專利名稱：使用蛋白酶制備皮革的方法和使用它處理來自皮革加工的廢物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用蛋白酶HY-3制備皮革的方法和使用它處理來自皮革加工的廢物的方法。更具體地，本發(fā)明涉及制備皮革的方法，其中將從Aranicola proteolyticus HY-3菌株生產(chǎn)的蛋白酶HY-3加至浸濕，浸灰，脫灰和軟化步驟；和使用蛋白酶HY-3處理來源于浸濕和浸灰步驟的廢水和固體廢物，和來自浸灰，脫灰，軟化和整理步驟的固體廢物的方法，其具有制備優(yōu)秀品質(zhì)的皮革和廢物的有利于環(huán)境的處理或再循環(huán)的優(yōu)點(diǎn)。
背景技術(shù)：
通常，作為需要昂貴的設(shè)備和技術(shù)的粗皮加工工業(yè)，皮革工業(yè)是決定皮革制品如鞋，袋，服裝和皮帶的質(zhì)量的主要工業(yè)(chiefindustry)。在皮革工業(yè)中，當(dāng)將各種動(dòng)物的生皮或獸皮進(jìn)行復(fù)雜的皮革制備過程時(shí)，生產(chǎn)終產(chǎn)品，即皮革。將使用物理化學(xué)和生物方法的皮革制備方法分為需要水的濕法和干法。
濕法包含為了防止由細(xì)菌或霉菌導(dǎo)致生皮腐敗的鹵腌，為了去除生皮多余成分的浸濕，為了產(chǎn)生用石灰處理的粗皮的浸灰，為了去除石灰的脫灰，為了生物處理多余成分的軟化，為了降低pH值的酸浸，中和，復(fù)鞣，染色和乳液加油(或脂)的步驟。
更具體地，在浸濕步驟中，去除大量附著于生皮或獸皮的多余蛋白質(zhì)，和鹽類或污物。在浸灰步驟中，使用石灰去除毛發(fā)和非必需蛋白質(zhì)。在脫灰步驟中，去除在先前步驟中使用的石灰。在用于徹底的表面清洗的軟化步驟中，去除多余蛋白質(zhì)。一種保留毛發(fā)的方法，其是一種有利于環(huán)境的皮革制備方法，將蛋白水解酶用于浸灰和脫灰步驟。在皮革制備過程中浸灰步驟極大影響COD(化學(xué)需氧量)。
盡管主要是輕工業(yè)，皮革工業(yè)是有代表性的產(chǎn)生污染的工業(yè)，因?yàn)榇罅繌U水和固體廢物導(dǎo)致水污染和土壤污染。在濕法中使用它們之后將在各個(gè)步驟中使用的大部分化學(xué)品作為廢水排放。
為了從粗皮制備皮革制品，使用了大量化學(xué)品。另外，使用大量水，活化劑，石灰，硫化物，鹽類，酸類，鉻，合成單寧，染料，乳液加油(或脂)試劑，粘合劑，補(bǔ)充劑，增亮劑和溶劑。然而，通過在浸灰步驟中過度使用去除粗皮中各種非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)所需的硫化物和堿金屬，廢水污染變得嚴(yán)重。
在從皮革制備中產(chǎn)生的廢水中，包含大量有機(jī)和無機(jī)物質(zhì)，如高濃度的含鹽硫化物和有機(jī)物質(zhì)，從而增加了污染水平。另外，在皮革制備中，浸灰，脫灰，鞣革和染色步驟需要大量的水，因而將用過的水作為廢水排放。排放的廢水包含具有高污染負(fù)荷的獸皮碎屑，毛發(fā)，可溶性蛋白和中間降解產(chǎn)物，流入廢水蓄水池。該廢水特征在于存在高毒性重金屬一鉻，并且BOD(生物需氧量)和COD非常高，其是因?yàn)榇罅康挠袡C(jī)和無機(jī)物質(zhì)，和浮游物。
為了純化廢水，需要各種設(shè)備和試劑，從而導(dǎo)致高三廢水處理成本。此外，從皮革制備過程中產(chǎn)生的生皮的各種固體廢物，如刮肉碎屑，毛皮碎屑，刮皮碎屑，修剪碎屑相當(dāng)于50％或更大的粗皮重量。該固體廢物的處理成本增加了生產(chǎn)成本。
