一種用于口服蛋白免疫的納米混懸劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于口服蛋白免疫的納米混懸劑及其制備方法，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。以牛血清白蛋白(BSA)為模型藥物，以PLGA為載體，采用溶劑揮發(fā)法制備載有BSA的MCS/PLGA/BSA納米混懸劑。粒徑為532.8nm，ζ電位為28.92mv，包封率為89.34％。甘露糖化殼聚糖(MCS)通過靜電作用吸附在PLGA/BSA納米粒表面，不僅提高了納米粒在胃腸液中的穩(wěn)定性，還延長(zhǎng)了納米粒在腸腔的滯留時(shí)間，而且?guī)д姷募{米粒更容易被細(xì)胞攝取。納米粒利用濾泡相關(guān)上皮對(duì)納米粒的轉(zhuǎn)運(yùn)作用轉(zhuǎn)移至PP結(jié)，通過甘露糖配體與抗原呈遞細(xì)胞(APCs)上的甘露糖受體結(jié)合，增加APCs攝取，從而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。
【專利說明】
一種用于口服蛋白免疫的納米混懸劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種用于口服蛋白免疫的納米混懸劑及其制備方法，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]疫苗是預(yù)防感染性疾病最有效的方法之一。黏膜暴露在大量的共生菌和病原微生物中，是感染發(fā)生的首要區(qū)域，而且在一個(gè)健康成年人體內(nèi)，黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)占了所有免疫細(xì)胞的80%，是最大的哺乳動(dòng)物淋巴系統(tǒng)。然而，絕大多數(shù)的上市疫苗均為肌注疫苗，肌注免疫雖然能產(chǎn)生強(qiáng)效的全身免疫反應(yīng)，但是不能在黏膜部位誘導(dǎo)強(qiáng)效的免疫反應(yīng)。因此，與注射疫苗相比，黏膜疫苗有著諸多優(yōu)勢(shì)，包括誘導(dǎo)有效的粘膜免疫反應(yīng)及全身免疫反應(yīng)，產(chǎn)生黏膜IgA和血清IgG抗體，避免疼痛，降低注射感染的風(fēng)險(xiǎn)。此外，抗原在某一黏膜部位給藥不僅能在該部位誘導(dǎo)產(chǎn)生局部黏膜免疫反應(yīng)，而且能在較遠(yuǎn)黏膜部位產(chǎn)生免疫反應(yīng)，這些都使得黏膜成為疫苗免疫的理想位點(diǎn)。雖然鼻腔、直腸及陰道給藥都能誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)，但是它們不足以對(duì)抗腸道感染，而且給藥不方便。相反，疫苗口服能產(chǎn)生有效的局部粘膜免疫并增加病人順應(yīng)性，而且不需要專業(yè)訓(xùn)練。
[0003]1960年出現(xiàn)的第一個(gè)口服疫苗-Sabin脊髓灰質(zhì)炎疫苗，首次引入了口服黏膜免疫接種的概念。目前，研究人員開發(fā)了許多用于口服免疫的疫苗，包括預(yù)防霍亂和傷寒的細(xì)菌疫苗以及輪狀病毒感染的病毒疫苗。雖然這些減活或滅活的細(xì)菌或病毒能誘導(dǎo)體液及細(xì)胞免疫，但是它們自身存在穩(wěn)定性和安全性問題?，F(xiàn)代疫苗學(xué)的重心是研發(fā)由純化的亞單位，例如多肽、蛋白抗原組成的疫苗。然而，這類抗原口服很難吸收，主要是因?yàn)樗鼈凁つB透性差，而且在胃腸道內(nèi)不穩(wěn)定。它們的免疫原性甚至比傳統(tǒng)疫苗還低。
