專利名稱：調(diào)控植物木質(zhì)素含量的一種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中調(diào)控植物木質(zhì)素含量的一種方法。
背景技術(shù)：
植物進(jìn)化形成一個(gè)有效的維管組織對(duì)于陸生植物的出現(xiàn)是至關(guān)重要的。特別對(duì)于多年生木本植物，由于它的多年生和特異性形成木材的特點(diǎn)，維管組織顯得更為重要。植物維管組織包括韌皮部與木質(zhì)部。木質(zhì)部和韌皮部都是在植物發(fā)育過程中由形成層細(xì)胞分化和薄璧細(xì)胞的再分化而形成的。細(xì)胞分化的關(guān)鍵是細(xì)胞按照一定程序發(fā)生差別基因表達(dá)。差別基因表達(dá)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是合成專一性的mRNA。現(xiàn)在通常認(rèn)為基因的差別表達(dá)是該基因的特異調(diào)節(jié)元件如啟動(dòng)子等來調(diào)控的。最新研究認(rèn)為組織特異性基因的啟動(dòng)子對(duì)該基因的組織特異性表達(dá)起重要作用。為了研究植物維管組織發(fā)育和分化過程中的分子機(jī)理，近年來對(duì)維管組織特異性啟動(dòng)子的研究成為熱點(diǎn)。
反義技術(shù)是根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，用人工合成或生物體合成地特定互補(bǔ)的DNA或RNA片斷(或化學(xué)修飾產(chǎn)物)抑制或封閉基因表達(dá)的技術(shù)。主要包括反義寡聚核苷酸技術(shù)、反義RNA技術(shù)和核酶(Ribozyme)技術(shù)等。
由于植物體細(xì)胞全能性和組培體系的建立，外源反義RNA在真核細(xì)胞中的生物學(xué)意義的研究進(jìn)展較快。第一個(gè)應(yīng)用于植物的反義RNA系統(tǒng)是將細(xì)菌的CAT基因接上農(nóng)桿菌的Nos啟動(dòng)子和3’末端之后連在pUC18載體上，轉(zhuǎn)化胡蘿卜的原生質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)CAT基因的表達(dá)受到了抑制。荷蘭學(xué)者將查爾酮(CHS)的cDNA與CaMV的35S啟動(dòng)子反向連接，轉(zhuǎn)化矮牽牛后再生的轉(zhuǎn)基因植株，其花色從原來的紫紅色變?yōu)榉奂t色并夾雜有白色，有些植株花朵完全成白色。一系列檢測(cè)表明，轉(zhuǎn)基因矮牽牛內(nèi)源CHS mRNA以及酶蛋白含量降低，從而減少了類黃酮的生物合成?；亟辉囼?yàn)還表明這一性狀是由染色體穩(wěn)定遺傳給后代的。這是首次利用人工反義RNA系統(tǒng)調(diào)節(jié)植物基因組的活動(dòng)取得了成功，為園藝學(xué)育種開辟了一個(gè)新的領(lǐng)域。
木質(zhì)素是由三種醇單體或單木質(zhì)酚(對(duì)香豆醇、松柏醇、芥子醇)合成的一種復(fù)雜的酚類聚合物。在細(xì)胞壁的木質(zhì)化過程中，木質(zhì)素滲入到細(xì)胞壁中，填充于纖維素構(gòu)架內(nèi)，如導(dǎo)管和管胞細(xì)胞的形成。由于木質(zhì)素的滲入，加大了細(xì)胞壁的硬度，增強(qiáng)了細(xì)胞的機(jī)械支持力或抗壓強(qiáng)度，促進(jìn)機(jī)械組織的形成，以有利于鞏固和支持植物體及水分輸?shù)赖茸饔?，同時(shí)由于木質(zhì)素的化學(xué)特性，如不可溶性和復(fù)雜的酚類聚合物，使得木質(zhì)部具有細(xì)胞壁疏水性，也增強(qiáng)了抗病能力。
樹木的次生木質(zhì)部有纖維素(β-1-4-糖苷)木質(zhì)素(苯基多聚物)和半纖維素(異型多糖)，比例約為2∶1∶1。在樹木生長(zhǎng)時(shí)，纖維素微纖絲為細(xì)胞壁提供張力，木質(zhì)素增加纖維素微纖絲的硬度。木質(zhì)素含量高的木材由于硬度高而廣泛用于建筑和家具領(lǐng)域。但在造紙過程中卻需要清除木質(zhì)素。目前去除木漿中的木質(zhì)素一般需借助毒性較高的化學(xué)物質(zhì)，這道工序是造紙工業(yè)中最耗費(fèi)能源、對(duì)環(huán)境危害最大的一個(gè)環(huán)節(jié)。無論是提高樹木的木質(zhì)素含量還是降低木質(zhì)素含量都將有益于生產(chǎn)。
從策略上說，可以從多個(gè)方面進(jìn)行木質(zhì)素含量控制(1)控制木質(zhì)素合成途徑中的各種酶系的合成是一個(gè)重要途徑，如對(duì)從PAL酶到過氧化物酶/漆酶等進(jìn)行反義基因轉(zhuǎn)化有可能達(dá)到目的；(2)改變木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)組成和化學(xué)性質(zhì)。由于研究木質(zhì)素含量遺傳變異的重要目的之一就是為工業(yè)造紙服務(wù)，在難以直接降低木質(zhì)素含量情況下，改變木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)組成有可能間接地達(dá)到同樣的效果；(3)必須認(rèn)識(shí)到木質(zhì)素的前體是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成的，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞壁并進(jìn)行脫氫聚合形成木質(zhì)素，因此木質(zhì)素的合成調(diào)控也需注意涉及到一些非酶化學(xué)分子的作用，即傳遞運(yùn)輸過程的控制，但這方面的研究至今卻很少見報(bào)道研究。單個(gè)酶的作用及多個(gè)酶間的相互作用對(duì)于探索木質(zhì)素的合成機(jī)理有重要意義，因此木質(zhì)素合成酶的分子生物學(xué)特性及作用機(jī)理研究日益受重視。
