具有降血糖功能的黑苦蕎米提取物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有降血糖功能的黑苦蕎米提取物及其制備方法，包括以下步驟：(1)將黑苦蕎米粉碎、過20目篩處理后，得到黑苦蕎米原料；(2)取得到的黑苦蕎米原料，加入料液比為1:20?1:25、體積分?jǐn)?shù)為50?60％的乙醇溶液；在150～250W頻率下超聲波處理10～30min后，繼續(xù)在40?75℃條件下，攪拌提取30?75min后，冷卻至室溫，將提取液在4℃、3000～6000rpm下冷凍離心10?30min，收集上清液；(3)取上清液，減壓濃縮，回收乙醇，濃縮得到濃縮液；(4)將得到的濃縮液進行液相色譜分離，收集分離液，分離液經(jīng)真空冷凍干燥得到黑苦蕎米提取物。采用本發(fā)明的方法制備得到的黑苦蕎米提取物主要成分為蘆丁，純度為87?95％。同時，本發(fā)明的黑苦蕎米提取物具有較好的降血糖功效。
【專利說明】
具有降血糖功能的黑苦養(yǎng)米提取物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及功能食品領(lǐng)域，特別設(shè)及一種具有降血糖功效的黑苦養(yǎng)米提取物及其 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 養(yǎng)麥屬于寥科(Polygonaceae)養(yǎng)麥屬(Fagopyrium)，一年生草本，雙子葉植物。養(yǎng) 麥又名Ξ角麥、烏麥，生育期短、耐冷凍瘡薄，是糧食作物中比較理想的填閑補種作物。到目 前為止，養(yǎng)麥屬中研究較多的化學(xué)成分是黃酬類化合物，該類化合物是養(yǎng)麥中最重要的生 物活性物質(zhì)之一，廣泛存在于養(yǎng)麥特別是苦養(yǎng)的花、莖、也和種子中，具有抗氧化、防治冠屯、 病、降低膽固醇等多種保健功能（Krk〇§k〇v& B，化自Z0V自Z.Prophylactic components of buckwheat[J] .Food Research International ,2005,38(5): 561-568.)。養(yǎng)麥分為苦養(yǎng)麥 和甜養(yǎng)麥，苦養(yǎng)種子和植株中黃酬類化合物的含量均高于甜養(yǎng)。養(yǎng)麥黃酬類化合物主要包 括蘆下、搬皮素、山奈酪、桑色素、金絲桃巧等化合物，其中蘆下又稱蕓香巧，維生素 P，占苦 養(yǎng)中黃酬總量的75% W上（中國苦養(yǎng)[M].科學(xué)出版社，2009.;李丹.苦養(yǎng)麥加工與利用的研 究:博±學(xué)位論文[D].，2001.)。
[0003] 糖尿病是由多種病因所引起的W高血糖為特征的代謝素亂性疾病。高血糖主要是 由膜島素分泌不足或其生物功能障礙引起，進而會導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂肪等代謝素亂，造成各種 組織，特別是眼、屯、臟、腎、血管、神經(jīng)的慢性損害及功能衰竭。隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，生 活水平的逐漸提高和生活模式的改變，全球糖尿病患者數(shù)逐年成上升趨勢。糖尿病目前已 經(jīng)成為威脅人類健康的重大疾病，是世界上最普遍和最具挑戰(zhàn)性的重大公共衛(wèi)生問題之 一。相關(guān)研究表明，黃酬具有體外和體內(nèi)的降血糖效果(李勝華，伍賢進，曾軍英，等.蛇含委 陵菜總黃酬的體外和體內(nèi)降血糖效果研究[J].食品科學(xué)，2014,11:049.)。肝臟是糖代謝作 用的地點之一，參與糖原的合成，HepG2細(xì)胞來源于人體肝組織，具有肝細(xì)胞的功能和形態(tài)， 因而可W采用化pG2細(xì)胞模型，來觀察黑苦養(yǎng)米提取物的降糖作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種具有黑苦養(yǎng)米提取物的制備方法，采用超聲 處理、乙醇提取和液相色譜分離制備方法獲得高純度黑苦養(yǎng)米提取物，經(jīng)該法制備所得的 黑苦養(yǎng)米提取物具有降血糖活性。
[0005] 本發(fā)明通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)，提取步驟如下：
[0006] (1)將黑苦養(yǎng)米粉碎、過20目篩處理后，得到黑苦養(yǎng)米原料；
[0007] (2)取步驟（1)得到的黑苦養(yǎng)米原料，加入料液比為1:20-1: 25、體積分?jǐn)?shù)為50- 60%的乙醇溶液;在150~250W頻率下超聲波處理10~30min后，繼續(xù)在40-75°C條件下，攬 拌提取30-75min后，冷卻至室溫，將提取液在4°C、3000~6000巧m下冷凍離屯、10-30min，收 集上清液；
[000引（3)取步驟(2)的上清液，在40°C條件下減壓濃縮，回收乙醇，濃縮至原體積的20- 25%，得到濃縮液；
[0009] (4)將步驟(3)得到的濃縮液進行液相色譜分離，收集分離液，分離液經(jīng)真空冷凍 干燥得到黑苦養(yǎng)米提取物。
