石墨烯量子點防治骨質(zhì)疏松的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及骨質(zhì)疏松的防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及石墨烯量子點防治骨質(zhì)疏松的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，0P)是由全身骨量減少、骨密度降低為標(biāo)志的全身性、 進(jìn)行性骨病。在0P患者中，骨礦密度(BMD)降低，骨微結(jié)構(gòu)遭到破壞，蛋白量及種類均發(fā)生改 變，容易導(dǎo)致骨折。該癥在絕經(jīng)后婦女和75歲以上老年人中極為常見，是威脅老年人健康和 降低生活質(zhì)量的重要因素。
[0003] 破骨細(xì)胞(Osteoclast，0C)由造血干細(xì)胞系髓系單核細(xì)胞分化而來，是人體骨骼 系統(tǒng)中唯一具有吸收和重塑骨骼形態(tài)的生理性多核巨細(xì)胞。破骨細(xì)胞的活性和數(shù)量與人體 正常生理穩(wěn)態(tài)電解質(zhì)平衡中的鈣磷平衡以及諸多內(nèi)分泌疾病包括骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)。0P 患者中破骨細(xì)胞活性明顯提高，噬骨活動增加，破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞耦連作用下降，最終導(dǎo) 致骨吸收大于骨形成，骨生理穩(wěn)態(tài)遭到破壞，骨密度下降。
[0004] 石墨稀量子點（Graphene Quantumn Dots,GQDs)作為石墨稀家族的最新一員，除 了具有石墨烯的優(yōu)異性能，還因量子限制效應(yīng)和邊界效應(yīng)而展現(xiàn)出一系列新的特性，因此 吸引了化學(xué)、物理、材料和生物等各領(lǐng)域科學(xué)家的廣泛關(guān)注。在生物學(xué)領(lǐng)域，除其在生物傳 感和成像中的應(yīng)用，其良好的生物相容性和較低的毒性都為其進(jìn)一步的藥理學(xué)價值探索做 了鋪墊。目前已有報道石墨烯能夠促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)向成骨分化，然而，還未見 其對于破骨細(xì)胞作用以及對實驗動物整體骨量的影響的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種石墨烯量子點防治骨質(zhì)疏松的應(yīng)用，石墨 烯量子點通過對破骨細(xì)胞形成進(jìn)行抑制、同時抑制成熟破骨細(xì)胞的噬骨能力、抑制骨吸收、 促進(jìn)骨形成，最終起到防治骨質(zhì)疏松的作用。
[0006] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
[0007] 1、石墨烯量子點在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。
[0008] 優(yōu)選的，所述石墨稀量子點的使用量至少為lmg/kg體重。
[0009] 2、含石墨烯量子點的化合物在制備用于防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。
[0010] 3、石墨烯量子點在制備用于抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞融合或分化成熟的藥物中的 應(yīng)用。
[0011] 4、石墨烯量子點在制備用于抗成熟破骨細(xì)胞噬骨能力的藥物中的應(yīng)用。
[0012] 5、石墨烯量子點在制備用于抑制破骨細(xì)胞分化、融合或成熟相關(guān)基因表達(dá)的藥物 中的應(yīng)用。
[0013] 優(yōu)選的，所述破骨細(xì)胞分化、融合或成熟相關(guān)基因包括Ctsk、C-f〇S、NFATcl或DC-STAMP。
[0014] 6、石墨烯量子點在制備用于抑制破骨細(xì)胞TRAP酶活性的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 7、石墨烯量子點在制備抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞融合形成多核成熟破骨細(xì)胞中的 應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:在有效劑量內(nèi)，石墨烯量子點對小鼠原代骨髓 單核巨噬細(xì)胞(BMMs)無毒性作用;有效劑量內(nèi)濃度依賴性抑制RANKL誘導(dǎo)的BMMs向破骨細(xì) 胞的分化成熟;有效劑量內(nèi)濃度依賴性抑制RANKL誘導(dǎo)的BMMs分化成熟的破骨細(xì)胞的噬骨 能力;有效劑量內(nèi)濃度依賴性抑制破骨細(xì)胞的融合;石墨烯量子點可以顯著降低NFATcl、c-f 〇S、p38\MAPK及NFkB等破骨細(xì)胞分化特異基因的表達(dá)。