[0004]為了解決蛋白疫苗在胃腸道不穩(wěn)定的問題，研究人員開發(fā)了一系列的聚合物載體系統(tǒng)。從藥劑角度來看，聚合物載體系統(tǒng)有著特別之處。首先，它們?cè)谖改c道內(nèi)比其它的膠體載體，例如脂質(zhì)體，更加穩(wěn)定，能保護(hù)被包封的藥物不受胃腸道環(huán)境干擾。其次，各種聚合物材料的使用對(duì)理化性質(zhì)(疏水性、ζ電位)、藥物釋放性質(zhì)(推遲、延長(zhǎng)、觸發(fā))及納米粒的釋放行為(靶向、生物粘附、細(xì)胞攝取提高)進(jìn)行修飾、調(diào)整。最后，可以通過微粒表面吸附或化學(xué)連接特定分子例如PEG(聚乙二醇)，泊洛沙姆及生物活性物質(zhì)(凝集素、侵襲素)等進(jìn)行修飾。此外，與更大的載體相比，它們亞微米的粒徑及較大的比表面積都支持它們的吸附。所以，多肽和蛋白經(jīng)納米包裹后能對(duì)抗胃腸道內(nèi)的惡劣環(huán)境，并增強(qiáng)它們跨黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)。
[0005]PLGA具有可生物降解性和生物相容性，降解產(chǎn)物無毒，無致畸、無致癌性，已列入FDA GRAS安全化合物。PLGA包裹蛋白抗原后能保護(hù)蛋白抗原免受胃腸道內(nèi)惡劣環(huán)境及各種酶的破壞。然而腸腔內(nèi)杯狀細(xì)胞分泌大量粘液覆蓋在腸上皮細(xì)胞表面，粘液層作為一個(gè)復(fù)雜而又強(qiáng)效的屏障，通過快速清除外源微粒來保護(hù)腸上皮細(xì)胞表面。因此，腸細(xì)胞表面的粘液層嚴(yán)重影響了上皮細(xì)胞對(duì)疏水性納米粒的攝取。PLGA表面疏水，不易滲透進(jìn)入粘液層，很難被腸上皮細(xì)胞攝取。
[0006]殼聚糖(chitosan，CS)是一種陽(yáng)離子聚合物，具有良好的生物相容性和生物可降解性，有利于納米粒粘附在細(xì)胞表面，并具有打開腸上皮細(xì)胞間緊密連接的能力。CS通過靜電作用吸附在PLGA納米粒表面，不僅可以增加載體的親水性，促進(jìn)PLGA納米粒滲透進(jìn)入粘液層，增加細(xì)胞攝取，而且可以通過激活樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞來增強(qiáng)免疫反應(yīng)。
[0007]有研究表明濾泡相關(guān)上皮(FAE)上存在甘露糖受體，納米粒表面的甘露糖配體與受體的結(jié)合促進(jìn)了 FAE對(duì)納米粒的轉(zhuǎn)運(yùn)。而且巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞(APCs)表面大量表達(dá)甘露糖受體，進(jìn)入Peyer，s patches (PPs)內(nèi)的納米粒通過糖類識(shí)別機(jī)制，借助受體介導(dǎo)的APCs主動(dòng)靶向，增加APCs對(duì)疫苗的攝取，提高疫苗的免疫原性，從而增強(qiáng)免疫反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明針對(duì)蛋白疫苗口服后易失活、療效差，且肌注疫苗無法誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫反應(yīng)等問題，設(shè)計(jì)了一種用于口服蛋白免疫的納米混懸劑，利用FAE對(duì)納米粒的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，將載有蛋白抗原的納米粒運(yùn)送至巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等APCs附近，借助受體介導(dǎo)的APCs主動(dòng)靶向，增加APCs對(duì)疫苗的攝取，從而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。
[0009]本發(fā)明提供了CS/PLGA/BSA納米混懸劑及其制備方法，具體制備過程是:
[0010](I)將PLGA溶解于適量二氯甲烷中，作為油相；
[0011](2)將蛋白藥物BSA加入去離子水中，使其緩慢溶脹，然后磁力攪拌至完全溶解，作為內(nèi)水相；
[0012](3)將甘露糖化殼聚糖(MCS)溶于0.5%的醋酸溶液中，使其緩慢溶脹，然后磁力攪拌至完全溶解，再用氫氧化鈉溶液將其pH調(diào)至5.5左右；
[0013](4)將泊洛沙姆188加入去離子水中，使其緩慢溶脹，然后磁力攪拌至完全溶解；
[0014](5)將MCS溶液與泊洛沙姆188溶液按一定體積比混合，作為外水相；
[0015](6)將內(nèi)水相加至油相中，在冰浴條件下，探頭超聲一段時(shí)間，得到水/油初乳；
[0016](7)將油包水初乳加至外水相中，在冰浴條件下，探頭超聲一段時(shí)間，得到水/油/水復(fù)乳；
[0017](8)將復(fù)乳加至稀釋液中，冰浴條件下，磁力攪拌過夜，即得MCS/PLGA/BSA納米混懸劑。
[0018]本發(fā)明制備過程(I)中，PLGA為羧基末端，分子量為15000，乳酸與羥基乙酸的比例為75:25。
[0019]本發(fā)明制備過程(2)中，所選擇的藥物僅為模型藥物BSA，但不局限于此，藥物還可以是用于預(yù)防小兒麻痹癥、流感等疾病的蛋白疫苗。
[0020]本發(fā)明制備過程(3)中，MCS分子量為115kDa，脫乙酰基度>95%，甘露糖取代度
11.2% ;MCS溶液濃度在0.125mg/ml?4mg/ml，優(yōu)選2mg/ml。
[0021 ]本發(fā)明制備過程(5)中，MCS溶液為lmL，泊洛沙姆188溶液為4mL;外水相中泊洛沙姆濃度在0.1%?5%，優(yōu)選I %。
[0022]處方中BSA與PLGA的質(zhì)量比在1:1?1:10，優(yōu)選1:4;?11^濃度在511^/1^?8011^/1^，優(yōu)選 40mg/mL;
[0023]處方中內(nèi)水相、油相和外水相的體積比為0.25:1:5。
[0024]本發(fā)明制備過程(6)中，初乳超聲功率為70?500W，優(yōu)選為300W，初乳超聲時(shí)間為9s (工作時(shí)間Is，休息時(shí)間2s)。
[0025]本發(fā)明制備過程(7)中，復(fù)乳超聲功率為70?500W，優(yōu)選為150W，復(fù)乳超聲時(shí)間為為6s?60s，優(yōu)選為15s(工作時(shí)間Is，休息時(shí)間2s)。
[0026]本發(fā)明制備過程(8)中，稀釋液是0.1%泊洛沙姆188溶液，體積為20ml。
[0027]本發(fā)明制備過程(6)、(7)、(8)中均采用冰浴條件。
[0028]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0029]I )PLGA對(duì)藥物的包封率普遍較低，而藥物損失率較高。本發(fā)明采用溶劑揮發(fā)法，進(jìn)行兩次探頭超聲，探頭超聲可以使PLGA納米粒粒徑分布更加均勻。在超聲及溶劑揮發(fā)步驟中均采用冰浴條件，低溫不僅可以保護(hù)蛋白藥物結(jié)構(gòu)，還可以明顯提高藥物包封率。
[0030 ] 2)本發(fā)明采用MCS包裹PLGA/BSA納米粒，MCS通過靜電作用吸附在PLGA/BSA納米粒表面，不僅提高了納米粒在胃腸液中的穩(wěn)定性，還延長(zhǎng)了納米粒在腸腔的滯留時(shí)間，而且?guī)д姷募{米粒更容易被上皮細(xì)胞攝取。納米粒表面的甘露糖配體與FAE表面的甘露糖受體之間的相互作用促進(jìn)了納米粒的轉(zhuǎn)運(yùn)，轉(zhuǎn)運(yùn)至PPs內(nèi)部的納米粒借助受體介導(dǎo)的APCs主動(dòng)靶向，增加APCs對(duì)納米粒的攝取，從而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。
