基的孔板中，同時以RANKL(終濃度50ng/ mL)、M-CSF(終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)BMMs細胞向破骨細胞分化。誘導(dǎo)培養(yǎng)72h后行FAK(Actin Cytoskeleton and Focal Adhesion Staining)免疫焚光染色（圖3中A圖）：細胞取出后棄 置培養(yǎng)基，1 X PBS洗兩遍，4 %多聚甲醛室溫下固定20min，1 X PBS洗兩遍，0.1 % Tr i tonX-100穿透細胞5min，l XPBS洗兩遍，封閉緩沖液（1%BSA in 1 XPBS)固定30min，一抗(Anti-Vinculin)于封閉緩沖液稀釋至工作濃度（1:300)，室溫孵育細胞111;1\沖洗緩沖液 (0.05%Tween_20in 1XPBS)洗三遍，每次5-lOmin;二抗（Alexa Fluor 488Goat Anti-Mouse IgG(H+L)抗體，Invitrogen)稀釋至工作濃度（1:500)，同時加入TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán) 肽（1: 500)，室溫下共同孵育lh ; 1 X wash buff er洗三遍，每次5-10min;室溫下DAPI (1: 1000)復(fù)染核5min，lX沖洗緩沖液洗三遍，每次5-10min;熒光顯微鏡觀察細胞。
[0049] 統(tǒng)計視野下破骨細胞數(shù)量以及破骨細胞平均核數(shù)，結(jié)果提示當(dāng)石墨烯量子點終濃 度超過Syg/mL時，破骨細胞的形成收到了明顯的抑制，#P<0.01 (圖3中B圖）。同時可見當(dāng) 石墨烯量子點終濃度超過5yg/mL時，多核破骨細胞(核數(shù)量大于3)的形成顯著降低，**P< 0.01(圖3中8圖）。
[0050] 4、石墨烯量子點抑制破骨細胞骨吸收能力 [0051 ] 分組情況：
[0052] 組1:無 RANKL、M-CSF誘導(dǎo)，無石墨烯量子點對照組；
[0053] 組2:RANKL(終濃度50ng/mL)+M-CSF(終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)，無石墨烯量子點對照 組；
[0054] 組3:RANKL(終濃度50ng/mL)+M-CSF(終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)，終濃度10yg/mL石墨烯 量子點實驗組；
[0055]組4: RANKL (終濃度 50ng/mL) +M-CSF (終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)，終濃度 100yg/mL 石墨 稀量子點實驗組。
[0056] 將BMMs細胞以4\103個/孔接種于鋪20(^111小牛骨片的48孔板，待細胞長滿后棄掉 培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為:DMEM高糖培養(yǎng)液+10%胎牛血清+1%雙抗(青鏈霉素），以終濃度為 0、10yg/mL、100yg/mL將石墨烯量子點加入各個含新鮮培養(yǎng)基的孔板中，同時以RANKL(終濃 度50ng/mL)、M-CSF(終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)BMMs細胞向破骨細胞分化(空白對照組除外）。96 小時后取出含小牛骨片的48孔板，棄置培養(yǎng)基，10%漂白劑(HC10)室溫漂白5min，雙蒸水清 洗3遍，每次5min，室溫下放置至干燥（3-5小時），甲苯胺藍染液染色5min，雙蒸水漂洗3-5 遍，每次5min，每孔加入200μ1雙蒸水或1 X PBS，光鏡下觀察。
[0057]骨表面經(jīng)破骨細胞吸收后可被甲苯胺藍染成藍色，根據(jù)藍色噬骨面積的大小和占 總骨面的百分比評價破骨細胞的噬骨能力。結(jié)果如圖4所示，可見未加入RANKL誘導(dǎo)的空白 對照組無骨吸收。加入RANKL(終濃度50ng/mL)、M-CSF(終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)，無石墨烯量子 點對照組骨吸收表面比例與實驗組相比最大(**P〈〇.01)。各實驗組隨著石墨烯量子點濃度 的提高，破骨細胞骨吸收能力顯著下降，毒性劑量內(nèi)最明顯的石墨烯量子點終濃度為i〇yg/ mL(**P〈0.01)。
[0058] 5、石墨烯量子點抑制破骨細胞分化特異基因的表達
[0059] 分組情況：
[0060] 組1:無 RANKL、M-CSF誘導(dǎo)，無石墨烯量子點對照組；