發(fā)明概述本發(fā)明人對(duì)皮革制備方法和廢物處理方法進(jìn)行徹底和深入的研究，其目的在于避免在現(xiàn)有技術(shù)中遇到的問題，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用蛋白水解酶制備皮革和處理廢物，由此可以獲得高質(zhì)量皮革并且可以減少來自皮革加工的廢物的量并可再循環(huán)廢物，從而完成本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供使用由Aranicola proteolyticus HY-3菌株生產(chǎn)的蛋白酶HY-3制備皮革的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供使用由Aranicola proteolyticus HY-3菌株生產(chǎn)的蛋白酶HY-3處理來自皮革加工的廢物的方法。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供使用由Aranicola proteolyticus HY-3菌株生產(chǎn)的蛋白酶HY-3制備皮革的方法。
在本發(fā)明的另一方面，提供使用由Aranicola proteolyticus HY-3菌株生產(chǎn)的蛋白酶HY-3處理來自皮革加工的廢物的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是顯示能夠使用本發(fā)明蛋白酶HY-3的皮革制備方法的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是顯示在使用本發(fā)明的蛋白酶HY-3時(shí)從皮革洗脫的蛋白質(zhì)的量的曲線圖；●對(duì)照■上清液▲濃縮的上清液發(fā)明詳述本發(fā)明關(guān)于通過使用由Aranicola proteolyticus HY-3菌株生產(chǎn)的蛋白酶HY-3制備皮革的方法。
本發(fā)明的方法包含浸濕，浸灰，脫灰和軟化的步驟(參見圖1)。
至于用于本發(fā)明皮革制備方法的蛋白酶HY-3，從培養(yǎng)Aranicolaproteolyticus HY-3菌株的培養(yǎng)基中分離微生物，從而使用剩余的包含酶的上清液，或者使用配制為制劑的蛋白酶HY-3與用于提高酶的穩(wěn)定性的添加劑或者每步引入的物質(zhì)的混合物。
優(yōu)選以0.1-15重量％的量將本發(fā)明的蛋白酶HY-3加至浸濕，浸灰，脫灰和軟化步驟，并且其是來自微生物培養(yǎng)基的去除微生物的含酶液體，或者可以是與用于提高酶穩(wěn)定性的添加劑或者每步引入物質(zhì)混合的制劑。
本發(fā)明的蛋白酶HY-3在37℃具有最大活性，在20-40℃具有75％或更高的相對(duì)活性。此外，該蛋白酶在pH8.0顯示最大活性，在pH7.0-9.5顯示80％或更高的相對(duì)活性(韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?000-5479)。通常，浸濕，浸灰和軟化步驟是在25-35℃和pH8-9下進(jìn)行，因此使用蛋白酶HY-3可以穩(wěn)定分解生皮中的蛋白質(zhì)。此外，當(dāng)將大量的鹽類加至浸濕，浸灰，脫灰和軟化步驟時(shí)，大部分蛋白水解酶的活性降低，而本發(fā)明的蛋白酶HY-3保持它的活性，即使在10％的高鹽濃度下，因此可以用于各個(gè)步驟。
通過使用蛋白酶HY-3，可以急劇減少常規(guī)使用的用于皮革制備的有機(jī)和無機(jī)化學(xué)品的量，從而可以進(jìn)行環(huán)境中性的皮革加工。
因此，可以將該蛋白酶HY-3用于皮革加工，特別是可以用于貫穿浸濕，浸灰，脫灰和軟化步驟的表皮，毛發(fā)和可溶性蛋白質(zhì)的去除。
在浸濕步驟中，當(dāng)將進(jìn)行揉鹽處理的動(dòng)物生皮或獸皮運(yùn)送至皮革加工廠時(shí)，為了去除各種污物和多余成分應(yīng)該將足量的水加至劃槽或桶中，其后在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)吸收于生皮組織中的水使得生皮組織能夠恢復(fù)活的動(dòng)物的正常生皮柔度。因此，可以分解附著在粗皮或獸皮的多余的可溶性蛋白質(zhì)，污物和毛發(fā)，然后通過蛋白酶HY-3的處理去除。通過該方法，獸皮組織變得光滑，可以容易的進(jìn)行接下來的浸灰步驟。