[0031]3)本發(fā)明的制備方法對(duì)儀器設(shè)備要求不高，工藝過程簡(jiǎn)單，可進(jìn)行放大工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0032]實(shí)施例1:
[0033]PLGA/BSA納米混懸劑的制備:
[0034](I)精密稱取40mgPLGA，溶于ImL二氯甲烷中，作為油相。
[0035](2)精密稱取40mgBSA，溶于ImL去離子水中，作為內(nèi)水相。
[0036](3)精密稱取1.25g泊洛沙姆188，溶于10mL去離子水中，得到1.25 %的泊洛沙姆188溶液。
[0037](4)精密稱取0.1g泊洛沙姆188，溶于10mL去離子水中，作為稀釋液。
[0038](5)用氫氧化鈉溶液將5mL 0.5%醋酸溶液的pH調(diào)至5.5左右，用去離子水定容至10mL，得到醋酸鹽緩沖液。
[0039](6)將ImL醋酸鹽緩沖液與4mL 1.25%泊洛沙姆188溶液混合，得到外水相。
[0040](7)將0.25mL內(nèi)水相加至油相中，冰浴條件下，探頭超聲9s(300W，工作時(shí)間ls，休息時(shí)間2s)，得到水/油初乳。
[0041 ] (8)將初乳加至外水相中，冰浴條件下，探頭超聲15s(150W，工作時(shí)間Is，休息時(shí)間2s)，得到水/油/水復(fù)乳。
[0042](9)將復(fù)乳加至20mL稀釋液中，冰浴條件下，磁力攪拌過夜，即得PLGA/BSA納米混懸劑。粒徑大小為407.8nm，多分散系數(shù)為0.157，ζ電位為-31.54mv，包封率為85.03%。
[0043]實(shí)施例2:
[0044]CS/PLGA/BSA納米混懸劑的制備:
[0045](I)精密稱取40mgPLGA，溶于ImL二氯甲烷中，作為油相。
[0046](2)精密稱取40mg BSA，溶于ImL去離子水中，作為內(nèi)水相。
[0047](3)精密稱取1.25g泊洛沙姆188，溶于10mL去離子水中，得到1.25 %的泊洛沙姆188溶液。
[0048](4)精密稱取0.1g泊洛沙姆188，溶于10mL去離子水中，作為稀釋液。
[0049](5)精密稱取5mg殼聚糖，溶于5mL 0.5%的醋酸溶液中，完全溶解后，再用氫氧化鈉溶液將其pH調(diào)至5.5左右，加去離子水定容至1mL，得到濃度為0.5mg/mL的殼聚糖溶液。
[0050](6)將ImL殼聚糖溶液與4mL 1.25%泊洛沙姆188溶液混合，得到外水相。
[0051 ] (7)將0.25mL內(nèi)水相加至油相中，冰浴條件下，探頭超聲9s(300W，工作時(shí)間ls，休息時(shí)間2s)，得到水/油初乳。
[0052](8)將初乳加至外水相中，冰浴條件下，探頭超聲15s(150W，工作時(shí)間Is，休息時(shí)間2s)，得到水/油/水復(fù)乳。
[0053](9)將復(fù)乳加至20mL稀釋液中，冰浴條件下，磁力攪拌過夜，即得CS/PLGA/BSA納米混懸劑。粒徑大小為422.7nm，多分散系數(shù)為0.107,ζ電位為-18.07mv，包封率為86.32%。
[0054]實(shí)施例3:
[0055]MCS/PLGA/BSA納米混懸劑的制備:
[0056]本實(shí)施例與實(shí)施例2基本相同，不同之處僅在于:用MCS替代CS，且MCS溶液濃度為2mg/mL。所得MCS/PLGA/BSA納米混懸劑的粒徑大小為532.8nm，多分散系數(shù)為0.184，ζ電位為28.92mv，包封率為89.34 %。