[0010] 作為本發(fā)明的黑苦養(yǎng)米黃酬提取方法的改進，步驟(4)所述的液相色譜分離條件 為：
[0011] 色譜柱為Promosi 1 C18(4.6 X 250mm，5μπι)，即色譜柱孔內(nèi)徑4.6mm，長度250mm，色 譜柱填料顆粒直徑如m，流速為ImL/min，柱溫控制為30°C ;
[0012] 流動相由流動相A和流動相B組成，流動相A為0.1 %甲酸水溶液，流動相B為乙臘；
[0013] 采用梯度洗脫方式，洗脫流程為：
[0014] 0-5min時，流動相B的體積濃度為5% ;
[0015] 5-25111111時，流動相8的體積濃度為5-16%;
[0016] 25-33111111時，流動相8的體積濃度為16-30%;
[0017] 33-35111111時，流動相8的體積濃度為30-90%;
[0018] 35-40min時，流動相B的體積濃度為90% ;
[0019] 40-45111111時，流動相8的體積濃度為90-5%;
[0020] 45-50min時，流動相B的體積濃度為5% ;
[0021] 收集20-30min時間段內(nèi)的洗脫液，冷凍干燥至恒重后，得到黑苦養(yǎng)米提取物。
[0022] 本發(fā)明中，所得到的黑苦養(yǎng)米提取物中有效成分為蘆下，蘆下質(zhì)量百分比含量為 87-95%。
[0023] 本發(fā)明的黑苦養(yǎng)米提取物具有降血糖功效。可用于制備W高血糖為特征的醫(yī)學(xué)病 癥的治療藥物或用于制備具有降血糖功能的功能性食品。
[0024] 作為優(yōu)選，黑苦養(yǎng)米提取物的有效降血糖劑量為50μg/ml。
[0025] 本發(fā)明具有W下優(yōu)點及效果：
[0026] 1、本發(fā)明主要采用超聲波輔助乙醇提取，具有環(huán)保、方便和高效的優(yōu)點
[0027] 2、通過液相色譜制備的方法，可W得到高純度的苦養(yǎng)米提取物
[0028] 3、所得的苦養(yǎng)米提取物具有較好的降血糖生物活性
【附圖說明】
[0029] 圖1黑苦養(yǎng)米提取物液相圖；
[0030] 圖2為實施例1制備的黑苦養(yǎng)米提取物提高化pG2細(xì)胞對葡萄糖的消耗作用；
[0031] 圖3為實施例2制備的黑苦養(yǎng)米提取物對α-淀粉酶活性的抑制作用。
【具體實施方式】
[0032] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步描述，W下列舉的僅是本發(fā)明的具體實施 例，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：
[0033] 本發(fā)明的實施例W黑苦養(yǎng)米為原料。
[0034] 實施例1
[0035] (1)將黑苦養(yǎng)米粉碎、過20目篩處理后，得到黑苦養(yǎng)米原料；
[0036] (2)取5g步驟（1)得到的黑苦養(yǎng)米原料，加入125mL食品級50 %的乙醇溶液，在150W 頻率下超聲波處理20min;然后在65°C條件下，攬拌提取70min后，冷卻至室溫，將提取液在4 °C、5000巧m下冷凍離屯、lOmin，收集上清液；
[0037] (3)取步驟(2)的上清液，在40°C條件下減壓濃縮，回收乙醇，濃縮至30ml，得到濃 縮液；
[0038] (4)將步驟(3)得到的濃縮液進行液相色譜分離，收集分離液，分離液經(jīng)真空冷凍 干燥得到黑苦養(yǎng)米提取物，具體液相色譜分離條件為：
[0039] 液相色譜儀器為Dionex ultimate 3000,檢測器為UV檢測器，檢測波長為260nm， 色譜柱為Promosil C18(4.6X250mm，5皿），進樣量為10μl，流速為lmL/min，柱溫控制為30 。。
[0040] 流動相由流動相A和流動相B組成，流動相A為0.1 %甲酸水溶液，流動相B為乙臘； [0041 ]采用梯度洗脫方式，洗脫流程為：
[0042] 0-5min時，流動相B的體積濃度為5% ;
[0043] 5-25111111時，流動相8的體積濃度為5-16%;
[0044] 25-33111111時，流動相8的體積濃度為16-30%;
[0045] 33-35111111時，流動相8的體積濃度為30-90%;
[0046] 35-40min時，流動相B的體積濃度為90% ;
[0047] 40-45111111時，流動相8的體積濃度為90-5%;
[004引 45-50min時，流動相B的體積濃度為5% ;
[0049] 收集20-30min時間段內(nèi)的洗脫液，-60°C冷凍干燥至恒重后，得到黑苦養(yǎng)米提取物 lOSmgo
[0050] 經(jīng)HPLC檢測，所得到的黑苦養(yǎng)米提取物中有效成分為蘆下，蘆下質(zhì)量百分比含量 為95%，見圖1。
[0化1]實施例2
[0化2] 將實施例1步驟(2)中的乙醇濃度由50%改為55%，超聲頻率由150W改為200W，超 聲波處理時間由20min改為lOmin，攬拌提取時間由70min改為75min，離屯、條件由5000rpm改 為3000巧m，離屯、時間由lOmin改為30min，其余同實施例1.