[0061 ] 組2:RANKL(終濃度50ng/mL)+M-CSF(終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)，無石墨烯量子點對照 組；
[0062] 組3: RANKL (終濃度50ng/mL) +M-CSF (終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)，終濃度1 Oyg/mL石墨烯 量子點實驗組；
[0063] 組4: RANKL (終濃度 50ng/mL) +M-CSF (終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)，終濃度 100yg/mL 石墨 稀量子點實驗組。
[0064] 將BMMs細胞以1 X 103個/孔接種于96孔板，待細胞長滿后棄掉培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分 為:DMEM高糖培養(yǎng)液+10 %胎牛血清+1 %雙抗(青鏈霉素），以終濃度為0、10yg/mL、100yg/mL 將石墨烯量子點加入各個含新鮮培養(yǎng)基的孔板中，同時以RANKL(終濃度50ng/mL)、M-CSF (終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)BMMs細胞向破骨細胞分化，誘導(dǎo)培養(yǎng)72h后取出，棄置培養(yǎng)基，用 Trizol裂解細胞，提取細胞內(nèi)的總RNA，實時定量RT-PCR對目的基因 Ctsk、c-fos、NFATcl、 DC-STAMP行定量檢測。引物信息如下：
[0065] Ctsk正向引物：5'-gcggcattaccaacat-3'，（SEQ ID NO. 1);
[0066] Ctsk反向引物：5'-ctggaagcaccaacga-3'，（SEQ ID Ν0· 2);
[0067] c-fos正向引物：5'-aggcagaaccctttga-3'，（SEQ ID NO. 3);
[0068] c-fos反向引物：5'-ggtgaccacgggagta-3'，（SEQ ID NO.4);
[0069] NFATcl正向引物：5'-gaggagttggctcagtg-3'，（SEQ ID NO. 5);
[0070] NFATcl反向引物：5'-tagcgttccgttcgtt-3'，（SEQ ID NO.6);
[0071 ] DC-STAMP正向引物：5'-gacagagtacgtagccacacgtt-3'，（SEQ ID NO.7);
[0072] DC-STAMP反向引物：5'-agcccacagaccaaatatcaa-3'，（SEQ ID NO.8) 〇
[0073] 每組做獨立實驗5復(fù)孔，雙內(nèi)參(GAPDH，actin)對照。
[0074] 實驗結(jié)果見圖5,結(jié)果提示石墨烯量子點濃度依賴性抑制破骨細胞標(biāo)志物Ctsk和 DC-STMAP的表達，石墨烯量子點濃度為10yg/mL時產(chǎn)生抑制作用(***?〈0.001)，石墨烯量子 點濃度升高至l〇〇yg/mL時抑制作用進一步加強(**?〈0.01)。通過進一步檢測破骨細胞分化 特異相關(guān)基因，篩選出變化顯著的基因如下：^〇8、(^1^、即41'(31、0(：-3了4103。另外，^〇8、 (^81即41'〇1、0(：-3了410 3基因表達均在石墨烯量子點濃度為1(^8/11^時顯著降低（**?〈 0.01)?？傻贸鼋Y(jié)論石墨烯量子點通過抑制破骨細胞分化特異性基因 c-f〇s、Ctsk、NFATcl、 DC-STAMP的表達進而抑制破骨細胞的分化，形成，成熟和骨吸收能力。
[0075] 6、石墨烯量子點明顯改善0VX小鼠（卵巢切除小鼠）骨質(zhì)疏松
[0076] 0VX骨質(zhì)疏松小鼠模型建立:取48只8周齡C57BL/6J雌性小鼠，體重為18-22g，戊巴 比妥鈉(50mg/kg)麻醉，手術(shù)組(0VX組)背側(cè)入路切除小鼠雙側(cè)卵巢，對照組（Sham組)行假 手術(shù)，暴露卵巢后縫合關(guān)閉切口。術(shù)后一周開始給予石墨烯量子點，共持續(xù)8周，每周2次。石 墨烯量子點給予方法為溶解于無菌生理鹽水中腹腔注射，給予劑量為l〇mg/kg，對照組則給 予同等劑量的生理鹽水。小鼠被隨機分為四組:①手術(shù)組+給予石墨烯量子點組(n=12)，② 手術(shù)組+給予生理鹽水對照組(n = 12 )，③Sham組+給予石墨烯量子點組(η = 12 )，④Sham組+ 給予生理鹽水對照組(η = 12)。
