專利名稱：一種靜電紡絲固定化漆酶電極的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種酶電極的制備方法，及將該酶電極用于水中污染物檢測的電化學 檢測領域。具體涉及一種用于檢測水中污染物的酶電極的制作方法以及將所制備的酶電極 應用于水中低濃度氯酚類物質的檢測。
背景技術：
固定化酶傳感器集酶反應的專一性、固定化酶的長期穩(wěn)定性、電化學分析快速靈 敏的特點于一體，正日益引起人們的關注，許多有理論意義和實用價值的酶電極正在不斷 被開發(fā)出來。其在環(huán)境中的應用主要是對于酚類物質的檢測。90年代就有學者使用漆酶 和酪氨酸酶雙酶體系修飾的玻碳電極共同用于酚類化合物的連續(xù)流分析。隨后，有研究 報道酪氨酸酶通過交聯(lián)法被固定于3-巰基丙酸自組合單層膜上制備的酶電極可在連續(xù) 流模式下同時測定10種酚類化合物。Wang和Hasebe使用八種交聯(lián)劑將酪氨酸酶共價 固定在氨基化的碳電極表面，其中戊二醛交聯(lián)方法顯示出好的靈敏度，操作穩(wěn)定性以及儲 存穩(wěn)定性，并且此法應用于兒茶酚和4-氯酚的檢測顯示出低的檢測限以及重復利用性。 Jarosz-Wilkolazka等研究發(fā)現(xiàn)基于來源于C. unicolor的漆酶修飾電極制備的生物傳感 器對于兒茶酚濃度的動力學變化響應迅速，可以被很好的應用于連續(xù)流模式下檢測酚類化 合物。Korkut等在不使用交聯(lián)劑的情況下通過電聚合過程將辣根過氧化物酶固定于碳納 米管/聚吡咯納米生物材料修飾的電極上，研究了生物傳感器對18種酚類衍生物的線性范 圍、靈敏度和檢測限，發(fā)現(xiàn)生物傳感器對所測試的這些酚類衍生物都具有低的檢測限，并且 響應時間快(小于2s)。目前，傳統(tǒng)的酶固定化方法主要有吸附法、共價結合法、交聯(lián)法和包埋法。吸附固 定是最簡單的方法，是通過氫鍵、疏水鍵和η -電子親和力等物理作用力將酶直接固定于 不溶性載體上的一種固定化方法。此方法具有酶活性中心不易被破壞和酶高級結構變化少 的優(yōu)點，但這種方法負載的酶與載體相互作用力弱、酶易脫落。共價結合時通過對電極進行 化學修飾，再利用酶蛋白分子中可以進行結合的-NH、-OH、-SH、-COOH等活性基團與電極表 面上的反應基團之間形成共價鍵連接。此法制備的酶電極響應速度快、穩(wěn)定性好，酶與載體 之間的連接很牢固，一般不會因底物濃度高或存在鹽類等原因而輕易脫落，利于連續(xù)使用。 但由于采用了比較激烈的反應條件，從而不能得到比活力高的固定化酶。包埋法是指將聚 合物的單體和酶溶液混合后，借助聚合促進劑(包括交聯(lián)劑)的作用使單體進行聚合，從而 將酶包埋于聚合物中的固定化方法。此法對大分子底物不適用，且儲存穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性 差。交聯(lián)法即利用雙功能或多功能試劑在酶分子之間或酶分子與載體間進行交聯(lián)反應，以 共價鍵制備固定化酶。此法操作簡便，但酶回收率不高。靜電紡絲技術是一種應用高壓電使帶電荷的高分子溶液或熔體在靜電場中流動 或變形，然后由于溶劑蒸發(fā)或熔體冷卻而固化，最終產生直徑數(shù)十納米到幾十毫米的均勻 纖維的過程。靜電紡絲納米纖維膜由于具有大的比表面積、高孔隙率和高吸附性能而被認 為是一種較為理想的酶固定化載體。迄今為止，兩種主要的方法被用于通過靜電紡絲將酶