目前直接應(yīng)用基因工程的方法來改變木質(zhì)素含量的研究已有報(bào)道。Piquemal等從岡尼桉(Eucalyptus)分離出來的CCR(羥基肉桂酰輔酶A還原酶)(EC1.2.1.44)酶的cDNA的反義構(gòu)建載體，通過農(nóng)桿菌(Agrobacerium)轉(zhuǎn)化到煙草(Nicotianatabacum L.)上，結(jié)果顯示出在穩(wěn)態(tài)時(shí)CCR mRNA含量和CCR活性下降，且含量下降的植株木質(zhì)部細(xì)胞壁呈橙棕色，紫丁香基與愈創(chuàng)木基的比率提高，且出現(xiàn)不正常細(xì)胞壁酚類物質(zhì)。然而CCR活性嚴(yán)重下降的植物除了表現(xiàn)出木質(zhì)素下降外，還表現(xiàn)出形體小、葉形異常和縐縮導(dǎo)管等特征。通常認(rèn)為CAD(羥基肉桂醇脫氫酶)是催化木質(zhì)素前體合成的最后一步的酶，因此降低CAD活性有可能減少木質(zhì)素前體的合成。Baucher等研究將從毛果楊×美洲黑楊(P.trichocarpa Torr.Et Groy×P.deltoides Marsh.)分離出來的CAD酶的cDNA通過農(nóng)桿菌進(jìn)行正義和反義轉(zhuǎn)化到歐洲山楊×銀白楊(P.tremula L.×P.alba L.)中，結(jié)果表明3個(gè)反義轉(zhuǎn)化和2個(gè)共抑制的品系的木質(zhì)部組織CAD活性下降70％，在CAD活性少于60％的品系中，可檢測(cè)到紅色的木質(zhì)部，但木質(zhì)素含量和組成與對(duì)照品系相似，并未下降。但是細(xì)胞壁的化學(xué)特性不同，應(yīng)用間苯三酚染色后，正常品系的木質(zhì)部呈典型的淡紅色，而CAD活性下降的品系染色后呈棕紅色。用NaOH處理后，通過將細(xì)胞壁中具有堿溶性的部分進(jìn)行酸化處理后，具有紅色木質(zhì)部的品系的木質(zhì)素可沉淀，而白色木質(zhì)部的品系的木質(zhì)素不沉淀。光譜分析顯示出紅色木質(zhì)部的楊樹香蘭素和紫丁香基醛含量提高。紙漿試驗(yàn)證明CAD活性下降的品系只有少量的木質(zhì)素存于紙漿中。類似的報(bào)道還有Higuchi等，CAD反義轉(zhuǎn)化的植株木質(zhì)素含量并不下降，但木質(zhì)素的組成和化學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變。CAD反義轉(zhuǎn)化后木質(zhì)素含量不下降，這與自然界中火炬松CAD突變體的結(jié)果不一致。OMT是重要的控制木質(zhì)素合成酶，Dwivedi等將美洲山楊中編碼bi-OMT(EC2.1.1.68)酶的反義序列與Ca MV3 5S基因的增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和終止子組裝后轉(zhuǎn)化到煙草基因組內(nèi)后，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出正常的表現(xiàn)型。在4個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的莖部中，OMT(咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶)酶的活性平均下降29％。莖部木材化學(xué)分析結(jié)果顯示出紫丁香基單位含量下降，木質(zhì)素含量下降水平與bi-OMT酶活性程度相關(guān)。Doorsselaere等應(yīng)用反義COMT(咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶)轉(zhuǎn)化歐洲山楊×銀白楊后，COMT活性下降為正常的5％，但木質(zhì)素含量并不下降。根據(jù)應(yīng)用轉(zhuǎn)化單酶基因方法改造煙草木質(zhì)素含量的研究報(bào)道，降低單個(gè)酶OMT、CAD、POD(過氧化物酶)、COMT和F5H(阿魏酸5-羥基化酶)等酶活性，并不影響木質(zhì)素含量變化，而降低酶系PAL(苯丙氨酸解氨酶)、C4H(肉桂酸4-羥基化酶)和CCR(羥基肉桂酰輔酶A還原酶)等酶活性，則可以降低木質(zhì)素含量。
通過鑒定樹木與草本植物中木質(zhì)素合成途徑的酶和基因，以往努力減少樹木中木質(zhì)素的含量，通過下調(diào)編碼咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶或肉桂醇脫氫酶含量沒有獲得成功，只是修飾了木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)。在轉(zhuǎn)基因煙草中降低這些酶的含量顯示沒有減少木質(zhì)素的含量。然而通過在轉(zhuǎn)基因煙草中降低苯丙氨酸脫氨酶含量，顯著減少了木質(zhì)素的含量，該酶催化木質(zhì)素合成途徑中進(jìn)入苯丙基衍生物的途徑導(dǎo)致了一系列表型不正常。同樣在轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草中通過降低肉桂酸輔酶A還原酶的含量也降低了(25％-40％)木質(zhì)素的含量，但導(dǎo)致了細(xì)胞壁的委縮和矮化。這些草木系統(tǒng)清晰地表明了修飾次生代謝和木質(zhì)素質(zhì)量的可能性。因此，樹木生物技術(shù)的問題是能否降低木質(zhì)素含量而不影響結(jié)構(gòu)的硬度和樹木的生長(zhǎng)。
楊樹的4CL(4-香豆酸輔酶A連接酶)蛋白Pt4CL1、Pt4CL2催化羥基肉桂酸與CoA的連接反應(yīng)，為木質(zhì)素和類黃酮的生物合成提供酚類前體。Pt4CL2在莖和葉的表皮細(xì)胞中表達(dá)，與類黃酮合成相關(guān)。Pt4CL1是在發(fā)育的木質(zhì)部中表達(dá)，和木質(zhì)素的合成相關(guān)。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供調(diào)控植物木質(zhì)素含量的一種方法。
本發(fā)明所提供的調(diào)控植物木質(zhì)素含量的方法，是將含有毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，得到木質(zhì)素含量升高的植物；將含有毛白楊4CL1啟動(dòng)子-反義4CL1融合基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，得到木質(zhì)素含量降低的植物。
所述毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。
序列表中的序列1由2893個(gè)堿基組成，4CL1基因的開放閱讀框架為自5′端第1150位-2772位核苷酸序列。
所述毛白楊4CL1啟動(dòng)子-反義4CL1融合基因具有序列表中序列2的核苷酸序列。
序列表中的序列2由2770個(gè)堿基組成。
用于構(gòu)建所述含有毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因的表達(dá)載體或含有毛白楊4CL1啟動(dòng)子-反義4CL1融合基因的表達(dá)載體的出發(fā)載體可為Ti類質(zhì)粒載體和病毒載體，優(yōu)選為Ti類質(zhì)粒載體。
所述Ti類質(zhì)粒載體優(yōu)選為雙元載體，如pBI101或pBI121。所述含有毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因的表達(dá)載體優(yōu)選為PBI4CIp-4CI1；所述含有毛白楊4CL1啟動(dòng)子-反義4CL1融合基因的表達(dá)載體優(yōu)選為PBMZFA2。
所述轉(zhuǎn)化方法可為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法或花粉管通道法，優(yōu)選為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。
