專(zhuān)利名稱(chēng)：一種提取植物脂筏的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取植物脂筏的方法。
背景技術(shù)：
Simons等在1997年發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜中具有富含膽固醇和鞘脂類(lèi) (鞘磷脂和鞘糖脂)的微區(qū)，稱(chēng)為"脂筏"。近幾年來(lái)，在擬南芥、煙草和苜蓿等植 物中也發(fā)現(xiàn)存在類(lèi)似的質(zhì)膜微區(qū)(membranemicrodomain)。脂筏的大小約為70nm， 是一種動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，位于質(zhì)膜的外小頁(yè)上。由于鞘磷脂具有較長(zhǎng)的飽和脂肪酸鏈，分 子間的作用力較強(qiáng)，所以這些區(qū)域結(jié)構(gòu)致密，介于無(wú)序液體與液晶之間，稱(chēng)為有序 液體(Liquid-ordered)。在低溫下這些區(qū)域能抵抗非離子去垢劑的抽提，所以又稱(chēng)為 抗去據(jù)齊廿月莫(detergent-resistant membranes, DRMs)。
脂筏的組分和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有利于蛋白質(zhì)之間相互作用和構(gòu)象轉(zhuǎn)化，可以參與信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。脂筏主要具有如下功能(l)由于脂筏內(nèi)有多種信號(hào)分子，它可 以參與許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；(2)可以參與細(xì)胞蛋白運(yùn)轉(zhuǎn)，脂筏內(nèi)包含許多的受體蛋白， 故利用不同的途徑運(yùn)送這些受體蛋白進(jìn)入細(xì)胞；(3)脂筏的另一功能是通過(guò)與微絲 相關(guān)聯(lián)而影響細(xì)胞骨架的組織。脂筏的研究已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的熱 門(mén)研究領(lǐng)域之一。目前，植物中脂筏的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于哺乳動(dòng)物和酵母。迄今為 止，只有關(guān)于植物質(zhì)膜的提取和純化方法，但進(jìn)一步提取植物脂筏的方法尚未見(jiàn)報(bào) 道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提取植物脂筏的方法。 本發(fā)明所提供的提取植物脂筏的方法，包括以下步驟
1) 裂解植物質(zhì)膜，得到裂解液；
2) 將上述步驟l)的裂解液進(jìn)行密度梯度離心，得到植物脂筏。 上述方法中，所述步驟l)中，用TritonX-100裂解植物質(zhì)膜，得到裂解液； 所述植物質(zhì)膜和Triton X-100混合后，混合液中Triton X-100的終濃度為
0.5-1.5%,具體可為1%。
所述裂解的時(shí)間為20-40min;所述裂解的溫度為O-l(TC，具體可為4'C。上述方法中，所述步驟2)中，所述密度梯度離心的介質(zhì)具體可為蔗糖。
所述密度梯度離心的條件為4。C、 200，000-300，000g、離心17-19h，具體可為 250,000g，離心18h。
實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可將蔗糖用TNE緩沖液配制成質(zhì)量百分含量分別為60y。、 40%、 35%、 30%和5%的濃度梯度，將上述步驟l)的裂解液與質(zhì)量百分含量為60%的蔗糖 溶液混合，使混合溶液中蔗糖的終濃度為48%，再依次加入質(zhì)量百分含量分別為 40%、 35%、 30%和5%的蔗糖溶液，這樣就形成了一系列蔗糖濃度梯度。上述步驟l) 的裂解液在上述濃度梯度的蔗糖溶液中密度梯度離心后，在質(zhì)量百分含量為30%和 35%的蔗糖溶液界面上出現(xiàn)了一條不透明的條帶，即為植物脂筏。
