專利名稱：一種多殺菌素制備工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種多殺菌素制備工藝，尤其是涉及一種利用放線菌剌糖多孢菌制備多殺菌
素的工藝。
背景技術：
多殺菌素(spinosad )是由土壤放線菌刺糖多孢菌(&3CC力sro/^.^wrs 5'/w'/70幼)產(chǎn)生 的次級代謝產(chǎn)物，屬于大環(huán)內(nèi)脂類化合物，其主要有效成分是多殺菌素印/朋砂/ A(約占85 %-皿9()%)和s/w'ffiw//7 D (約占10%-15%)。多殺菌素作為一種新型的高效廣譜大環(huán)內(nèi)酯類 殺蟲活性物質(zhì)，試驗證明其殺蟲譜十分廣泛，包括鱗翅目U印^/o/7tora)、纓翅目 (r/;."'a/ 叩fera)、鞘翅目(Co〗e印tera)、雙翅目(歷ptera)、膜翅目(〃ra e/7叩"ra)、 等翅目(/^p"ra)等害蟲。尤其對鱗翅目、纓翅目害蟲有極強的選擇性與殺蟲活性，而對 非耙標生物的毒性很低，對人和其他哺乳動物非常安全，迄今為止沒有發(fā)現(xiàn)與其他殺蟲劑有 交叉抗性。
多殺菌素通過與煙堿乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine rec印tors, nAchRs)結 合，使昆蟲神經(jīng)細胞去極化，引起中央神經(jīng)系統(tǒng)廣泛超活化，導致非功能性的肌收縮、衰竭、 并伴隨顫抖和麻痹，對昆蟲存在快速觸殺和攝食毒性，同時也通過抑制氨基丁酸受體 (Ga,a-amino butyric acid rec印tors GABARs)而使神經(jīng)細胞超活化，這可能會進一步加 強其殺蟲活性。
在多殺菌素衍生物中，正丁基多殺菌素(結構式參見圖l)為殺蟲效價最高的成分。因此， 研究開發(fā)產(chǎn)率高，產(chǎn)品純度高，正丁基多殺菌素成分含量高，生產(chǎn)成本低的多殺菌素制備方 法，具有重要易意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)率高，產(chǎn)品純度高，正丁基多殺菌素成分含量高，生產(chǎn)成 本低的多殺菌素制備方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的
其包括放線菌剌糖多孢菌S078-8(5"acc力aropo義K印ora spj'/7OsaS078-8, 2008年U月22 「H呆藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC M加8225)發(fā)酵工藝和利用放線菌刺糖多 孢菌S078-8發(fā)酵所得含多殺菌素發(fā)酵液提取多殺菌素結晶產(chǎn)品的工藝兩部分。放線菌刺糖多孢菌S078-8發(fā)酵工藝部分具體包括以下步驟(1)將放線菌剌糖多孢菌 S078-8菌種接種于裝有種子培養(yǎng)液的搖瓶內(nèi)，在28-34t:條件下，培養(yǎng)2-3天，將該種子液 接入種子罐，接種時，該罐培養(yǎng)基pH為6.0 8.0; (2)對種子罐裝入培養(yǎng)基，滅菌(可采用 公知滅菌方法)后，接入經(jīng)活化的搖瓶種子液；(3)對發(fā)酵罐裝入培養(yǎng)基，滅菌(可采用公 知滅菌方法)后，冷卻至28-34'C，按投料體積的5 15%移入種子液；(4)種子罐培養(yǎng) 在溫度28-34。C，罐壓0. 3-0. 6Kg/cm2,通氣量1:0. 7-1:0. 9 (V/V)，攪拌速率200-300 rpm條 件下培養(yǎng)2-3天；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)在溫度28-34°C,罐壓0. 3-0. 8Kg/cm2,通氣量t :0. 4 -h 1. 5 (V/V),攪拌速率200-600 rpm條件下培養(yǎng)9 12天；用顯微鏡檢査有60 80。/。的菌絲體裂 解時，終止發(fā)酵，放罐，即得含多殺菌素的發(fā)酵液；
所述種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖10 20g/L，大豆粉30 60g/L，酵母粉6 12g/L,硫酸 鎂1.8 3.6g/L，泡敵0.02% 0.08%，滅菌前pH為7.0 9.0，滅菌后pH為6.0 8.0:
所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為葡萄糖100 200g/L,酵母粉L0 4.0g/L,豆餅粉6.0 1().0 g/L、玉米粉8 12g/L，油酸甲酯25 100ml/L，碳酸鈣3.0 6.0 g/L，棉籽粉24 36g/L;泡 敵0.02% 0.08%，，滅菌前pH為7.0 9.0，滅菌后pH為6.0 8.0。
在發(fā)酵罐發(fā)酵菌體進入對數(shù)生長期，宜設定聯(lián)動控制維持發(fā)酵液內(nèi)溶氧水平，即通過調(diào) 整攪拌轉速、通氣速率維持溶氧濃度在30 50%,以有效保證菌體正常生長代謝需要。
所述放線菌刺糖多孢菌是本發(fā)明者采用Red/ET基因工程技術和結合轉移技術獲得的。 利用放線菌刺糖多孢菌S078-8發(fā)酵所得含多殺菌素發(fā)酵液提取多殺菌素結晶產(chǎn)品的工 藝具體包括以下步驟(1)將含多殺菌素的發(fā)酵液pH值調(diào)節(jié)為9-ll; (2)將調(diào)pH值后的發(fā) 酵液置于連續(xù)離心機中以12000 18000rpm轉速離心處理15 30min，棄去上清液，收集離 心管底部的菌體固形沉淀物；(3)將所得菌體固形沉淀物用超濾水充分洗滌2 4次，加入與 發(fā)酵液等體積的甲醇，充分攪拌混合，進行2 3小時的浸提，同時進行充分攪拌；(4)將甲 醇浸提液置于離心機中以6000 8000 rpm轉速離心處理15 30min，棄去菌體固形物沉淀， 收集浸提上清液；(5)將浸提上清液通過減壓濃縮至1/10 1/30原發(fā)酵液體積，加入與發(fā)酵 液等體積的0.1 0.3mol/L酒石酸溶液，調(diào)節(jié)pH值為9-11，得到多殺菌素結晶沉淀；(6)將 多殺菌素結晶沉淀用超濾水洗滌3 5次，真空干燥，即得多殺菌素結晶產(chǎn)品。
可用HPLC方法測定產(chǎn)品多殺菌素成分和含量(l)取2ml發(fā)酵液加2-4ml甲醇或標準品 稀釋一定倍數(shù)，用超聲波處理30秒鐘；(2)將稀釋液轉移至5ml離心管中，30。C恒溫箱內(nèi)放 置4-i0小時；(3)用4000rpm、 2-6。C低溫條件下離心10-15分鐘；(4)取上清液過微孔濾膜, 覽于4。C冰箱內(nèi)待檢測；(5)濾液用AKTApurifierlO高效液相色譜儀進行色譜分析；(6)根據(jù)多殺菌素含量與峰面積標準曲線計算所測發(fā)酵樣品的正丁基多殺菌素含量
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點， 一是產(chǎn)率高，經(jīng)HPLC測定，多殺菌素產(chǎn)量最終達到 2000-4000mg/L以上，特別是，殺蟲效價最高的正丁基多殺菌素成分，發(fā)酵液內(nèi)的含量達到 !500-2800 mg/L; 二是多殺菌素結晶產(chǎn)品純度高，達到95%—98%;三是生產(chǎn)成本相對也低。 放線菌刺糖多孢菌S078-8保藏日期、保藏單位全稱及簡稱、保藏編號 保藏日期2008年11月22日； 保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC; 保藏編號CCTCC M208225。
具體實施例方式
以下結合實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍不能認為只局限于下述具 體實施方式。對所屬技術領域的技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的基本前提下，還可以 做出若干簡單推演或等同替換，這些等同替換方案仍然將被視為在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
以下所述實施例第(1)至第(5)步為放線菌刺糖多孢菌S078-8發(fā)酵得到含多殺菌素發(fā) 酵液的工藝；第(6)至第(11)步為利用第(5)步發(fā)酵所得含多殺菌素的發(fā)酵液提取制備 多殺菌素結晶產(chǎn)品的工藝。如只需得到含多殺菌素發(fā)酵液，則第(6)至第(11)步可以省去。 各實施例相關步驟采用的滅菌法均為公知的高壓蒸汽滅菌法壓力0.2MPa，溫度12rC,保 持30分鐘。