3和聚合物形成納米纖維。一種方法是將酶后固定在電紡納米纖維的表面。另一種方法是直 接將酶與不同聚合物溶液進行混合，一同進行靜電紡絲，即本發(fā)明中所涉及的原位電紡。這 種方法可以使保護酶分子免受極端條件限制的纖維內部空間的優(yōu)勢得到充分發(fā)揮，從而提 高酶活。通過原位靜電紡絲的方法固定化漆酶構筑生物傳感器用于污染物的檢測尚未見文 獻報道。因此，通過原位靜電紡絲的方法制備固定有酶的超細纖維在生物傳感器的制備方 面將有很現(xiàn)實的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種通過靜電紡絲技術直接將漆酶固定于電極表面從而 能高效、穩(wěn)定檢測環(huán)境中氯酚類物質的方法。本發(fā)明所提供的酶電極的制備方法條件溫和， 簡單易行，穩(wěn)定性好，特別利于快速安置，并且運用此法制備的漆酶電極對氯酚類物質的檢 測具有靈敏、穩(wěn)定、準確的優(yōu)點。1.本發(fā)明的第一方面，涉及一種靜電紡絲固定化酶電極的制備方法，具體包括下 列步驟1)電極的預處理玻碳電極表面先經金剛砂紙粗研細磨后，再用粒徑0. 05 μ m的α -Al2O3粉在平板 玻璃上進行拋光，每次拋光后先洗去表面污物，再移入超聲水浴中清洗，每次2 3min，重 復三次，直至清洗干凈；最后用乙醇、Vffig: V7l^jl 1的硝酸和水徹底洗滌，得到新鮮的 電極表面，而后置于0. 2mol/L H2SO4中經循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定；2)原料溶液的配制將分子量為10萬的聚乙烯醇顆粒和嵌段共聚物溶于超純水中，均勻混合后加熱 攪拌至澄清；將Ig氯金酸一次性溶解于新鮮的超純水中，用IOOmL容量瓶配成的水溶 液；將Ig檸檬酸鈉一次性溶解于新鮮的超純水中，用IOOmL容量瓶配成的水溶液；向質 量分數(shù)為0. 的氯金酸中加入一定量的檸檬酸三鈉溶液以制備納米金水溶液；以pH 值為4. 4的磷酸鹽緩沖液為溶劑，配制濃度一定的漆酶溶液；3)原位靜電紡絲制備固定化漆酶電極向聚乙烯醇/嵌段共聚物的水溶液中加入一定量的納米金水溶液和新鮮的漆酶 溶液，攪拌均勻后，將此混合溶液注入帶有針頭的5mL玻璃注射器，將注射器固定在注射泵 上，接地對電極與玻碳電極相連形成14. 4kV電壓，針頭到接收板的距離設定為9cm，控制紡 絲流速為0. 2mL/h，紡絲時間5h，即得到所述靜電紡絲固定化漆酶電極。上述步驟2)中所使用的嵌段共聚物為P123、F108、F127之一種。其中， P123的分子式為PE020-PP070-PE020，分子量為5750克/摩爾；F108的分子式為 PE0132-PP050-PE0132,分子量為 15500 克 / 摩爾；F127 的分子式為 PE0106-PP070-PE0106， 分子量為14600克/摩爾；三者均為聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚醚。優(yōu)選上述步驟2)中聚乙烯醇的醇解度為98 99%，平均聚合度為2400 2500， 其在水溶液中的質量分數(shù)為6%。優(yōu)選上述步驟2)中氯金酸的用量為0.5mL，l%檸檬酸的用量為0.25 4. OmL，制備的納米金的粒徑為5 120nm，更優(yōu)選25nm。本發(fā)明中，所使用的漆酶是本技術領域人員所熟悉的，其獲得也是通過較常規(guī)的
4微生物發(fā)酵，如可以取自白腐真菌(T. galIica)、佛羅里達側耳(Pleurotus florida)、雜色 云芝(Polystictusversicoloy)等微生物的分泌物。漆酶還可以通過供應商獲得。2.本發(fā)明的另一方面，涉及通過上述制備方法制備的靜電紡絲固定化漆酶電極。3.本發(fā)明的再一方面，涉及上述靜電紡絲固定化漆酶電極在水中氯酚類物質的檢 測中的用途。其中，所述的氯酚類物質為2，4- 二氯酚、4-氯酚、2-氯酚、2，4，6_三氯酚和/或五 氯酚。其檢測方法為將所述固定化漆酶電極為工作電極，以飽和甘汞電極為參比電極，鉬 電極為對電極構筑三電極體系，置于以PH值為6. O的0. 2mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉 緩沖溶液配制的一定濃度的氯酚溶液中，反應3 5min進行循環(huán)伏安掃描。