在強(qiáng)烈影響從皮革加工產(chǎn)生的廢水中COD的浸灰和脫灰步驟中，蛋白酶HY-3可以分解生發(fā)層細(xì)胞或毛根基底細(xì)胞(base cell)，其應(yīng)用不分解毛發(fā)的皮層而分解髓質(zhì)的原理。另外，去除毛根和毛發(fā)濾泡，這樣毛腔肯定膨脹，于是消除毛發(fā)，因此石灰和其它化學(xué)品可以容易地滲透，這樣可以減少化學(xué)品的處理量。
在軟化步驟中，蛋白酶HY-3去除粗皮中多余的蛋白質(zhì)并疏松皮膚組織，由此在軟化步驟后供應(yīng)的用于皮革加工的化學(xué)品可以容易地滲透于組織中并且提高了化學(xué)品和組織之間的粘合強(qiáng)度。因此，減少了該化學(xué)品所需的量，抑制了廢水中由未結(jié)合化學(xué)品導(dǎo)致的COD和BOD的增大。通過使用蛋白酶HY-3可以生產(chǎn)柔軟和柔順的皮革并可去除生皮上的污染物。由此，在染色時(shí)，改善了顏色的染色均勻性，因此減少了染料的量和極大提高了皮革商品的質(zhì)量。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供使用蛋白酶HY-3處理來自皮革制備過程的廢物的方法。
通過使用本發(fā)明的蛋白酶HY-3處理從浸濕，浸灰，脫灰，軟化和整理步驟產(chǎn)生的廢物(參見圖1)。
廢物可以以液態(tài)或固態(tài)的形式形成，并且還可以再循環(huán)。
作為適用于本發(fā)明皮革制備的蛋白酶HY-3，可以使用微生物培養(yǎng)基，將微生物從上述培養(yǎng)基中分離之后剩余的含酶液體，或者與用于增加酶穩(wěn)定性的添加劑或者每步引入物質(zhì)混合的配制的制劑。
為了處理來自皮革制備過程的廢物，將選自脂酶和淀粉酶中的一種與蛋白酶HY-3一起使用。
為了處理來自皮革制備過程的廢物，將生產(chǎn)蛋白酶HY-3的微生物的培養(yǎng)基，將微生物從上述培養(yǎng)基中分離之后剩余的含酶液體，或者與用于增加酶穩(wěn)定性的添加劑或者每步引入物質(zhì)混合的配制制劑加至在浸濕和浸灰步驟期間產(chǎn)生的廢水和固體廢物，在軟化步驟期間產(chǎn)生的固體廢物，和在整理步驟后的固體廢物之中。
從皮革制備中產(chǎn)生的廢物相當(dāng)于40-70重量％粗皮或獸皮的初始重量。大部分排放的固體廢物被歸類為工業(yè)廢物并因此燒盡或簡(jiǎn)單地掩埋。因此，從生產(chǎn)成本來看，這些固體廢物的處理成本相當(dāng)高。
可以通過蛋白酶HY-3處理的固體廢物的實(shí)例有在浸濕和浸灰步驟期間產(chǎn)生的來自粗皮的刮肉碎屑，修剪碎屑和毛發(fā)；在軟化步驟后的毛皮碎屑；和在最后染色后的整理步驟中產(chǎn)生的生皮碎屑。
在刮肉碎屑和修剪碎屑中，蛋白質(zhì)和脂類未完全分離并以混合狀態(tài)存在，其中脂類組分相當(dāng)于總組分的30-50％。對(duì)于刮肉碎屑和修剪碎屑，可以加入選自蛋白酶HY-3，脂酶或淀粉酶中的至少一種酶。
固體廢物，如從在浸灰步驟之后的軟化步驟產(chǎn)生的毛皮碎屑，包含大約40％的從皮革加工產(chǎn)生的總廢物。毛皮碎屑包含4.0％脂類，1.5％鈣，5.5％灰分，50-55％水和35-40％蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白酶HY-3，可用作金屬蛋白酶，當(dāng)金屬離子存在時(shí)它的活性增大。在1mM的鈣離子的存在下蛋白酶HY-3的活性增大約1.5倍，在其它金屬離子的存在下增大1.2-1.4倍。金屬離子如鈣離子在毛皮碎屑中大量存在，因此本發(fā)明的蛋白酶HY3有效分解毛皮碎屑中的蛋白質(zhì)。