[0053] 最終得到黑苦養(yǎng)米提取物97mg。
[0054] 經(jīng)HPLC檢測，所得到的黑苦養(yǎng)米提取物中有效成分為蘆下，蘆下質(zhì)量百分比含量 為 90 %。
[0化5] 實施例3
[0056] 將實施例1步驟(2)中提取溫度由65°C改為40°C，超聲頻率由150W改為250W，超聲 波處理時間由20min改為30min，攬拌提取時間由70min改為30min，離屯、條件由5000巧m改為 4000巧m，離屯、時間由lOmin改為20min，步驟(3)中濃縮體積由500ml改為625ml，其余同實施 例1.
[0057] 最終得到黑苦養(yǎng)米提取物lOlmg。
[0058] 經(jīng)HPLC檢測，所得到的黑苦養(yǎng)米提取物中有效成分為蘆下，蘆下質(zhì)量百分比含量 93%。
[0化9] 實施例4
[0060] 將實施例1步驟(2)中乙醇濃度由50%改為60%，超聲頻率由150W改為250W，離屯、 條件由5000巧m改為6000巧m，離屯、時間由lOmin改為15min，，其余同實施例1.
[0061] 最終得到黑苦養(yǎng)米提取物118mg。
[0062] 經(jīng)HPLC檢測，所得到的黑苦養(yǎng)米提取物中有效成分為蘆下，蘆下質(zhì)量百分比含量 為 89 %。
[0063] 實施例5
[0064] 將實施例1步驟(2)中的乙醇濃度由50%改為60%，超聲波處理時間由20min改為 15min，提取溫度由65°C改為75°C，攬拌提取時間由70min改為60min，其余同實施例1.
[0065] 最終得到黑苦養(yǎng)米提取物96mg。
[0066] 經(jīng)HPLC檢測，所得到的黑苦養(yǎng)米提取物中有效成分為蘆下，蘆下質(zhì)量百分比含量 為 91 %。
[0067] 實施例6
[006引將實施例1步驟（2)中乙醇溶液體積由125mL改為lOOmL，乙醇濃度由50 %改為 55 %，攬拌提取時間由70min改為65min，步驟(3)中濃縮體積由500ml改為600ml，其余同實 施例1.
[0069] 最終得到黑苦養(yǎng)米提取物107mg。
[0070] 經(jīng)HPLC檢測，所得到的黑苦養(yǎng)米提取物中有效成分為蘆下，蘆下質(zhì)量百分比含量 為 87%。
[0071 ]實施例7
[0072] 將實施例1步驟（2)中中乙醇溶液體積由125mL改為1 lOmL，乙醇濃度由50 %改為 55%，提取溫度由65°C改為60°C，攬拌提取時間由70min改為65min，步驟(3)中濃縮體積由 500ml改為450ml，其余同實施例1.