上述提取植物脂筏的方法還包括將所述植物脂筏用TNE緩沖液洗滌，除去蔗糖 的步驟。
所述TNE緩沖液的組成為20-30mMTris-cl、 150mMNaCl、 5mMEDTA; 所述TNE緩沖液的pH為7.4-7.6，具體可為7.5。 上述方法中，所述植物質(zhì)膜的提取方法包括以下步驟
1) 取植物組織在40-60mM的MOPS緩沖液中打碎，收集上清液； 所述MOPS緩沖液的組成為40-60 mM 3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、 0.33M
蔗糖、10%質(zhì)量百分含量丙三醇、5mM乙二胺四乙酸(EDTA)、 0.2%質(zhì)量百分含量 酪蛋白、0.6。/。質(zhì)量百分含量聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、5mM二硫蘇糖醇(DTT)和5mM 抗壞血酸，所述各物質(zhì)的濃度為它們?cè)谒鯩OPS緩沖液中的終濃度；
2) 取上述步驟1)的上清液，加入苯甲基磺酰氟(PMSF)， 9,000-11,000g離心10-20 min，收集上清液；
3) 取上述步驟2)的上清液，40,000-60,000g離心40-60min，得到微粒體；
4) 在上述步驟3)的微粒體中加入4-6mM的磷酸鉀懸浮液和苯甲基磺酰氟 (PMSF)，得到微粒體懸浮液；
所述磷酸鉀懸浮液的組成為4-6mM磷酸鉀緩沖液、330mM蔗糖、O.lmM乙 二胺四乙酸(EDTA)、 lmM二硫蘇糖醇(DTT)，所述各物質(zhì)的濃度為它們?cè)谒隽姿?鉀懸浮液中的終濃度；
5) 將上述步驟4)的微粒體懸浮液與兩相混合液混合，1,000-2,000g離心4-6 min， 收集上清液；
所述兩相混合液的組成為4-6mM磷酸鉀緩沖液、20。/。(質(zhì)量百分含量)Dextran
5T-500、 40% (質(zhì)量百分含量)PEG3350、 3mMKCl、 330mM蔗糖，所述各物質(zhì)的 濃度為它們?cè)谒鰞上嗷旌弦褐械慕K濃度；
6)在上述步驟5)的上清液中加入4-6mM的磷酸鉀懸浮液，卯，000-110,000g離 心50-70min，收集沉淀，得到植物質(zhì)膜。
上述方法中，所述步驟1)中，所述植物組織與MOPS緩沖液的配比為lg: 3ml;
所述MOPS緩沖液的濃度具體可為50mM; pH為7.4-7.6，具體可為7.5;
所述步驟2)中，離心力具體可為10，000g，離心15min;
所述步驟3)中，離心力具體可為50,000g，離心50min;
所述步驟4)、步驟6)中，所述磷酸鉀懸浮液的濃度具體可為5mM， pH為 7.7-7.9，具體可為7.8;
所述步驟5)中，離心力具體可為1，500g，離心5min;
所述步驟6)中，離心力具體可為100,000g，離心60min。
具體提取時(shí)，上述所有操作步驟均在4。C條件下進(jìn)行。
本發(fā)明利用二硫蘇糖醇(DTT)還原二硫鍵，從而使蛋白質(zhì)達(dá)到完全溶解的狀態(tài)， 而苯甲基磺酰氟(PMSF)則能夠有效的防止提取過(guò)程中蛋白質(zhì)的降解。本發(fā)明的提取 植物脂筏的方法具有快速、簡(jiǎn)單易行、可獲得較高質(zhì)量的、重復(fù)性較好的脂筏的優(yōu) 點(diǎn)，本發(fā)明方法在植物脂筏的研究中將發(fā)揮重要作用，具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。


圖1為蔗糖密度梯度離心的模式圖
圖2為采用本發(fā)明方法提取的擬南芥葉片中脂筏蛋白的電泳圖片 圖3為采用本發(fā)明方法提取的菠菜葉片中脂筏蛋白的電泳圖片
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物 材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。
下面以擬南芥和菠菜為例，對(duì)本發(fā)明的提取方法做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但并不限 制本發(fā)明。
實(shí)施例1、擬南芥葉片中脂筏的提取