為了從粗皮制備皮革商品，必須使用大量化學(xué)品。此外，使用水，活化劑，石灰，鹽類，酸類，鉻，合成單寧，染料，乳液加油(或脂)試劑，粘合劑，補(bǔ)充劑，增亮劑和溶劑。在浸灰步驟中過度使用去除生皮中各種非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)所需的硫化物和堿金屬導(dǎo)致嚴(yán)重的廢水污染。從皮革加工設(shè)備排放的廢水包括有機(jī)、無機(jī)和浮游物質(zhì)，其特征在于廢水中的BOD和COD非常高并且存在鉻，一種具有高毒性的重金屬。通過使用蛋白酶HY-3，可以減少活化劑，石灰，硫化物，鹽類，酸類和鉻的量。
同時(shí)，報(bào)道了使用蛋白水解酶的廢物再循環(huán)(韓國(guó)專利號(hào)1994-0007333)，然而，還未報(bào)道在廢物中使用產(chǎn)生蛋白酶的微生物分解蛋白質(zhì)。本發(fā)明的微生物即使在少量碳源和氮源的存在下也能茁壯成長(zhǎng)，由該微生物分泌的蛋白酶HY-3可以分解來自皮革加工的固體廢物。使用蛋白酶HY-3，可以將廢物中的蛋白質(zhì)水解成肽來制備食品，化妝品和工業(yè)產(chǎn)品。另外，可以將該蛋白酶用于在浸濕和浸灰步驟期間產(chǎn)生的含鹽廢水，由此通過蛋白酶HY3的分解可以再循環(huán)廢水中的蛋白質(zhì)。
此外，通過切割膠原蛋白分子中的多肽鏈可以將廢皮革用作飼料和可食用明膠。通過將蛋白酶HY-3用于固體皮革廢物的處理，可以防止環(huán)境污染并且可以獲得二級(jí)產(chǎn)品。
實(shí)施例借助下列實(shí)施例可以獲得對(duì)本發(fā)明更好的理解，闡明所述實(shí)施例是為了舉例說明而不可理解為是來限制本發(fā)明。
實(shí)施例1生產(chǎn)蛋白酶HY-3為了生產(chǎn)蛋白酶HY-3，將用于培養(yǎng)微生物的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基在高壓下121℃滅菌20分鐘，然后基于培養(yǎng)基總體積加入0.1-5體積％的量的生產(chǎn)蛋白酶HY-3的Aranicola proteolyticus HY-3菌株(KCTC 0268BP)并在25-30℃培養(yǎng)25-30小時(shí)。將培養(yǎng)基進(jìn)行膜過濾，這樣將上清液從生物量中分離。當(dāng)需要時(shí)，通過10kDa的膜過濾將上清液濃縮3-10倍。
實(shí)施例2分析洗脫自使用蛋白酶HY-3的浸灰和脫灰步驟的蛋白質(zhì)為了研究在極大影響COD的浸灰和脫灰步驟中蛋白酶HY-3的作用，實(shí)施下列程序。
具體地，將20g生皮切割成適當(dāng)?shù)拇笮?，放?0ml試管中，然后向其中加入10ml水。此后，加入0.5％亞硫酸氫鈉和0.5％硫酸銨并且在室溫下反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)后，將0.2％洗滌劑和0.5％脫脂劑加至得到的溶液中并在室溫下反應(yīng)30分鐘。將三支試管分為不含蛋白酶HY-3的對(duì)照，和含有如上述實(shí)施例1中制備的上清液和濃縮的上清液。使每支試管在室溫靜置，并獲得樣品。使用改進(jìn)Bradford法(Bradford，M.，Anal.Biochem.，1976，72，248)的蛋白質(zhì)分析試劑盒(Bio-rad，USA)來進(jìn)行從樣品洗脫的蛋白質(zhì)的分析。
從實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，包含蛋白酶HY-3的試管具有更多的洗脫蛋白質(zhì)，此外培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基的濃縮上清液比未濃縮上清液洗脫的蛋白質(zhì)要多的多。
實(shí)施例3在軟化步驟使用蛋白酶HY-3為了在皮革加工中提高蛋白酶HY-3的穩(wěn)定性和性能，將蛋白酶配制為制劑并從而用在軟化步驟中。
