將具有分泌表達(dá)漆酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶的、通常應(yīng)用于植物原料發(fā)酵沼氣和乙醇的預(yù)處理(降解木質(zhì)素)的白腐真菌模式菌種-黃孢原毛平革菌接種于馬鈴薯培養(yǎng)基(20%馬鈴薯，2%葡萄糖)中培養(yǎng)至0D_ = 6，取IOOOmL菌液接種于5000克(濕重)經(jīng)過(guò)粉碎的水稻秸桿中，混勻，于30°C放置4天，用掃描電鏡觀察證明水稻秸桿的細(xì)胞壁殘留木質(zhì)素的量明顯多于用混合的畢赤酵母工程菌處理的水稻秸桿(附圖3)。(3)將畢赤酵母接種子YPD液體培養(yǎng)基(2%蛋白胨，I %酵母提取物，2%葡萄糖)中培養(yǎng)至OD6tltl = 6，取IOOOmL菌液接種于5000克(濕重)經(jīng)過(guò)粉碎的水稻秸桿中，混勻，于30°C放置4天， 用掃描電鏡觀察證明水稻秸桿的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，木質(zhì)素沒(méi)有被降解(附圖4)。(4)將2600g經(jīng)過(guò)粉碎的水稻秸桿與3400mL5%氨水混勻，于30°C放置4天，用掃描電鏡觀察證明水稻秸桿的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)殘留大量的木質(zhì)素(附圖5)。(5)用掃描電鏡觀察證明天然的水稻秸桿的結(jié)構(gòu)完整，木質(zhì)素沒(méi)有被降解(附圖6)。
權(quán)利要求
1.一種用畢赤酵母工程菌降解植物的木質(zhì)素的方法，其特征在于:通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)從微生物中克隆錳過(guò)氧化物酶基因、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因和漆酶基因；構(gòu)建含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架、木質(zhì)素過(guò)氧化酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體；將上述構(gòu)建的畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，并通過(guò)其表達(dá)載體上的抗性進(jìn)行篩選獲得表達(dá)載體高拷貝重組的含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架、木質(zhì)素過(guò)氧化酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌；將以上所述的畢赤酵母工程菌應(yīng)用于降解植物的木質(zhì)素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用畢赤酵母工程菌降解植物的木質(zhì)素的方法，其特征在于:利用權(quán)利要求1 所述的方法制備降解植物的木質(zhì)素的畢赤酵母工程菌的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用畢赤酵母工程菌降解植物的木質(zhì)素的方法。屬生物技術(shù)領(lǐng)域。首先分別從微生物中克隆木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因、錳過(guò)氧化物酶基因和漆酶基因；構(gòu)建含上述三種基因表達(dá)框架的畢赤酵母表達(dá)載體，將畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，通過(guò)G418抗性篩選而獲得含錳過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因表達(dá)框架和漆酶基因表達(dá)框架的畢赤酵母工程菌。將畢赤酵母工程菌與植物原料作用而降解植物的木質(zhì)素。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)于這種畢赤酵母工程菌對(duì)木質(zhì)素的降解作用強(qiáng)于當(dāng)前應(yīng)用于降解植物的木質(zhì)素的天然的表達(dá)分泌錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶的天然的微生物。
文檔編號(hào)D21C5/00GK103233382SQ201310134638
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月3日
發(fā)明者張愛(ài)聯(lián), 尹慧祥, 符仙, 楊穗珊, 羅進(jìn)賢, 張?zhí)碓? 易國(guó)輝 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所