實施例1
(1)將放線菌刺糖多孢菌S078-8菌種保藏管一支接種于裝有種子培養(yǎng)液的搖瓶內(nèi)，在 :"rC條件下，培養(yǎng)2.5天，將該種子液接入種子罐，接種時，該罐培養(yǎng)基pH為7.0; (2)對' 種子罐裝入培養(yǎng)基，通入高壓蒸汽滅菌，冷卻至3(TC后，接入經(jīng)活化的搖瓶種子液；(3)對 發(fā)酵罐裝入培養(yǎng)基,，通入高壓蒸汽滅菌，冷卻至3(TC后，按投料體積的10%移入種子液； (1)種子罐培養(yǎng)在溫度3(TC，罐壓0.5Kg/cm2，通氣量1:0.8 (V/V)，攪拌速率250 rpm條 件下培養(yǎng)2.5天；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)在溫度3rC，罐壓0.5Kg/cm2，通氣量1::1.3 (V/V)， 攪拌速率350卬m條件下，培養(yǎng)ll天；其間，在發(fā)酵罐發(fā)酵菌體進入對數(shù)生長期，通過控制 系統(tǒng)自動調(diào)整攪拌轉速、通氣速率維持溶氧濃度在35 40%;用顯微鏡檢查有65%的菌絲體 裂解時，終止發(fā)酵，放罐；(6)收集發(fā)酵罐發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH值為10; (7)將調(diào)pH值后 的發(fā)酵液置于連續(xù)離心機中以15000 rpm轉速離心處理20min，棄去上清液，收集離心管底 部的菌體固形沉淀物；(8)將所得菌體固形沉淀物用超濾水充分洗滌3次，加入與發(fā)酵液等 體積的甲醇，充分攪拌混合，進行2.5小時浸提，同時進行充分攪拌；(9)將甲醇浸提液置于離心機中以7000rpra轉速離心處理20min，棄去菌體固形物沉淀，收集浸提上清液；(()) 將浸提上清液通過減壓濃縮至1/20原發(fā)酵液體積，加入與發(fā)酵液等體積的0.2 mol/L酒石酸 溶液，調(diào)節(jié)pH值為10,得到多殺菌素結晶沉淀；(11)將多殺菌素結晶沉淀用超濾水洗滌4 次，真空干燥，即得多殺菌素產(chǎn)品。
所述種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖15g/L，大豆粉25g/L，酵母粉9g/L，硫酸鎂2.7g/L，泡 敵0.05wt%，滅菌前pH為8.0，滅菌后pH為7.0。
發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為葡萄糖I40g/L,酵母粉3g/L,豆餅粉5.0g/L，玉米粉9g/L,油酸 甲酯50ml/L,碳酸鈣2g/L，棉籽粉30g/L，其余為水；泡敵0.05wt%，滅菌前pH為8.0,滅 菌后pH為7.0;將固型顆粒成分粉碎，細度為120目/英寸，再將各成分混合均勻即成。
用HPLC方法測定發(fā)酵液中多殺菌素含量，達到3950mg/L;其中正丁基多殺菌素成分含 量達到1570mg/L;多殺菌素結晶產(chǎn)品純度達到96%。
實施例2
(1)將放線菌剌糖多孢菌S078-8菌種保藏管一支接種于裝有種子培養(yǎng)液的搖瓶內(nèi)，在 32'C條件下，培養(yǎng)2天，將該種子液接入種子罐，接種時，該罐培養(yǎng)基pH為6.0; (2)同實 施例1第(2)步；(3)對發(fā)酵罐裝入培養(yǎng)基，滅菌方法同第(2)步，滅菌后，冷卻至28'C， 按投料體積的15%移入種子液；(4)種子罐培養(yǎng)在溫度28°C，罐壓0. 3Kg/cm2,通氣量j :(). 7 (V/V),攪拌速率200rpm條件下培養(yǎng)3天;(5)發(fā)酵罐培養(yǎng):在溫度28。