將凍干的本發(fā)明的蛋白酶HY-3以0.5-10重量％的量加至40-50％氯化銨(NH4Cl)，40-50％硫酸銨((NH4)2SO4)，0.005-0.01％氯化鈣(CaCl3)和0.025-0.1％乳糖之中。為了檢驗(yàn)配制的蛋白酶HY-3的軟化作用，將生皮進(jìn)行脫灰步驟，然后進(jìn)行使用不同酶制劑的軟化步驟，其后對(duì)生皮的表面狀態(tài)進(jìn)行觀察。另外，將生皮進(jìn)行鞣革和整理步驟，然后觀察表面狀態(tài)。作為在用于比較的軟化步驟中使用的蛋白酶制劑，使用Amoron(ChungmuFermentation，Korea)和Oropon K(TFL，Germany)。實(shí)驗(yàn)步驟在下面表1中總結(jié)。
表1

在軟化步驟加入本發(fā)明的蛋白酶HY-3和對(duì)照(Amoron和Oropon K)。更具體地，在脫灰步驟，加入上面表1中所示化學(xué)品1小時(shí)，然后在軟化步驟加入0.2重量％乳酸和0.1-15重量％蛋白酶。軟化步驟進(jìn)行80分鐘，然后進(jìn)行使用包含鹽分的強(qiáng)酸化學(xué)品處理的酸浸步驟12小時(shí)或更久，含鉻的鞣革步驟進(jìn)行大約12小時(shí)，接著干燥生皮。此后，觀察生皮。
為了比較使用的酶制劑在每步的作用，將生皮進(jìn)行脫灰，軟化和酸浸步驟而僅在軟化步驟使用不同的酶制劑。觀察軟化后的生皮并分析生皮的濕鉻鞣革狀態(tài)。
在軟化后，與對(duì)照相比，用配制的蛋白酶HY-3處理的生皮在perioplie真皮的粒面(grain)和表面方面更清潔和更光滑。至于濕鉻鞣革的粒面，通過蛋白酶HY-3處理的生皮表面更軟并且白度更高。
比較例1比較通過在軟化步驟加入脫灰劑制備的皮革的性能為了研究在不同脫灰劑的存在下蛋白酶HY-3的活性，除了在軟化步驟加入每種脫灰劑，如3重量％氯化銨(NH4Cl)，3重量％硫酸銨((NH4)2SO4)，2重量％硫酸銨((NH4)2SO4)和1重量％氯化銨(NH4Cl)，和上面表1同樣的方法實(shí)行本實(shí)施例，然后往那里加入蛋白酶HY-3。對(duì)于每種脫灰劑的加入比較生皮的物理性質(zhì)。
通常，加入脫灰劑以增大軟化作用。在加入脫灰劑時(shí)，檢查由該脫灰劑導(dǎo)致的對(duì)蛋白酶HY-3的影響。
1-1加入氯化銨在進(jìn)行與上面表1相同步驟的同時(shí)，在軟化步驟中加入3重量％氯化銨(NH4Cl)并攪拌60分鐘。此外，加入蛋白酶HY-3，Amoron和OroponK中的每一個(gè)。將生皮切割成寬30cm×長(zhǎng)20cm。作為對(duì)照，在軟化步驟未使用脫灰劑。
比較如此獲得的生皮它們的性能。結(jié)果在下面表2中給出。
表2

1-2加入硫酸銨在進(jìn)行與上面表1相同步驟的同時(shí)，在軟化步驟中加入3重量％硫酸銨((NH4)2SO4)并攪拌60分鐘。此外，使用蛋白酶HY-3，Amoron和Oropon K。將生皮切割成寬30cm×長(zhǎng)20cm。作為對(duì)照，在軟化步驟未使用脫灰劑。
比較如此獲得的生皮它們的性能。結(jié)果在下面表3中給出。
表3

1-3加入氯化銨和硫酸銨在進(jìn)行與上面表1相同步驟的同時(shí)，在軟化步驟中加入1重量％氯化銨(NH4Cl)和2重量％硫酸銨((NH4)2SO4)并攪拌60分鐘。此外，使用蛋白酶HY-3，Amoron和Oropon K。將生皮切割成寬30cm×長(zhǎng)20cm。作為對(duì)照，在軟化步驟未使用脫灰劑。
比較如此獲得的生皮它們的性能。結(jié)果在下面表4中給出。
表4

如上所述，在軟化步驟中單獨(dú)使用硫酸銨((NH4)2SO4)之后的生皮的表面類似于使用Amoron和Oropon K之后的生皮表面。當(dāng)單獨(dú)使用氯化銨(NH4Cl)和氯化銨(NH4Cl)與硫酸銨((NH4)2SO4)的混合物時(shí)，伸長(zhǎng)率極好。與Amoron和Oropon K相比，生皮具有更平滑的表面和更清潔的粒面。在收縮率和柔軟度方面，結(jié)果相似。
當(dāng)?shù)鞍酌窰Y-3僅與硫酸銨一起使用時(shí)，發(fā)現(xiàn)中等效果，當(dāng)單獨(dú)加入氯化銨或氯化銨與硫酸銨的混合物時(shí)，發(fā)現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。