本發(fā)明方法中，所述植物可為草本植物或木本植物，其中，所述草本植物優(yōu)選為煙草，所述木本植物優(yōu)選為楊樹。
本發(fā)明通過在植物細(xì)胞中引入毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因或毛白楊4CL1啟動(dòng)子-反義4CL1融合基因，來生產(chǎn)木質(zhì)素含量升高或降低的轉(zhuǎn)基因植物特別是轉(zhuǎn)基因樹木，為培育木質(zhì)素含量降低或升高的植物以及改良樹木材性提供了一條重要的途徑。


圖1為毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因表達(dá)載體PBI4CIp-4CI1的構(gòu)建過程示意2為毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因表達(dá)載體PBI4CIp-4CI1的PCR檢測(cè)圖譜圖3為轉(zhuǎn)毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因煙草再生苗的PCR檢測(cè)圖譜圖4為轉(zhuǎn)毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因煙草的southern雜交圖譜圖5為轉(zhuǎn)毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因煙草的northern雜交圖譜圖6a為轉(zhuǎn)毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因煙草葉中的4CL1酶活性分析柱狀6b為轉(zhuǎn)毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因煙草莖中的4CL1酶活性分析柱狀7為轉(zhuǎn)毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因煙草的木質(zhì)素含量變化示意8為轉(zhuǎn)毛白楊4CL1啟動(dòng)子-反義4CL1融合基因煙草的木質(zhì)素含量柱狀圖具體實(shí)施方式
材料限制性內(nèi)切酶、dNTP和Tag DNA聚合酶購(gòu)自上海生工公司(美國(guó)Premega產(chǎn)品，進(jìn)口分裝)。DNA回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈?gòu)自重慶博大科技公司(美國(guó)Premega產(chǎn)品，進(jìn)口分裝)。PCR引物合成和DNA測(cè)序由DNA測(cè)序儀377型測(cè)定完成(北京賽百盛公司)。
pBI121質(zhì)粒(購(gòu)自Clontech)，pUC18-T載體購(gòu)自上海生工公司(美國(guó)BBI公司產(chǎn)品)。
實(shí)施例1、培育木質(zhì)素含量提高的轉(zhuǎn)基因煙草本實(shí)施例所用的地高新試劑盒的貨號(hào)為92445820，31 Oct 2003，Boehringer公司。
按常規(guī)方法提取毛白楊的總RNA，分離mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在引物15-CGCAATGGACGCACAATGAAT-3和引物25-ANTGTCTTACGTTGGGTACG-3的引導(dǎo)下，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化回收目的片段，與pUC18-T載體相連后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)篩選得到陽性克隆，提取陽性克隆中的質(zhì)粒，得到含有楊樹4CL1基因的載體pt4CL。
以按照常規(guī)方法提取的毛白楊總DNA為模板，在引物15-ATGACGGTGGCATGAACAC-3和引物25-TGGCGAGTTTTAGGTGCTC-3的引導(dǎo)下常規(guī)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后與pUC18-T載體相連后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)篩選得到陽性克隆，提取陽性克隆中的質(zhì)粒，得到含有毛白楊4CL啟動(dòng)子的載體p4CL1p。
以pt4CL為模板，在引物1CAAGCTT GCAATGGACGCCACAATGAATCC，引物2CGGATCCCTGTCTTACGTTGGGTACG的引導(dǎo)下，按照如下循環(huán)程序94℃ 5min；94℃ 30sec，55℃ 45sec，72℃ 90sec，30個(gè)循環(huán)；72℃10min進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收、純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到4CL1基因片段，分別利用PstI和BamHI酶切純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和PUC18，然后進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)篩選得到陽性克隆，提取陽性克隆中的質(zhì)粒，得到亞克隆載體p4CL1。
用同樣方法，以p4CL1p為模板，在引物3CAAGCTTGA CGGTGGCATGAACACAAAGC，引物4CCTGCAGTGGCGAGTTTTAG GTGCTCT的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收、純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到毛白楊4CL啟動(dòng)子基因片段，分別利用PstI和HindIII酶切純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和PUC18，然后進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)篩選得到陽性克隆，提取陽性克隆中的質(zhì)粒，得到亞克隆載體p4CLp。
毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因表達(dá)載體PBI4CIp-4CI1的構(gòu)建過程如圖1所示，具體過程如下用HindIII/PstI酶將毛白楊4CL1啟動(dòng)子片段從亞克隆載體p4CLp上切下，與用PstI/BamHI酶將4CL1片段從亞克隆載體p4CL1上切下的片段相連接，連接產(chǎn)物回收后與HindIII/BamHI酶切的pBI121載體進(jìn)行連接，獲得含有毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因的重組質(zhì)粒PBI4CIp-4CI1，該重組質(zhì)粒按常規(guī)方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。在含卡那霉素(km)100mg/L的LB平板培養(yǎng)篩選后，提取質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行HindIII/BamHI酶切鑒定，鑒定結(jié)果表明重組質(zhì)粒PBI4CIp-4CI1的結(jié)構(gòu)正確。以重組質(zhì)粒PBI4CIp-4CI1為模板，利用引物1CAAGCTTGCAATGGACGC CACAATGAATCC和引物2CGGATCCCTGTCTTACGTTGGGTACG對(duì)4CL1基因進(jìn)行PCR鑒定，利用引物3CAAGCTTGACGGTG GCATGAACACAAAGC和引物4CCTGCAGTGGCGAGTTTTAGGTG CTCT對(duì)毛白楊4CL1啟動(dòng)子進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖2所示，表明毛白楊4CL1啟動(dòng)子和4CL1基因序列均已在載體PBI4CIp-4CI1中。按常規(guī)方法對(duì)質(zhì)粒PBI4CIp-4CI1進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，位于PBI4CIp-4CI1的4951bp-7836bp之間；序列表中的序列1由2893個(gè)堿基組成，4CL1基因的開放閱讀框架為自5′端第1150位-2772位核苷酸序列。
2、煙草的轉(zhuǎn)化與鑒定分析按改進(jìn)的An方法，直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，在鏈霉素(Sm)125mg/L和Km50mg/L的YEB培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，并挑取單克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到陽性克隆。
含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌LBA4404在YEB培養(yǎng)基(Sm 100mg/l，Km50mg/L)中28℃震蕩培養(yǎng)到OD600＝0.6-0.8，按1％-2％的比例用新鮮的YEB培養(yǎng)基(Sm 100mg/L)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)到OD600＝0.2-0.3。將煙草無菌苗的葉片剪下，除去葉脈，切成0.5-1.0cm的小塊，在菌液中浸泡2-3min，其間不斷搖動(dòng)，使薄片與菌液充分接觸，取出，用無菌濾紙吸干表面菌液，放在表面鋪一張濾紙的MS培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)4天，將外植體轉(zhuǎn)移到含100mg/L Km，500mg/L羧卞霉素(Car)的MS培養(yǎng)基(0.5mg/L IAA，2.0mg/L BA)上28℃繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)將未轉(zhuǎn)化的組織同樣處理作為負(fù)對(duì)照。每隔14天換一次培養(yǎng)基。當(dāng)抗性芽長(zhǎng)到1-3cm時(shí)切下，轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基中長(zhǎng)莖。當(dāng)莖長(zhǎng)到3-5cm時(shí)，按照文獻(xiàn)(王關(guān)林，方宏筠，1998，科學(xué)出版社)的方法轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基(100mg/LKm，500mg/L羧卞霉素(Car))中生根，結(jié)果得到83株抗性再生苗。取20株按常規(guī)方法提取植株總DNA，在引物1CAAGCTTGCAATGGACGC CACAATGAATCC，引物2CGGATCCCTG TCTTACGTTGGGTACG的引導(dǎo)下按常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增4CL1基因，結(jié)果均為PCR檢測(cè)陽性(圖3)。
3、轉(zhuǎn)基因煙草的southern雜交按照常規(guī)方法提取PCR檢測(cè)陽性的轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草植株的總DNA，以非轉(zhuǎn)基因煙草為對(duì)照，使用限制性內(nèi)切酶XbaI(Takara)在37℃進(jìn)行酶解3小時(shí)，進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，將電泳膠放在10倍體積的變性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)中震蕩40min，再在10倍體積的中和液(1.5M NaCl，0.5M Tris-Cl，pH7.0)中震蕩40min，使用20×SSC進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)膜過夜，用2×SSC洗膜，于80℃干燥2小時(shí)。取1ug步驟1中PCR得到的4CL1基因片段，加蒸餾水至16ul。沸水浴10min，迅速置于冰水中5min。加入2ulDIG-HIGH PRIME，混勻。37℃保溫1h，加入0.2MEDTA(PH＝8.0)，混勻。預(yù)熱雜交液(地高新試劑盒中自帶的雜交液)至42℃。預(yù)雜交30min。取DNA探針(探針用量為25ng/ml雜交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。將變性探針DNA加入雜交液中混勻與雜交膜一起放入雜交袋中。除去氣泡，封口，42℃過夜。取出雜交膜用50ml 2×SSC，0.1％SDS清洗2次，每次5min。100ml 0.5×SSC，0.1％ SDS 50℃清洗2次，每次5min。用100ml洗滌液-100ml馬來酸緩沖液(Maleic acid buffer)(0.1M馬來酸，0.15M NaCl，pH7.5)中加入0.3ml tween20清洗1-5min，加入80ml封閉液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用20ml抗體液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用100ml洗滌液清洗2次，每次15min。用20ml檢測(cè)液(地高新試劑盒中自帶)平衡2-5分鐘，將雜交膜放在新雜交袋中，加入CSPD-ready-to use 1ml除氣泡，保溫4分鐘。除去CSPD-ready-to use，封口，夾X光片，室溫放置1小時(shí)。結(jié)果表明在所檢測(cè)的20株P(guān)CR檢測(cè)陽性的再生苗中，16株的southern雜交結(jié)果為陽性。4株southern雜交結(jié)果為陽性的雜交圖譜如圖4所示。圖4中，CK為非轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)照，1-4為PCR檢測(cè)陽性的轉(zhuǎn)基因煙草。