本發(fā)明的優(yōu)點在于1.本發(fā)明所采用的聚乙烯醇是一種可生物降解材料，用于環(huán)境污染物治理領域不 會引入二次污染；2.本發(fā)明所采用的聚乙烯醇在靜電紡絲成膜后其膜的機械性能優(yōu)良，熱穩(wěn)定好；3.本發(fā)明利用原位靜電紡絲技術將漆酶直接固定于玻碳電極表面，從而解決了后 固定化不能很好的保護包裹于纖維內部的酶分子免受極端條件限制的纖維內部空間優(yōu)勢 的發(fā)揮；4.以電紡技術原位固定漆酶制備漆酶電極，方法簡單易行，受環(huán)境條件限制，可安 置于多種界面，適應性強；5.此制備的漆酶電極對氯酚類物質的檢測具有實時、響應速度快、靈敏度高且成 本較低等特點。


圖1為聚乙烯醇電紡纖維固定化漆酶的掃描電子顯微鏡圖像；圖2為使用本發(fā)明的聚乙烯醇電紡纖維固定化漆酶電極檢測水中2，4_ 二氯酚的 循環(huán)伏安曲線圖，其中，橫坐標代表相對于飽和甘汞電極(SCE)的電位，單位為V，縱坐標代 表響應電流單位為微安(μΑ)；圖3為使用本發(fā)明的聚乙烯醇電紡纖維固定化漆酶電極檢測水中4-氯酚的循環(huán) 伏安曲線圖，其中，橫坐標代表相對于飽和甘汞電極(SCE)的電位，單位為V，縱坐標代表響 應電流單位為微安(μΑ)。
具體實施例方式以下實施實例對本發(fā)明做更詳細的描述，但所述實施不構成對本發(fā)明的限制。實施例11)玻碳電極表面先經金剛砂紙粗研細磨后，再用粒徑0. 05 μ m的α -Al2O3粉在平 板玻璃上進行拋光，每次拋光后先洗去表面污物，再移入超聲水浴中清洗，每次2 3min， 重復三次，直至清洗干凈。最后用乙醇、Vffig: V7l^jl 1的硝酸和水徹底洗滌，得到新鮮 的電極表面，而后置于0. 2mol/L H2SO4中經循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定；2)將分子量為10萬的聚乙烯醇顆粒和嵌段共聚物F108溶于超純水中，均勻混 合后加熱攪拌至澄清，其中聚乙烯醇的質量分數(shù)為6%，嵌段共聚物F108的質量分數(shù)為
50. 3% ；3)將Ig氯金酸一次性溶解于新鮮的超純水中，用IOOmL容量瓶配成的水溶 液；將Ig檸檬酸鈉一次性溶解于新鮮的超純水中，用IOOmL容量瓶配成的水溶液；向質 量分數(shù)為0. 的氯金酸中加入0. 5mL的的檸檬酸三鈉溶液以制備納米金水溶液；4)以pH值為4. 4的磷酸鹽緩沖液為溶劑，配制濃度為5mg/mL的漆酶溶液；5)向5mL聚乙烯醇/嵌段共聚物的水溶液中加入400 μ L納米金水溶液和400 μ L 新鮮的5mg/mL的漆酶溶液，攪拌均勻后，將此混合溶液注入帶有針頭的5mL玻璃注射器，將 注射器固定在注射泵上，接地對電極與玻碳電極相連形成14. 4kV電壓，針頭到接收板的距 離設定為9cm，控制紡絲流速為0. 2mL/h，紡絲時間5h，即得到所述靜電紡絲固定化酶電極。6)以此制備的漆酶電極作為工作電極，以飽和甘汞電極為參比電極，鉬電極為對 電極構筑三電極體系，電解液為PH值6. 0的0. 2mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液 配制的濃度分別為 25 μ mol/L、50 μ mol/L、60 μ mol/L、70 μ mol/L、80 μ mol/L、100 μ mol/L 及200 μ mol/L的2，4- 二氯酚溶液中，應用CHI660D (北京華科普天)電化學工作站進行循 環(huán)伏安掃描，實驗表明，此酶電極具有優(yōu)異的性能，響應時間快(50s)，對2，4- 二氯酚的檢 測線性范圍1 200 μ mol/L。實施例2以80 μ mol/L的4_氯酚溶液來代替實施例1中的2，4_ 二氯酚溶液，其他條件同 實施例1，實驗表明，此漆酶電極對4-氯酚有良好的響應。實施例3以50 μ mol/L的2_氯酚溶液來代替實施例1中的2，4_ 二氯酚溶液，其他條件同 實施例1，實驗表明，此漆酶電極對2-氯酚有良好的響應。實施例4以50 μ mol/L的2，4，6_三氯酚溶液來代替實施例1中的2，4_ 二氯酚溶液，其他 條件同實施例1，實驗表明，此漆酶電極對2，4，6-三氯酚有良好的響應。實施例5以50 μ mol/L的五氯酚溶液來代替實施例1中的2，4_ 二氯酚溶液，其他條件同實 施例1，實驗表明，此漆酶電極對五氯酚有良好的響應。