[0073] 最終得到黑苦養(yǎng)米提取物109mg。
[0074] 經(jīng)HPLC檢測，所得到的黑苦養(yǎng)米提取物中有效成分為蘆下，蘆下質(zhì)量百分比含量 為 92%。
[00對性能測試
[0076] W實施例1制備的黑苦養(yǎng)米提取物為樣品，測試其降血糖活性
[0077] 1、H邱G2細(xì)胞葡萄糖消耗實驗
[0078] 收集對數(shù)期的化pG2細(xì)胞，將細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（濃度為5 X103個細(xì) 胞/孔），解育24h后；用黑苦養(yǎng)米提取物處理化pG2細(xì)胞2地，然后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，使用葡萄 糖試劑盒測定培養(yǎng)液中的葡萄糖消耗量。按照參考文獻的方法，采用Μ?Τ法檢測細(xì)胞的存活 率用W矯正數(shù)據(jù)。將移除培養(yǎng)基后的細(xì)胞用MTT(0.5mg/mL)解育地。生成的沉淀物溶解于 150化的DMS0中，用酶標(biāo)儀檢測費490nm處的吸光度。實驗結(jié)果表明（見圖2)，50μg/ml黑苦養(yǎng) 米提取物可W提升化pG2細(xì)胞50%的葡萄糖消耗能力，具有較好的降血糖效果。
[0079] W實施例2制備的黑苦養(yǎng)米提取物為樣品，測試其降血糖活性
[0080] 2、α-淀粉酶活性抑制作用實驗
[0081 ] Β)500μ1黑苦養(yǎng)米提取物（Img/ml)和500μ1 0.02mol/l憐酸鋼緩沖液(含有0.5mg/ mla-淀粉酶和6mm〇Vl氯化鋼，P冊.9)混合，在25°C下反應(yīng)30分鐘；
[0082] b)加入500μ1的0.02M憐酸鋼緩沖液(含0.5%淀粉和6mmoVI氯化鋼，P冊.9);
[0083] c)加入lml水楊酸（DNS試劑，含l%3,5-二硝基水楊酸和12%酒石酸鐘鋼溶于 0.4mol/l NaOH).)W終止反應(yīng)；
[0084] d)在沸水條件下水浴10分鐘，然后冷卻至室溫；
[00化]e)稀釋至15ml，在540nm波長下測定吸光值；
[0086] f)W二甲雙脈作為陽性對照；
[0087] g)抑制率計算公式:抑制率=(1-Asample 540/Acont;rol 540) X 100%
[0088] 實驗結(jié)果表明（見圖3)lmg/ml的黑苦養(yǎng)米提取物對α-淀粉酶的抑制效果與4mg/ml 二甲雙脈相當(dāng)。
【主權(quán)項】
1. 一種黑苦蕎米提取物的制備方法，其特征在于，提取步驟如下： (1) 將黑苦蕎米粉碎、過20目篩處理后，得到黑苦蕎米原料； (2) 取步驟（1)得到的黑苦蕎米原料，加入料液比為1: 20-1: 25、體積分?jǐn)?shù)為50-60 %的 乙醇溶液;在150~250W頻率下超聲波處理10~30min后，繼續(xù)在40-75°C條件下，攪拌提取 30-75min后，冷卻至室溫，將提取液在4°C、3000~6000rpm下冷凍離心10-30min，收集上清 液； (3) 取步驟(2)的上清液，在40°C條件下減壓濃縮，回收乙醇，濃縮至原體積的20-25%， 得到濃縮液； (4) 將步驟(3)得到的濃縮液進行液相色譜分離，收集分離液，分離液經(jīng)真空冷凍干燥 得到黑苦蕎米提取物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黑苦蕎米提取物，其特征在于，步驟(4)所述的液相色譜分離 條件為： 色譜柱為Promosil C18(4.6 X250mm，5ym)，流速為lmL/min，柱溫控制為30°C ; 流動相由流動相A和流動相B組成，流動相A為0.1 %甲酸水溶液，流動相B為乙腈； 采用梯度洗脫方式，洗脫流程為： 0-5min時，流動相B的體積濃度為5 % ; 5-2511^11時，流動相8的體積濃度為5-16%; 25-3311^11時，流動相8的體積濃度為16-30%; 33-3511^11時，流動相8的體積濃度為30-90%; 35-40min時，流動相B的體積濃度為90 % ; 40-45min時，流動相B的體積濃度為90-5 % ; 45-50min時，流動相B的體積濃度為5% ; 收集20-30min時間段內(nèi)的洗脫液，冷凍干燥至恒重后，得到黑苦蕎米提取物。3. -種如權(quán)利要求1所述方法制備的黑苦蕎米提取物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的黑苦蕎米提起物，其特征在于所述的黑苦蕎米提取物中的蘆 丁質(zhì)量百分比含量為87-95%。5. -種根據(jù)權(quán)利要求3所述的黑苦蕎米提取物的應(yīng)用，其特征在于用于制備以高血糖 為特征的醫(yī)學(xué)病癥的治療藥物或用于制備具有降血糖功能的功能性食品。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于，所述的黑苦蕎米提取物的有效降血糖劑量為 50μg/ml〇
【文檔編號】A23L33/105GK105920114SQ201610246915
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月18日
【發(fā)明人】陳衛(wèi), 孫崇德, 牛興和, 王冶, 楊海鶯, 陳歷水, 鮑濤
【申請人】浙江大學(xué), 中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司