4、轉(zhuǎn)基因煙草的Northern雜交按照常規(guī)方法提取southern雜交檢測(cè)陽性的16株轉(zhuǎn)基因煙草植株的總RNA，以非轉(zhuǎn)基因煙草為對(duì)照，進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳。使用20×SSC進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)膜過夜，用2×SSC洗膜，于80℃干燥2小時(shí)。用1ug PCR得到的4CL1基因的DNA，加蒸餾水至16ul，沸水浴10min，迅速置于冰水中5min，加入2ul DIG-HIGH PRIME，混勻，37℃保溫1h，加入0.2M EDTA(PH＝8.0)，混勻。預(yù)熱雜交液(地高新試劑盒中自帶)至42℃。預(yù)雜交30min。取RNA探針(探針用量為25ng/ml雜交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。將變性探針RNA加入雜交液中混勻與雜交膜一起放入雜交袋中。除去氣泡并封口、42℃過夜。取出雜交膜用50ml 2×SSC，0.1％SDS清洗2次，每次5min。100ml 0.5×SSC，0.1％ SDS 50℃清洗2次，每次5min。用100ml洗滌液-100ml馬來酸緩沖液(Maleic acid buffer)(0.1M馬來酸0.15M NaCl，pH7.5)中加入0.3ml tween20清洗1-5min，加入80ml封閉液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用20ml抗體液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用100ml洗滌液清洗2次，每次15min。用20ml檢測(cè)液(地高新試劑盒中自帶)平衡2-5分鐘，將雜交膜放在新雜交袋中，加入CSPD-ready-to use 1ml除氣泡，保溫4分鐘。除去CSPD-ready-to use，封口，夾X光片，室溫放置1小時(shí)。結(jié)果表明在所檢測(cè)的16株southern雜交檢測(cè)陽性的再生苗中，11株為陽性。部分植株的northern雜交結(jié)果如圖5所示，圖5中，CK為非轉(zhuǎn)基因煙草，1-5為southern雜交檢測(cè)陽性的轉(zhuǎn)基因煙草植株。
5.轉(zhuǎn)基因煙草4CL1酶活性的測(cè)定northern雜交檢測(cè)陽性的轉(zhuǎn)基因煙草葉片和莖分別在液氮下粉碎，同時(shí)以非轉(zhuǎn)基因煙草為對(duì)照，用提取緩沖液(0.2M Tris-HCl pH7.5，8mM MgCl2，5mM DTT，30％甘油，1ug/ml亮抑酶肽(Leupeptin))提取，提取液在18000g、4℃離心15min，上清液用于酶活性分析。同時(shí)使用BSA做標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)蛋白粗提液定量。1ml酶反應(yīng)液中包括0.2M Tris-HCl(pH7.5)，8mM MgCl2，0.8mM ATP，0.1mM底物(分別為4-香豆酸，阿魏酸和咖啡酸)，和25-30ul粗提液于24℃反應(yīng)12分鐘，然后測(cè)定A333，A346，A350的增加。每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表1、表2、圖6a和圖6b所示，表明在轉(zhuǎn)基因煙草的莖中4CL1酶活性有較明顯的提高(增加30-40％)，而在葉中無明顯增加。說明毛白楊4CL1啟動(dòng)子可以在轉(zhuǎn)基因煙草的形成層部位特異性表達(dá)4CL1酶。表1和表2中，1-9表示轉(zhuǎn)基因植株；圖6a和圖6b中，sample1-sample9為轉(zhuǎn)基因植株。
表1.轉(zhuǎn)基因煙草與非轉(zhuǎn)基因煙草(CK)葉中4CL1酶活性分析(以三組為平行)

表2.轉(zhuǎn)基因煙草與非轉(zhuǎn)基因煙草(CK)莖中4CL1酶活性

6、轉(zhuǎn)基因煙草中木質(zhì)素含量的測(cè)定northern雜交檢測(cè)陽性的轉(zhuǎn)基因煙草苗生根培養(yǎng)30天后，分別取空白對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因煙草)與轉(zhuǎn)基因植株各6株，液氮冷凍條件下研磨，稱取1.00g，加入6mL72％的H2SO4，30-40℃恒溫水浴不斷攪拌1小時(shí)。用蒸餾水稀釋到H2SO4濃度為4％，121℃第二次消化1小時(shí)。用不同溶劑(丙酮，水，乙醇)溶解轉(zhuǎn)基因煙草中的木質(zhì)素測(cè)定含量，固體經(jīng)離心，60℃烘干至恒重，計(jì)算木質(zhì)素含量。結(jié)果如表3、表4、表5和圖7所示，表明木質(zhì)素含量有一定程度的提高(3.9％-6.0％)。表3、表4和表5中，1-3表示轉(zhuǎn)基因植株；圖7中，sample1-sample3為轉(zhuǎn)基因植株。
表3.丙酮溶解提取的木質(zhì)素含量的變化(每給數(shù)據(jù)測(cè)定三次取平均值)

表4.水溶解提取的木質(zhì)素含量的變化

表5.乙醇溶解提取的木質(zhì)素含量的變化

實(shí)施例2、培育木質(zhì)素含量降低的轉(zhuǎn)基因煙草1、毛白楊4CL1啟動(dòng)子-反義4CL1融合基因表達(dá)載體PBMZFA2的構(gòu)建用引物a，b，c，d分別從含有毛白楊4CL1啟動(dòng)子與4CL1基因的克隆載體PBI4CIp-4CI1中擴(kuò)增目標(biāo)基因，用引物a，b擴(kuò)增應(yīng)得到一條1100bp的帶，用引物c，d擴(kuò)增應(yīng)得到一條1700bp的帶。
PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)液組成是1×緩沖液體系；寡聚核苷酸引物，0.2umol/L；DNA模板，1ug/ul；脫氧核苷三磷酸，100umol/L；熱穩(wěn)定的TagDNA聚合酶，2.5U/100ul。反應(yīng)程序采用94℃變性5分鐘，94℃模板變性30秒，65℃引物退火45秒，72℃延伸60秒，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10分鐘結(jié)束反應(yīng)。然后將二個(gè)PCR反應(yīng)液混合，用上述的PCR程序繼續(xù)反應(yīng)20次。結(jié)果產(chǎn)物有三條帶分別為2800bp，1700bp，1100bp，用博大科技的玻璃奶回收試劑盒回收2800bp的條帶。