權利要求
靜電紡絲固定化酶電極的制備方法，其特征在于包括下列步驟1)玻碳電極的預處理玻碳電極表面先經金剛砂紙粗研細磨后，再用粒徑0.05μm的α Al2O3粉在平板玻璃上進行拋光，每次拋光后先洗去表面污物，再移入超聲水浴中清洗，每次2～3min，重復三次，直至清洗干凈；最后用乙醇、V硝酸∶V水為1∶1的硝酸和水徹底洗滌，得到新鮮的電極表面，而后置于0.2mol/L H2SO4中經循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定；2)原料溶液的配制將分子量為10萬的聚乙烯醇顆粒和嵌段共聚物溶于超純水中，均勻混合后加熱攪拌至澄清；將1g氯金酸一次性溶解于新鮮的超純水中，用100mL容量瓶配成1％的水溶液；將1g檸檬酸鈉一次性溶解于新鮮的超純水中，用100mL容量瓶配成1％的水溶液；向質量分數(shù)為O.1％的氯金酸中加入一定量1％的檸檬酸三鈉溶液以制備納米金水溶液；以pH值為4.4的磷酸鹽緩沖液為溶劑，配制濃度一定的漆酶溶液；3)原位靜電紡絲制備固定化漆酶電極向聚乙烯醇/嵌段共聚物的水溶液中加入一定量的納米金水溶液和新鮮的漆酶溶液，攪拌均勻后，將此混合溶液注入帶有針頭的5mL玻璃注射器，將注射器固定在注射泵上，接地對電極與玻碳電極相連形成14.4kV電壓，針頭到接收板的距離設定為9cm，控制紡絲流速為0.2mL/h，紡絲時間5h，即得到所述靜電紡絲固定化漆酶電極。
2.根據(jù)權利要求1中所述的方法，其特征在于原料溶液的配制步驟中所述的嵌段共 聚物為P123、F108、F127之一種；其中，P123的分子式為PE020-PP070-PE020,分子量為 5750克/摩爾；F108的分子式為PE0132-PP050-PE0132，分子量為15500克/摩爾；F127 的分子式為PE0106-PP070-PE0106，分子量為14600克/摩爾；三者均為聚氧乙烯-聚氧丙 烯-聚氧乙烯嵌段聚醚。
3.根據(jù)權利要求1中所述的方法，其特征在于原料溶液的配制步驟中所述的聚乙烯 醇的醇解度為98 99%，平均聚合度為2400 2500，其在水溶液中的質量分數(shù)為6% 8%。
4.根據(jù)權利要求1中所述的方法，其特征在于原料溶液的配制步驟中所述的納米金 水溶液中，氯金酸的用量為0. 5mL，檸檬酸的用量為0. 25 4. OmL，制備的納米金的 粒徑范圍為5 120nm。
5.一種如權利要求1 4任一所述的制備方法制備的靜電紡絲固定化漆酶電極。
6.如權利要求5所述的靜電紡絲固定化漆酶電極在水中氯酚類物質的檢測中的用途。
7.根據(jù)權利要求6中所述的用途，其特征在于氯酚類物質為2，4-二氯酚、4-氯酚、 2-氯酚、2，4，6-三氯酚和/或五氯酚。
全文摘要
本發(fā)明屬于靜電紡絲纖維固定化酶電極進行氯酚類物質電化學檢測領域，涉及一種對氯酚類有響應的漆酶電極的制備以及運用此電極進行氯酚類物質的檢測。具體的以環(huán)境友好型高分子聚合物聚乙烯醇為原料，采用原位靜電紡絲技術進行漆酶固定化制備漆酶電極。此固定化漆酶電極對低濃度的2，4-二氯酚、4-氯酚、2-二氯酚、2，4，6-三氯酚和五氯酚均有響應，根據(jù)其響應的還原電流峰位置可以進行氯酚類物質的檢測。
文檔編號D01F1/10GK101915797SQ20101023762
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月27日 優(yōu)先權日2010年7月27日
發(fā)明者劉佳, 殷立峰, 江帆, 牛軍峰 申請人:北京師范大學