1)取擬南芥葉片，按照每lg葉片加入3mlpH7.5的50mM的MOPS緩沖液； MOPS緩沖液的組成為50mM 3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、 0.33M蔗糖、10% 質(zhì)量百分含量丙三醇、5mM乙二胺四乙酸(EDTA)、 0.2%質(zhì)量百分含量酪蛋白、0.6%質(zhì)量百分含量聚乙烯吡咯垸酮(PVPP)、 5mM二硫蘇糖醇(DTT)、 5mM抗壞血酸，所 述各物質(zhì)的濃度為它們?cè)贛OPS緩沖液中的終濃度；
2) 將上述步驟l)的葉片在高速組織勻漿器中打磨4-5次，每次6-8s;
3) 將上述步驟2)打碎的植物葉片用四層紗布過(guò)濾，得到上清液，向上清液中 加入PMSF，使其終濃度為0.5mM;
4) 將上述步驟3)的反應(yīng)液10,000g離心15min，收集上清液；
5) 將上述步驟4)的上清液50,000g離心50min，收集沉淀，即為微粒體；
6) 在上述步驟5)的微粒體中加入pH 7.8的5mM磷酸鉀懸浮液，同時(shí)加入PMSF， 使其終濃度為0.5mM，得到微粒體懸浮液；
磷酸鉀懸浮液的組成為5mM磷酸鉀緩沖液、330mM蔗糖、O.lmMEDTA、 lmM 二硫蘇糖醇(DTT),所述各物質(zhì)的濃度為它們?cè)谒隽姿徕洃腋∫褐械慕K濃度；
7) 取6mL上述步驟6)的微粒體懸浮液，加入到18g、 pH 7.8的兩相混合液中， 形成24g兩相體系；
兩相混合液的組成為5mM磷酸鉀緩沖液、20。/。(質(zhì)量百分含量)DextranT-500、 40% (質(zhì)量百分含量)PEG3350、 3mMKCl、 330mM蔗糖，所述各物質(zhì)的濃度為它 們?cè)谒鰞上嗷旌弦褐械慕K濃度；
8) 將上述步驟7)的兩相體系充分混勻(顛翻30-40次)后，1,500g離心5min 分相；
9) 將上述步驟8)兩相體系中的上相溶液轉(zhuǎn)移至新鮮的兩相混合液中，混勻后 再次按照步驟8)的方法離心分相，如此重復(fù)3次，收集上清液；
10) 將上述步驟9)的上清液用5倍體積的5mM磷酸鉀懸浮液稀釋后，100,000g 離心60min，收集沉淀；
11) 將上述步驟lO)的沉淀用5mM磷酸鉀懸浮液懸浮，即得富含植物質(zhì)膜的組
分；
12) 將Triton X-100和上述步驟l 1)提取得到的植物質(zhì)膜混合，使混合液中Triton X-100的終濃度為l。/。， 4。C裂解30ittin，得到裂解液；
13) 將蔗糖用pH為7.5的TNE緩沖液配制成質(zhì)量百分含量分別為60%、 40%、 35%、 30%和5%的濃度梯度，將上述步驟12)的裂解液與質(zhì)量百分含量為60%的 蔗糖溶液混合，使混合溶液中蔗糖的終濃度為48%，再依次加入質(zhì)量百分含量分別 為40%、 35%、 30%和5%的蔗糖溶液，這樣就形成了一系列蔗糖濃度梯度；TNE緩沖液的組成為25mMTris-cl、 150mMNaCl、 5mMEDTA;
14) 將上述步驟13)的不同濃度梯度的蔗糖溶液在SW40 Ti (Beckman)離心機(jī)上， 4X:條件下250,000g離心18h，在質(zhì)量百分含量為30%和35%的蔗糖溶液界面上出現(xiàn) 了一條不透明的條帶，即為所提取的脂筏；蔗糖密度梯度離心的模式圖如圖l所示， 其中箭頭所指為脂筏蛋白所在的位置；
15) 將上述步驟14)提取得到的脂筏蛋白用TNE緩沖液洗滌，除去蔗糖。 將采用上述方法得到的擬南芥葉片中的脂筏蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢
測(cè)，結(jié)果如圖2所示。
實(shí)施例2、菠菜葉片中脂筏的提取
1) 取菠菜葉片，按照每lg葉片加入3mlpH7.5的50mM的MOPS緩沖液； MOPS緩沖液的組成為50mM 3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、 0.33M蔗糖、10%
質(zhì)量百分含量丙三醇、5mM乙二胺四乙酸EDTA、 0.2%質(zhì)量百分含量酪蛋白、0.6% 質(zhì)量百分含量聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、 5mM二硫蘇糖醇(DTT)、 5mM抗壞血酸，所 述各物質(zhì)的濃度為它們?cè)贛OPS緩沖液中的終濃度；
2) 將上述步驟l)的葉片在高速組織勻漿器中打磨4-5次，每次6-8s;
3) 將上述步驟2)打碎的植物葉片用四層紗布過(guò)濾，得到上清液，向上清液中 加入PMSF，使其終濃度為0.5mM;