引物a 5’-GTCTAGAGACGGTGGCATGAAC-3’引物b 5’-CCAACGTAAGACAGTAATAACCAGTGTTGCTCAAC-3’引物c 5’-TACTGTCTTACGTTGGGTAC-3’引物d 5’-CCCCGGGATGGACGCCACAATG-3’回收純化已經(jīng)連接好的2800bp片斷，與PMD-18T載體(Takara)16℃過夜連接，得到重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Frederick 1992)，并由上海申工測(cè)序驗(yàn)證，此載體定名為T-mf。將驗(yàn)證過的T-mf載體與pBI101載體質(zhì)粒用XbaI/SmaI雙酶切。取純化回收的經(jīng)XbaI/SmaI雙酶切的PBI101 1ul和純化的2800bp的插入DNA片斷連接反應(yīng)，獲得毛白楊4CL1啟動(dòng)子-反義4CL1融合基因表達(dá)載體PBMZFA2。用質(zhì)粒PBMZFA2按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。在含Km 100mg/L(卡那霉素)的LB平板培養(yǎng)篩選后，將經(jīng)XbaI/SmaI雙酶切檢測(cè)呈陽性和以引物aGTCTAGAGACGGTGG CATGAAC和引物dCCCCGGGATGGACGCCACAATG進(jìn)行的PCR檢測(cè)呈陽性的菌株，由上海申工測(cè)序，結(jié)果表明毛白楊4CL1啟動(dòng)子-反義4CL1融合基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，位于PBMZFA2的4975bp-7739bp之間；序列表中的序列2由2770個(gè)堿基組成。
2、煙草的轉(zhuǎn)化與鑒定分析按改進(jìn)的An方法，PBMZFA2直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，在Sm 125mg/L和Km 50mg/L的YEB培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，并挑取單克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到陽性克隆。
含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌LBA4404在YEB培養(yǎng)基(Sm 100mg/l，Km50mg/L)中28℃震蕩培養(yǎng)到OD600＝0.6-0.8，按1％-2％的比例用新鮮的YEB培養(yǎng)基(Sm 100mg/L)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)到OD600＝0.2-0.3。將煙草無菌苗的葉片剪下，除去葉脈，切成0.5-1.0cm的小塊，在菌液中浸泡2-3min，其間不斷搖動(dòng)，使薄片與菌液充分接觸，取出，用無菌濾紙吸干表面菌液，放在表面鋪一張濾紙的MS培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)4天，將外植體轉(zhuǎn)移到有選擇壓(Km 100mg/L，Car 250mg/L)的分化培養(yǎng)基-MS培養(yǎng)基+0.5mg/L IAA+2.0mg/L BA上，在25℃，14小時(shí)的光照條件下培養(yǎng)，每隔14天換一次培養(yǎng)基，同時(shí)將未轉(zhuǎn)化的組織同樣處理作為負(fù)對(duì)照。待轉(zhuǎn)化苗長(zhǎng)到1cm時(shí)，按照文獻(xiàn)(王關(guān)林，方宏筠，1999，科學(xué)出版社)的方法轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基(Km 100mg/L，Car 250mg/L)中生根，一周后生根。未轉(zhuǎn)化的不定芽在選擇培養(yǎng)基中枯萎，不能正常生長(zhǎng)。經(jīng)抗菌素培養(yǎng)篩選，分別獲得含有毛白楊4CL1啟動(dòng)子-反義4CL1基因的植株20株。
生根后的轉(zhuǎn)基因苗在組織培養(yǎng)條件下培養(yǎng)45天，煉苗、移栽盆中。得到轉(zhuǎn)基因煙草幼苗，與煙草空白對(duì)照，生理生長(zhǎng)與形態(tài)無明顯變化。
按常規(guī)方法提取轉(zhuǎn)基因煙草的總DNA，用引物c、d按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR檢測(cè)，同時(shí)以非轉(zhuǎn)基因煙草作為空白對(duì)照。結(jié)果在轉(zhuǎn)基因煙草中得到1700bp的擴(kuò)增條帶，表明毛白楊4CL1啟動(dòng)子-反義4CL1融合基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到再生苗中。
3、轉(zhuǎn)基因煙草木質(zhì)素含量分析按照常規(guī)方法分別測(cè)定轉(zhuǎn)毛白楊4CL1啟動(dòng)子-反義4CL1融合基因煙草和空白煙草的木質(zhì)素含量，結(jié)果如表6和圖8所示，表明9株被檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因煙草的木質(zhì)素含量均有所變化，木質(zhì)素含量降低最大的達(dá)到10.5％。轉(zhuǎn)基因植株平均的木質(zhì)素含量是23.4％，對(duì)照植株的平均木質(zhì)素含量是28.2％，多株轉(zhuǎn)基因植株的木質(zhì)素平均含量比對(duì)照降低了4.8％(表6)。轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量的降低，說明毛白楊4CL1啟動(dòng)子啟動(dòng)的反義的4CL1基因的轉(zhuǎn)入，干涉了正常的4CL1 RNA的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，降低了4-香豆酸連接酶的活性，從而干擾了木質(zhì)素的生物合成，降低了轉(zhuǎn)基因植物的木質(zhì)素含量。表6和圖8中，1-9為轉(zhuǎn)基因煙草植株。
表6.轉(zhuǎn)基因煙草木質(zhì)素平均含量對(duì)照表


實(shí)施例3、培育木質(zhì)素含量升高的毛白楊7411、毛白楊741的轉(zhuǎn)化將構(gòu)建好的毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因植物二元表達(dá)載體PBI4CIp-4CI1，按改進(jìn)的An方法，直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，在Sm 125mg/L和Km 50mg/L的YEB培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，并挑取單克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到陽性克隆。