[0077]平均骨密度檢測與骨代謝標(biāo)志物檢測:8周給藥完成后每只小鼠分離左側(cè)股骨，去 除多余軟組織，固定，心臟采血獲得血液樣本，通過小動物mi croCT檢測骨微結(jié)構(gòu)進行分析， 管電壓為50kV，管電流為0.1mA，分辨率為8mm。股骨掃描區(qū)域限定為遠端干垢端，向近端的 初級松質(zhì)近末端區(qū)域延伸2mm。選定的感興趣區(qū)（R0I)的3D參數(shù)用于數(shù)據(jù)分析，包括:骨礦物 質(zhì)密度、骨小梁數(shù)量、相對骨體積分數(shù)。
[0078] 結(jié)果如圖6所示，相對于假手術(shù)組(Sham組），0VX小鼠的骨密度和骨體積分數(shù)明顯 下降，同時連接密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度也有所降低。然而，通過給予石墨烯量子點 后，0VX組小鼠的骨密度、骨體積分數(shù)、連接密度、骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度相對0VX組都顯 著提高，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異(P〈〇.05)。因此得出結(jié)論石墨烯量子點能夠?qū)Υ萍に厝狈?dǎo) 致的骨質(zhì)疏松起到保護作用。
[0079] 綜上所述，石墨烯量子點對破骨細胞的分化、形成、成熟以及骨吸收能力均有顯著 的抑制作用，基于該功能，石墨烯量子點可應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的防治，尤其是破骨細胞活躍相 關(guān)的骨質(zhì)疏松癥中。
[0080] 最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通 過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在 形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項】
1. 石墨烯量子點在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的石墨烯量子點在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用，其特征 在于，所述石墨烯量子點的使用量至少為lmg/kg體重。3. 含石墨烯量子點的化合物在制備用于防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。4. 石墨烯量子點在制備用于抑制破骨細胞前體細胞融合或分化成熟的藥物中的應(yīng)用。5. 石墨烯量子點在制備用于抗成熟破骨細胞噬骨能力的藥物中的應(yīng)用。6. 石墨烯量子點在制備用于抑制破骨細胞分化、融合或成熟相關(guān)基因表達的藥物中的 應(yīng)用。7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述破骨細胞分化、融合或成熟相關(guān)基因包 括 Ctsk、c-fos、NFATclSDC-STAMP。8. 石墨烯量子點在制備用于抑制破骨細胞TRAP酶活性的藥物中的應(yīng)用。9. 石墨烯量子點在制備抑制破骨細胞前體細胞融合形成多核成熟破骨細胞中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了石墨烯量子點防治骨質(zhì)疏松的應(yīng)用，具體包括抑制破骨細胞前體細胞融合或分化成熟的應(yīng)用，抗成熟破骨細胞噬骨能力的應(yīng)用，抑制破骨細胞分化、融合或成熟相關(guān)基因表達中的應(yīng)用，抑制破骨細胞TRAP酶活性的應(yīng)用以及抑制破骨細胞前體細胞融合形成多核成熟破骨細胞的應(yīng)用。有效劑量內(nèi)石墨烯量子點濃度依賴性抑制RANKL誘導(dǎo)的BMMs細胞向破骨細胞的分化成熟、抑制RANKL誘導(dǎo)的BMMs細胞分化成熟的破骨細胞的噬骨能力、抑制破骨細胞的融合，另外，石墨烯量子點可以顯著降低破骨細胞分化特異基因的表達，因此石墨烯量子點最終能夠起到防治骨質(zhì)疏松的作用，進而可以應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的防治。
【IPC分類】A61P19/10, A61K33/44
【公開號】CN105726570
【申請?zhí)枴緾N201610118196
【發(fā)明人】羅陽, 竇策, 董世武, 許建中
【申請人】中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
【公開日】2016年7月6日
【申請日】2016年3月2日