4) 將上述步驟3)的反應(yīng)液10,000g離心15min，收集上清液；
5) 將上述步驟4)的上清液50,000g離心50min，收集沉淀，即為微粒體；
6) 在上述步驟5)的微粒體中加入pH7.8的5mM磷酸鉀懸浮液，同時(shí)加入PMSF， 使其終濃度為0.5mM，得到微粒體懸浮液；
磷酸鉀懸浮液的組成為5mM磷酸鉀緩沖液、330mM蔗糖、0.1mMEDTA、 lmM 二硫蘇糖醇(DTT)，所述各物質(zhì)的濃度為它們?cè)谒隽姿徕洃腋∫褐械慕K濃度；
7) 取6mL上述步驟6)的微粒體懸浮液，加入到18g、 pH 7.8的兩相混合液中， 形成24g兩相體系；
兩相混合液的組成為5mM磷酸鉀緩沖液、20M(質(zhì)量百分含量)Dextran T-500、 40% (質(zhì)量百分含量)PEG3350、 3mMKCl、 330mM蔗糖，所述各物質(zhì)的濃度為它 們?cè)谒鰞上嗷旌弦褐械慕K濃度；
8) 將上述步驟7)的兩相體系充分混勻(顛翻30-40次)后，1,500g離心5min 分相；
89) 將上述步驟8)兩相體系中的上相溶液轉(zhuǎn)移至新鮮的兩相混合液中，混勻后 再次按照步驟8)的方法離心分相，如此重復(fù)3次，收集上清液；
10) 將上述步驟9)的上清液用5倍體積的5mM磷酸鉀懸浮液稀釋后，100,000g 離心60min，收集沉淀；
11) 將上述步驟IO)的沉淀用5mM磷酸鉀懸浮液懸浮，即得富含植物質(zhì)膜的組
分；
12) 將Triton X-lOO和上述步驟ll)提取得到的植物質(zhì)膜混合，使混合液中Triton X-100的終濃度為l。/。， 4t:裂解30min，得到裂解液；
13) 將蔗糖用pH為7.5的TNE緩沖液配制成質(zhì)量百分含量分別為60°/。、 40%、 35%、 30%和5%的濃度梯度，將上述步驟12)的裂解液與質(zhì)量百分含量為60%的 蔗糖溶液混合，使混合溶液中蔗糖的終濃度為48%，再依次加入質(zhì)量百分含量分別 為40%、 35%、 30%和5%的蔗糖溶液，這樣就形成了一系列蔗糖濃度梯度；
TNE緩沖液的組成為25mMTris-cl、 150mMNaCl、 5mMEDTA;
14) 將上述步驟13)的不同濃度梯度的蔗糖溶液在SW40 Ti (Beckman)離心機(jī)上， 4"條件下250,000g離心18h，在質(zhì)量百分含量為30%和35%的蔗糖溶液界面上出現(xiàn) 了一條不透明的條帶，即為所提取的脂筏；蔗糖密度梯度離心的模式圖如圖l所示， 其中箭頭所指為脂筏蛋白所在的位置；
15) 將上述步驟14)提取得到的脂筏蛋白用TNE緩沖液洗滌，除去蔗糖。 將采用上述方法得到的菠菜葉片中的脂筏蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，
結(jié)果如圖3所示。
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權(quán)利要求
1、一種提取植物脂筏的方法，包括以下步驟1)裂解植物質(zhì)膜，得到裂解液；2)將上述步驟1)的裂解液進(jìn)行密度梯度離心，得到植物脂筏。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述步驟l)中，用TritonX-lOO 裂解植物質(zhì)膜，得到裂解液；所述植物質(zhì)膜和Triton X-1 OO混合后，混合液中Triton X-100的終濃度為 0.5-1.5%，優(yōu)選為1%。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述裂解的時(shí)間為20-40min; 所述裂解的溫度為O-l(TC，優(yōu)選為4。C。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l、 2或3所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述密 度梯度離心的介質(zhì)為蔗糖。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述密度梯度離心的條件為4'C、 200,000-300，000g、離心17-19h;優(yōu)選為250,000g，離心18h。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l-5中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括將所述植物脂筏用TNE緩沖液洗滌，除去蔗糖的步驟。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述TNE緩沖液的pH為7.4-7.6， 優(yōu)選為7.5。