含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌LBA4404在YEB培養(yǎng)基(Sm 100mg/l，Km50mg/L)中28℃震蕩培養(yǎng)到OD600＝0.6-0.8，按1％-2％的比例用新鮮的YEB培養(yǎng)基(Sm 100mg/L)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)到OD600＝0.2-0.3。將毛白楊741無菌苗的葉片剪下，切成0.5-1.0cm的小塊，在菌液中浸泡10min，其間不斷搖動(dòng)，使薄片與菌液充分接觸，取出，用無菌濾紙吸干表面菌液，放在毛白楊741葉片分化培養(yǎng)基上-MS培養(yǎng)基(0.1mg/LNAA，1.0mg/L BA)，28℃暗培養(yǎng)4天，將外植體轉(zhuǎn)移到含100mg/L Km，250mg/L Car(羧卞霉素)的葉片分化培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基(0.1mg/L NAA，1.0mg/L BA)，28℃繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)將未轉(zhuǎn)化的組織同樣處理作為負(fù)對(duì)照。每隔14天換一次培養(yǎng)基。當(dāng)莖長(zhǎng)到3-5cm時(shí)，轉(zhuǎn)到含有卡那霉素和羧芐霉素的生根培養(yǎng)基1/2MS培養(yǎng)基(0.3mg/LNAA，1.0mg/L BA)中生根，結(jié)果得到再生苗20株。
2、轉(zhuǎn)基因毛白楊741的southern雜交按照常規(guī)方法提取轉(zhuǎn)基因毛白楊741和非轉(zhuǎn)基因毛白楊741的總DNA，以非轉(zhuǎn)基因毛白楊741為對(duì)照，使用SmaI限制性內(nèi)切酶在30℃酶解10小時(shí)后，1％瓊脂糖凝膠電泳，將電泳膠放在10倍體積的變性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)中震蕩40min，再在10倍體積的中和液(1.5M NaCl，0.5M Tris-Cl，pH7.0)中震蕩40min，使用20×SSC進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)膜過夜，用2×SSC洗膜，于80℃干燥2小時(shí)。用1ug由PCR得到的4CL1基因片段作探針，加蒸餾水至16ul，沸水浴10min，迅速置于冰水中5min。加入2ulDIG-HIGH PRIME，混勻。37℃保溫1h，加入0.2M EDTA(PH＝8.0)，混勻。預(yù)熱雜交液(地高新試劑盒中自帶的雜交液)至42℃。預(yù)雜交30min。取DNA探針(探針用量為25ng/ml雜交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。將變性探針DNA加入雜交液中混勻與雜交膜一起放入雜交袋中。除去氣泡，封口，42℃過夜。取出雜交膜用50ml 2×SSC，0.1％SDS清洗2次，每次5min。100ml 0.5×SSC，0.1％ SDS 50℃清洗2次，每次5min。用100ml洗滌液-100ml馬來酸緩沖液(Maleic acid buffer)(0.1M馬來酸，0.15M NaCl，pH7.5)中加入0.3ml tween20清洗1-5min，加入80ml封閉液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用20ml抗體液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用100ml洗滌液清洗2次，每次15min。用20ml檢測(cè)液平衡2-5分鐘，將雜交膜放在新雜交袋中，加入CSPD-ready-to use 1ml除氣泡，保溫4分鐘。除去CSPD-ready-to use，封口，夾X光片，室溫放置1小時(shí)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因毛白楊741中出現(xiàn)一條1700bp的帶，而未轉(zhuǎn)基因毛白楊741則沒有這條帶，只有一條3350bp的條帶，此條帶是毛白楊741自身帶有的含有內(nèi)含子的4Cl1基因，證明該4CL1基因已經(jīng)插入轉(zhuǎn)基因毛白楊741中3、轉(zhuǎn)基因毛白楊741 4CL1酶活性的測(cè)定將一年生的轉(zhuǎn)基因毛白楊741葉片在液氮下粉碎，用提取緩沖液(0.2M Tris-HClpH7.5，8mM MgCl2，5mM DTT，30％甘油，1ug/ml亮抑酶肽(Leupeptin))提取，提取液在18000g、4℃離心15min，上清液用于酶活性分析。使用BSA做標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)蛋白粗提液定量。1ml酶反應(yīng)液中包括0.2M Tris-HCl，pH7.5，8mM MgCl2，0.8mMATP，0.1mM底物(4-香豆酸)和25-30ul粗提液，于24℃反應(yīng)12分鐘，然后測(cè)定A333的增加。每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表7所示，表明轉(zhuǎn)基因的楊樹的葉片的酶活性有所降低。
表7.轉(zhuǎn)基因毛白楊741葉片中4CL1酶活性分析

4、轉(zhuǎn)毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因毛白楊741葉片的木質(zhì)素、纖維素含量分析按照文獻(xiàn)(willis.A.lignin.Methods in Enzymology，1988，161；13-30)描述的方法測(cè)定了一年生轉(zhuǎn)基因毛白楊741與野生毛白楊741植株葉片的硫酸木質(zhì)素及纖維素含量，結(jié)果如表8所示，表明4CL1啟動(dòng)子啟動(dòng)的4CL1基因可以在一定程度上改變毛白楊741的葉片的木質(zhì)素和纖維素含量。
表8.轉(zhuǎn)基因毛白楊741葉片中木質(zhì)素、纖維素含量分析