比較例2測(cè)量實(shí)際使用的生皮的性能將具有1.2-1.4mm厚度的生皮進(jìn)行浸灰步驟，分為兩片，其中一片加入蛋白酶HY-3，另外一片加入進(jìn)口軟化劑。然后，進(jìn)行軟化。將生皮制成外皮(即進(jìn)行鞣革過程以制備準(zhǔn)備制備皮革商品(例如手提包和鞋)的生皮)，其然后進(jìn)行如下面表5中的方法。觀察生皮的表面狀態(tài)并測(cè)量生皮的機(jī)械強(qiáng)度。
表5

當(dāng)使用蛋白酶HY-3和進(jìn)口Oropon K時(shí)，關(guān)于生皮的性能在下面表6中顯示。
表6

從上面表6的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)蛋白酶HY-3在幾乎所有性能上比進(jìn)口的Oropon K更優(yōu)異。在拉伸強(qiáng)度方面，蛋白酶HY-3處理的皮革是2.5-2.7kg/mm2，而Oropon K處理的皮革是1.1-2.4kg/mm2。在抗撕強(qiáng)度方面，前者是5.1-7.3kg/mm2，而后者是4.1-5.8kg/mm2。此外，在崩裂強(qiáng)度方面，前者是40kg/mm2或更大，而后者是32-40kg/mm2。至于延伸率和柔軟度，Oropon K處理的皮革顯示為59-82％和3.5-4.2％，而本發(fā)明的蛋白酶HY-3生產(chǎn)延伸率為60-77％并且柔軟度為3.3-3.9％的皮革。
比較例3通過蛋白酶HY-3的蛋白分解為了比較通過由Aranicola proteolyticus HY-3菌株(KCTC 0268BP)生產(chǎn)的蛋白酶HY-3和其它蛋白酶的蛋白質(zhì)分解，使用本發(fā)明的蛋白酶HY3和進(jìn)口的Oropon K。作為胰酶制劑，將Oropon K廣泛用于增大粒面的拉伸強(qiáng)度和柔軟度，并通過分解膠原蛋白而不損傷皮革的粒面來保持柔軟的粒面。
Braun，V.& Schmitz，G.，Arch，Microbiol.1980，12455-61測(cè)量蛋白酶HY-3的活性。將0.24g偶氮酪蛋白(Sigma，USA)溶解在10ml 50mM的磷酸鹽緩沖液，pH7.5中來制備底物溶液。將300μl的底物溶液與100μl培養(yǎng)基混合并在37℃反應(yīng)30分鐘。向反應(yīng)物加入300μl 10％三氯乙酸鹽并在室溫下另外反應(yīng)1小時(shí)。將得到的反應(yīng)物在7,000rpm下離心并將沉淀從上清液中分離。在300μl上清液中加入30μl 10％氫氧化鈉，然后在420nm測(cè)量吸光度。將1單位本發(fā)明的酶定義為在37℃，消化偶氮-酪蛋白測(cè)試底物1分鐘后釋放足以將吸光度提高1.0的偶氮和酪蛋白的量的酶量。
將1單位蛋白酶HY-3和Oropon K各自加入酪蛋白，清蛋白，血紅蛋白和角蛋白的蛋白質(zhì)底物混合物(1mg/ml)，和膠原蛋白與彈性蛋白的蛋白質(zhì)底物混合物(5mg/ml)，然后在37℃反應(yīng)2小時(shí)。此后，使用Bradford法測(cè)量樣品中蛋白質(zhì)的量(參見表7)。然后將1單位酶定義為在37℃從底物的蛋白水解消化1分鐘產(chǎn)生1μg蛋白質(zhì)等價(jià)物(equivalent)所需的量。
因此，與Oropon K相比，對(duì)于除了血紅蛋白的大部分底物，本發(fā)明的蛋白酶HY-3顯示更高的分解活性。通常，動(dòng)物生皮包含膠原蛋白，彈性蛋白，角蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白，和清蛋白，球蛋白等非結(jié)構(gòu)蛋白。蛋白酶HY-3可以分解在生皮中也存在的酪蛋白和清蛋白，特別是具有針對(duì)毛發(fā)主要成分角蛋白的極好分解活性，以致它因此可以在浸灰和脫灰步驟中發(fā)揮作用。
通過用蛋白酶消化10分鐘，可以將角蛋白和膠原蛋白分解40％或更多。在下面表7中表示通過蛋白酶HY-3分解除了血紅蛋白之外的蛋白質(zhì)的結(jié)果。