C，罐壓().8Kg/ctf, 通氣量1:0.5 (V/V),攪拌速率200rpm條件下培養(yǎng)12天；用顯微鏡檢査有70%的菌絲體裂 解時，終止發(fā)酵，放罐；(6)收集發(fā)酵罐發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH值為9; (7)將調(diào)pH值后的發(fā)酵 液置于連續(xù)離心機中以13000 rpm轉速離心處理28min，棄去上清液，收集離心管底部的菌 體固形沉淀物；(8)將所得菌體固形沉淀物用超濾水充分洗滌4次，加入與發(fā)酵液等體積的 甲醇，充分攪拌混合，進行2小時的浸提，同時進行充分攪拌；(9)將甲醇浸提液置于離心 機中以8000rpm轉速離心處理15min，棄去菌體固形物沉淀，收集浸提上清液；(10)將浸 提上清液通過減壓濃縮至1/10原發(fā)酵液體積，加入與發(fā)酵液等體積的0.1 mol/L酒石酸溶液， 調(diào)節(jié)pH值為9，得到多殺菌素結晶沉淀；(11)將多殺菌素結晶沉淀用超濾水洗滌3次，真 空干燥，即可得正丁基多殺菌素或多殺菌素衍生物產(chǎn)品。
所述種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖10g/L，大豆粉50g/L，酵母粉12g/L,硫酸鎂1.8g/L,泡 敵0.02wt。/。，滅菌前pH為7.0，滅菌后pH為6.0;
所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為葡萄糖200g/L,酵母粉2.0g/L，豆餅粉10.0 g/L，玉米粉8 g/L，油酸甲酯90ml/L,碳酸鈣6.0g/L,棉籽粉36g/L;泡敵0.08wt。/。，滅菌前pH為7.0,滅菌后pH為6.0。
用HPLC方法測定發(fā)酵液中多殺菌素含量，達到3790mg/L;其中正丁基多殺菌素成分含 量達到1820mg/L;多殺菌素結晶產(chǎn)品純度達到95%。 實施例3
(1)將放線菌刺糖多孢菌S078-8菌種保藏管一支接種于裝有種子培養(yǎng)液的搖瓶內(nèi)，在 28'C條件下，培養(yǎng)3天，將該種子液接入種子罐，接種時，該罐培養(yǎng)基pH為8.0; (2)對種 子罐裝入培養(yǎng)基，滅菌后，接入經(jīng)活化的搖瓶種子液；(3)對發(fā)酵罐裝入培養(yǎng)基，滅菌后， 冷卻至28°C,按投料體積的8%移入種子液；(4)種子罐培養(yǎng)在溫度28'C，罐壓0. 6Kg/cm2, 通氣量1:0.9 (V/V),攪拌速率300 rpm條件下培養(yǎng)2天；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)在溫度28。C， 罐壓0. 8Kg/cm2,通氣量1:1.5 (V/V),攪拌速率450 ipm條件下培養(yǎng)10天；其間，在發(fā)酵罐 發(fā)酵菌體進入對數(shù)生長期，通過控制系統(tǒng)自動調(diào)整攪拌轉速和通氣速率,維持溶氧濃度在40 45%;用顯微鏡檢査有75%的菌絲體裂解時，終止發(fā)酵，放罐；(6)收集發(fā)酵罐發(fā)酵液，調(diào) 節(jié)pH值為11;(7)將調(diào)pH值后的發(fā)酵液置于連續(xù)離心機中以17000 rpm轉速離心處理16min, 棄去上清液，收集離心管底部的菌體固形沉淀物；(8)將所得菌體固形沉淀物用超濾水充分 洗滌4次，加入與發(fā)酵液等體積的甲醇，充分攪拌混合，進行2小時的浸提，同時進行充分 攪拌；(9)將甲醇浸提液置于離心機中以6000rpm轉速離心處理30min，棄去菌體固形物沉 淀，收集浸提上清液；(10)將浸提上清液通過減壓濃縮至1/25原發(fā)酵液體積，加入與發(fā)酵 液等體積的0.3mol/L酒石酸溶液，調(diào)節(jié)pH值為9，得到多殺菌素結晶沉淀；(11)將多殺菌 素結晶沉淀用超濾水洗滌5次，真空干燥，即可得正丁基多殺菌素或多殺菌素衍生物產(chǎn)品。
所述種子罐培養(yǎng)基配方為葡萄糖20g/L，大豆粉40g/L，酵母粉12g/L，硫酸鎂3.0g/L， 泡敵0.08wt。/0，滅菌前pH為9.0，滅菌后pH為8.0;
所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為葡萄糖100g/L,酵母粉2.0 g/L，豆餅粉10.0 g/L，玉米粉8 g/L，油酸甲酯100ml/L，碳酸轉6.0g/L,棉籽粉30g/L;泡敵0.08wt0/0,滅菌前pH為9.0，滅 菌后pH為8.0。