序列表<160>2<210>1<211>2893<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gaagcttgac ggtggcatga acacaaagca aagagaagtt aggtcactcc tcctttttat60atatatattt atatatatat atatatatat agatatgcat gaggaccatg gctatgatga120aggttaatag ggtagttgtg atagagatat gtccagcact agttttttgt tggtgtgatc180tctcatgatg acgggaaaat tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata240tataattaat tattctctct aattttgtaa aataaattta aaaggtcaat gtgaggtgac300cagttgtcaa atgaccactc gacttggggg catgatgatt tttcgaatca caactcaatt360tgaaaactaa aattaaaaaa gatttagatt attaaattat taggttaatt cacgggttgg420ctaatcaatt attgttaatt aaaatgatag tatttttgat aatttaatta aaatttaatt480ggatttgaat gaatcaatta cattacaaaa cctaatcaaa ttaatatctt atgtgatata540attagaaata taaatgatta acatttaaat ctcgagtttc tcttataaaa aacttgtgta600attgggctgg atttaacagc tattattcaa actggccaag acaactatta aaattaataa660ttaatttttt tcaaataaag cacttcctaa ttgttaaaat atatgtctaa acactaacaa720taaaatttat ttgtgtatat taggcagtag gtgagaggag agacacaggt gctgacaaat780aaattagtgc ataaaatata atggattggt ggtctgtgaa aagcaagtgg aggacaagcc840acctctctca agtcaaaagg ccactttcac aaccaaccca aatgggaacc caccaccgtt900cctcgccatt aaaatcccta atctcaccaa cccaactcca cagattcttc accaaacgca960actgattttt caatcaatgt tttccctata ttacccccca acaactcata ataccccatt1020tgtcctttca ccaacccccg tcctccgtgc cagccatttc tatatcagca tggatgctct1080gcactctgct ttctcaggtc tcctaccatt gaaaaacaga gagcacctaa aactcgccac1140tgcagcgcaa tggacgccac aatgaatcca caagaagaat tcatctttcg ctcaaaatta1200
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<212>DNA<213>人工序列<220>
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權(quán)利要求
1.調(diào)控植物木質(zhì)素含量的一種方法，是將含有毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，得到木質(zhì)素含量升高的植物；將含有毛白楊4CL1啟動(dòng)子-反義4CL1融合基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，得到木質(zhì)素含量降低的植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述毛白楊4CL1啟動(dòng)子-反義4CL1融合基因具有序列表中序列2的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于用于構(gòu)建所述含有毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因的表達(dá)載體或含有毛白楊4CL1啟動(dòng)子-反義4CL1融合基因的表達(dá)載體的出發(fā)載體為Ti類質(zhì)粒載體和病毒載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述出發(fā)載體為Ti類質(zhì)粒載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述Ti類質(zhì)粒載體為雙元載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述雙元載體為pBI121或pBI101。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述含有毛白楊4CL1啟動(dòng)子-4CL1融合基因的表達(dá)載體為PBl4Clp-4Cl1；所述含有毛白楊4CL1啟動(dòng)子-反義4CL1融合基因的表達(dá)載體為PBMZFA2。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述植物為草本植物或木本植物；所述草本植物優(yōu)選為煙草，所述木本植物優(yōu)選為楊樹。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法或花粉管通道法，優(yōu)選為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。
全文摘要
本發(fā)明公開了調(diào)控植物木質(zhì)素含量的一種方法。本發(fā)明所提供的調(diào)控植物木質(zhì)素含量的方法，是將含有毛白楊4CL1啟動(dòng)子－4CL1融合基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，得到木質(zhì)素含量升高的植物；將含有毛白楊4CL1啟動(dòng)子－反義4CL1融合基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，得到木質(zhì)素含量降低的植物。本發(fā)明通過在植物細(xì)胞中引入毛白楊4CL1啟動(dòng)子－4CL1融合基因或毛白楊4CL1啟動(dòng)子－反義4CL1融合基因，來生產(chǎn)木質(zhì)素含量升高或降低的轉(zhuǎn)基因植物特別是轉(zhuǎn)基因樹木，為培育木質(zhì)素含量降低或升高的植物以及改良樹木材性提供了一條重要的途徑。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1733924SQ20041007059
公開日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2004年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月10日
發(fā)明者蔣湘寧, 陸海, 趙艷玲, 陳雪梅, 曾慶銀, 楊雪萍 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)