表7

另外，與Oropon K相比，蛋白酶HY-3對(duì)膠原蛋白的活性高4倍多。結(jié)果在下面的表8中顯示。結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成大多數(shù)動(dòng)物生皮，組成大約60％或更多的膠原蛋白，膠原蛋白另外在骨，肌肉和腱中存在。因此認(rèn)為如果給定的蛋白酶可以有效分解膠原蛋白，它對(duì)于皮革加工具有極好的效果。
表8

工業(yè)適用性如上所述，通過使用蛋白酶HY-3制備皮革的方法和本發(fā)明處理來自皮革加工的廢物的方法，可以獲得優(yōu)秀品質(zhì)的皮革并且還可以急劇減少在皮革加工中使用的化學(xué)品的量，由此以有利于環(huán)境的方式處理或者再循環(huán)廢物。
已經(jīng)以舉例說明的方式描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解使用的術(shù)語是意欲具有描述而不是限制的性質(zhì)。根據(jù)上述教導(dǎo)可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行許多修飾和改變。因此，應(yīng)當(dāng)理解在后附權(quán)利要求的范圍內(nèi)，可以不同于具體描述來實(shí)施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種制備皮革的方法，其包含浸濕，浸灰，脫灰和軟化步驟，其中將由Aranicola proteolyticus HY-3菌株(KCTC 0268BP)生產(chǎn)的蛋白酶HY-3加至所述浸濕步驟，浸灰步驟，脫灰步驟或軟化步驟。
2.權(quán)利要求1中闡明的方法，其中所述蛋白酶HY-3是來自所述微生物培養(yǎng)基的去除微生物的含酶液體，或者配制的制劑。
3.權(quán)利要求1中闡明的方法，其中以0.1-15重量％的量使用所述蛋白酶HY-3。
4.一種用于處理來源于皮革制備的廢物的方法，其中將由Aranicolaproteolyticus HY-3菌株(KCTC 0268BP)生產(chǎn)的蛋白酶HY-3加至來自所述浸濕步驟和浸灰步驟的廢水和固體廢物，來自所述浸灰和脫灰步驟以及所述軟化步驟的固體廢物，或者來自所述整理步驟的固體廢物中。
5.權(quán)利要求4中闡明的方法，其中所述蛋白酶HY-3是所述微生物培養(yǎng)基，來自所述培養(yǎng)基的去除微生物的含酶液體，或者配制的制劑。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述蛋白酶HY-3與選自脂酶，淀粉酶和其混合物中的一種組合加入。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用蛋白酶制備皮革的方法和使用它處理來源于皮革加工的廢物的方法，其在制備優(yōu)異品質(zhì)的皮革，通過減少化學(xué)品的量減少?gòu)U物產(chǎn)量和以有利于環(huán)境的方式處理或再循環(huán)廢物方面是有利的。將從Aranicola proteolyticusHY－3菌株生產(chǎn)的蛋白酶HY－3加至皮革加工中的浸濕，浸灰，脫灰和軟化步驟，從而制備皮革。另外，將蛋白酶HY－3加至在浸濕和浸灰步驟期間產(chǎn)生的廢水和固體廢物，和在浸灰，脫灰，軟化和整理步驟期間產(chǎn)生的固體廢物中，以便處理廢物。
文檔編號(hào)C14C1/00GK1529761SQ01823478
公開日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2001年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月14日
發(fā)明者樸鎬用, 孫光熙, 權(quán)容國(guó), 申東夏, 閔升基 申請(qǐng)人:昆蟲生命工學(xué)株式會(huì)社