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于口服蛋白免疫的納米混懸劑及其制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)將PLGA溶解于適量二氯甲烷中，作為油相； (2)將蛋白藥物BSA加入去離子水中，使其緩慢溶脹，然后磁力攪拌至完全溶解，作為內(nèi)水相； (3)將甘露糖化殼聚糖(MCS)溶于0.5%的醋酸溶液中，使其緩慢溶脹，然后磁力攪拌至完全溶解，再用氫氧化鈉溶液將其PH調(diào)至5.5左右； (4)將泊洛沙姆188加入去離子水中，使其緩慢溶脹，然后磁力攪拌至完全溶解； (5)將MCS溶液與泊洛沙姆188溶液按一定體積比混合，作為外水相； (6)將內(nèi)水相加至油相中，在冰浴條件下，探頭超聲一段時(shí)間，得到水/油初乳； (7)將油包水初乳加至外水相中，在冰浴條件下，探頭超聲一段時(shí)間，得到水/油/水復(fù)乳； (8)將復(fù)乳加至稀釋液中，冰浴條件下，磁力攪拌過夜，即得MCS/PLGA/BSA納米混懸劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于口服蛋白免疫的納米混懸劑及其制備方法，其特征在于:步驟(I)中PLGA為羧基末端，分子量為15000，乳酸與羥基乙酸的比例為75: 25。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于口服蛋白免疫的納米混懸劑及其制備方法，其特征在于:步驟(2)中所選擇的藥物僅為模型藥物BSA，但不局限于此，藥物還可以是用于預(yù)防小兒麻痹癥、流感等疾病的蛋白疫苗。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于口服蛋白免疫的納米混懸劑及其制備方法，其特征在于:步驟⑶中MCS分子量為115kDa，脫乙?；?gt;95%，甘露糖取代度11.2%。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于口服蛋白免疫的納米混懸劑及其制備方法，其特征在于:步驟(5)中MCS溶液為ImL，泊洛沙姆188溶液為4mL;MCS溶液濃度在0.125mg/ml?4mg/ml，優(yōu)選2mg/ml ；外水相中泊洛沙姆濃度在0.1 %?5 %，優(yōu)選I %。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于口服蛋白免疫的納米混懸劑及其制備方法，其特征在于:處方中BSA與PLGA的質(zhì)量比在1:1?1:10，優(yōu)選1:4;?1^^濃度在511^/1111?8011^/1111，優(yōu)選40mg/ml。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于口服蛋白免疫的納米混懸劑及其制備方法，其特征在于:處方中內(nèi)水相、油相和外水相的體積比為0.25:1:5。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于口服蛋白免疫的納米混懸劑及其制備方法，其特征在于:步驟(6)中探頭超聲功率為70?500W，優(yōu)選為300W;超聲時(shí)間為3s?15s，優(yōu)選為9s(工作時(shí)間Is，間隙時(shí)間2s);步驟(7)中探頭超聲功率為70?500W，優(yōu)選為150W;超聲時(shí)間為6s?60s，優(yōu)選為15s (工作時(shí)間I s，間隙時(shí)間2s)。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于口服蛋白免疫的納米混懸劑及其制備方法，其特征在于:步驟(8)中稀釋液是0.1 %泊洛沙姆188溶液，體積為20ml。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于口服蛋白免疫的納米混懸劑及其制備方法，其特征在于:步驟(6)、(7)、(8)中均采用冰浴條件。
【文檔編號(hào)】A61K47/48GK105919937SQ201610238914
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月14日
【發(fā)明人】王柏, 遲環(huán), 宗莉
【申請(qǐng)人】中國(guó)藥科大學(xué)