8、 根據(jù)權(quán)利要求l-7中任一所述的方法，其特征在于所述植物質(zhì)膜的提取包 括以下步驟1) 取植物組織在40-60mM的MOPS緩沖液中打碎，收集上清液； 所述MOPS緩沖液的組成為50mM 3-(N-嗎啉基)丙磺酸、0.33M蔗糖、10%質(zhì)量百分含量丙三醇、5mM乙二胺四乙酸、0.2%質(zhì)量百分含量酪蛋白、0.6%質(zhì)量百分 含量聚乙烯吡咯烷酮、5mM二硫蘇糖醇、5mM抗壞血酸，所述各物質(zhì)的濃度為它們 在MOPS緩沖液中的終濃度；2) 取上述步驟l)的上清液，加入苯甲基磺酰氟，9,000-11,000g離心10-20min， 收集上清液；3) 取上述步驟2)的上清液，40,000-60,000g離心40-60min，得到微粒體；4) 在上述步驟3)的微粒體中加入4-6mM的磷酸鉀懸浮液和苯甲基磺酰氟，得到微粒體懸浮液；所述磷酸鉀懸浮液的組成為4-6mM磷酸鉀緩沖液、330mM蔗糖、O.lmM乙 二胺四乙酸、lmM二硫蘇糖醇，所述各物質(zhì)的濃度為它們?cè)谒隽姿徕洃腋∫褐械?終濃度；5) 將上述步驟4)的微粒體懸浮液與兩相混合液混合，1,000-2,000g離心4-6 min， 收集上清液；所述兩相混合液的組成為4-6mM磷酸鉀緩沖液、20。/。質(zhì)量百分含量Dextran T-500、 40。/。質(zhì)量百分含量PEG3350、 3mMKCl、 330mM蔗糖，所述各物質(zhì)的濃度 為它們?cè)谒鰞上嗷旌弦褐械慕K濃度；6) 在上述步驟5)的上清液中加入4-6mM的磷酸鉀懸浮液，90,000-110,000g離 心50-70min，收集沉淀，得到植物質(zhì)膜。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟l)中，所述植物組織 與MOPS緩沖液的配比為lg: 3ml;所述MOPS緩沖液的濃度為50mM; pH為7.4-7.6，優(yōu)選為7.5; 所述步驟2)中，所述離心的離心力為10,000g，離心時(shí)間為15min; 所述步驟3)中，所述離心的離心力為50,000g，離心時(shí)間為50min; 所述步驟4)、步驟6)中，所述磷酸鉀懸浮液的濃度為5mM， pH為7.7-7.9， 優(yōu)選為7.8;所述步驟5)中，所述離心的離心力為1，500g，離心時(shí)間為5min; 所述步驟6)中，所述離心的離心力為100，000g，離心時(shí)間為60min。
10、 根據(jù)權(quán)利要求l-9任一所述的方法，其特征在于所述提取過(guò)程在4"C進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種提取植物脂筏的方法。該方法包括以下步驟1)裂解植物質(zhì)膜，得到裂解液；2)將上述步驟1)的裂解液進(jìn)行密度梯度離心，得到植物脂筏。本發(fā)明利用二硫蘇糖醇(DTT)還原二硫鍵，從而使蛋白質(zhì)達(dá)到完全溶解的狀態(tài)，而苯甲基磺酰氟(PMSF)則能夠有效的防止提取過(guò)程中蛋白質(zhì)的降解。本發(fā)明的提取植物脂筏的方法具有快速、簡(jiǎn)單易行、可獲得較高質(zhì)量的、重復(fù)性較好的脂筏的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明方法在植物脂筏的研究中將發(fā)揮重要作用，具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C11B1/00GK101508935SQ20091008000
公開(kāi)日2009年8月19日 申請(qǐng)日期2009年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月16日
發(fā)明者李瑞麗, 林金星, 彤 陳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所