用HPLC方法測定發(fā)酵液中多殺菌素含量，達到38卯mg/L;其中正丁基多殺菌素成分含 量達到2540mg/L;多殺菌素結晶產(chǎn)品純度達到98%。
權利要求
1.一種多殺菌素制備工藝，其特征在于，包括以下步驟(1)將放線菌刺糖多孢菌S078-8菌種接種于裝有種子培養(yǎng)液的搖瓶內(nèi)，在28-34℃條件下，培養(yǎng)2-3天，將該種子液接入種子罐，接種時，該罐培養(yǎng)基pH為6.0～8.0；(2)對種子罐裝入培養(yǎng)基，滅菌后，接入經(jīng)活化的搖瓶種子液；(3)對發(fā)酵罐裝入培養(yǎng)基，滅菌后，冷卻至28-34℃，按投料體積的5～15％移入種子液；(4)種子罐培養(yǎng)在溫度28-34℃，罐壓0.3-0.6Kg/cm2，通氣量1∶0.7-1∶09(V/V)，攪拌速率200-300rpm條件下培養(yǎng)2-3天；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)在溫度28-34℃，罐壓0.3-0.8Kg/cm2，通氣量1∶0.4-1∶1.5(V/V)，攪拌速率200-600rpm條件下培養(yǎng)9～12天；用顯微鏡檢查有60～80％的菌絲體裂解時，終止發(fā)酵，放罐，即得含多殺菌素的發(fā)酵液；所述種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖10～20g/L，大豆粉30～60g/L，酵母粉6～12g/L，硫酸鎂1.8～3.6g/L，泡敵0.02％～0.08％，滅菌前pH為7.0～9.0，滅菌后pH為6.0～8.0；所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為葡萄糖100～200g/L，酵母粉1.0～4.0g/L，豆餅粉6.0～10.0g/L，玉米粉8～12g/L，油酸甲酯25～100ml/L，碳酸鈣3.0～6.0g/L，棉籽粉24～36g/L；泡敵0.02％～0.08％，，滅菌前pH為7.0～9.0，滅菌后pH為6.0～8.0。
2. 如權利要求1所述的多殺菌素制備工藝，其特征在于，所述第(5)步，在發(fā)酵罐發(fā)酵 菌體進入對數(shù)生長期，通過調(diào)整攪拌轉速、通氣速率，維持溶氧濃度在30 50%。
3. 如權利要求1或2所述的多殺菌素制備工藝，其特征在于，還包括以下步驟(l)將 含多殺菌素的發(fā)酵液pH值調(diào)節(jié)為9-ll; (2)將調(diào)pH值后的發(fā)酵液置于連續(xù)離心機中以 i2000 18000rpm轉速離心處理15 30min，棄去上清液，收集離心管底部的菌體固形沉淀 物；(3)將所得菌體固形沉淀物用超濾水充分洗滌2 4次，加入與發(fā)酵液等體積的甲醇，充 分攪拌混合，進行2 3小時的浸提，同時進行充分攪拌；(4)將甲醇浸提液置于離心機中以 6000 8000rpm轉速離心處理15 30min,棄去菌體固形物沉淀，收集浸提上清液；(5)將 浸提上清液通過減壓濃縮至1/10 1/30原發(fā)酵液體積，加入與發(fā)酵液等體積的0.1 0.3 moI/L 酒石酸溶液，調(diào)節(jié)pH值為9-11，得到多殺菌素結晶沉淀；(6)將多殺菌素結晶沉淀用超濾 水洗滌3 5次，真空干燥，即得多殺菌素結晶產(chǎn)品。
全文摘要
一種多殺菌素制備工藝，其包括放線菌刺糖多孢菌S078-8發(fā)酵工藝和利用放線菌刺糖多孢菌S078-8發(fā)酵所得含多殺菌素的發(fā)酵液提取多殺菌素結晶產(chǎn)品的工藝兩部分。本發(fā)明的優(yōu)點，一是產(chǎn)率高，經(jīng)HPLC測定，多殺菌素產(chǎn)量最終達到2000-4000mg/L以上，特別是，殺蟲效價最高的正丁基多殺菌素成分，發(fā)酵液內(nèi)的含量達到1500-2800mg/L；二是多殺菌素結晶產(chǎn)品純度高，達到95％-98％。
文檔編號C12P19/62GK101629203SQ200810143870
公開日2010年1月20日 申請日期2008年12月9日 優(yōu)先權日2008年12月9日
發(fā)明者丁學知, 余子全, 夏立秋, 張友明, 勇 易, 尉 楊, 羅玉雙, 胡勝標, 璠 黃 申請人:湖南師范大學