[0017] 由于BMMs細(xì)胞是研究破骨細(xì)胞分化、融合、成熟的常用細(xì)胞模型，鑒于石墨烯量子 點對RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成具有抑制作用，同時可以抑制成熟破骨細(xì)胞的噬骨能力，抑 制骨吸收，促進(jìn)骨形成，因此石墨烯量子點最終能夠起到防治骨質(zhì)疏松的作用，進(jìn)而可以應(yīng) 用于骨質(zhì)疏松的防治。
【附圖說明】
[0018] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0019] 圖1不同濃度石墨烯量子點對BMMs細(xì)胞增殖的影響，圖中A圖為作用時間24h結(jié)果， B圖為作用時間72h結(jié)果;橫坐標(biāo)為石墨烯量子點的上樣終濃度，縱坐標(biāo)為以各組的吸光度 0D值同空白對照組的0D值比較百分?jǐn)?shù)表述的細(xì)胞活力值。
[0020] 圖2石墨烯量子點濃度依賴性抑制破骨細(xì)胞生成的TRAP染色結(jié)果，圖中A圖為不同 濃度石墨烯量子點對RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成的TRAP染色顯微鏡圖；圖中B圖為不同濃度 石墨烯量子點作用下每孔破骨細(xì)胞數(shù)量及相對TRAP強度。
[0021 ]圖3不同濃度石墨烯量子點對破骨細(xì)胞形成以及多核破骨細(xì)胞形成的影響，圖中A 圖為不同濃度石墨烯量子點對RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成的FAK免疫熒光染色；圖中B圖為 破骨細(xì)胞數(shù)量及其細(xì)胞核數(shù)量的計數(shù)統(tǒng)計。
[0022]圖4石墨烯量子點抑制破骨細(xì)胞骨吸收能力結(jié)果，圖中A圖為不同濃度石墨烯量子 點對破骨細(xì)胞噬骨能力的影響甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果;圖中B圖為骨表面吸收分?jǐn)?shù)統(tǒng)計。
[0023] 圖5石墨烯量子點抑制破骨細(xì)胞分化特異性基因 c-fos、Ctsk、NFATcl、DC-STAifl^9 表達(dá)結(jié)果，A-D圖為不同濃度石墨烯量子點對RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的基因 NFATcl、c-fos、DC-STAMP及Ctsk表達(dá)水平的影響。
[0024]圖6平均骨密度檢測與骨代謝標(biāo)志物檢測結(jié)果，圖中A圖為microCT成像；圖中B圖 為骨參數(shù)分析結(jié)果。
【具體實施方式】
[0025]下面對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0026] BMMs為小鼠單核巨噬細(xì)胞，其在RANKL以及M-CSF的刺激誘導(dǎo)下可以向破骨細(xì)胞分 化，是研究破骨細(xì)胞分化、融合、成熟、噬骨等生物學(xué)行為的常用的細(xì)胞模型。同時破骨細(xì)胞 與成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等都有密切的關(guān)聯(lián)和耦合作用，是體內(nèi)骨穩(wěn)態(tài)及電解質(zhì)穩(wěn)態(tài) 的重要調(diào)控元素。骨質(zhì)疏松往往由過多的骨吸收導(dǎo)致，是破骨細(xì)胞過度活化的結(jié)果。因此， 本發(fā)明以BMMs作為細(xì)胞模型，研究石墨烯量子點對RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成的影響，進(jìn)而 探索石墨烯量子點在防治骨質(zhì)疏松方面的用途。
[0027] 1、高濃度石墨烯量子點抑制破骨細(xì)胞前體的增殖
[0028] 將BMMs細(xì)胞以1 X 103個/孔接種于96孔板，待細(xì)胞長滿后棄掉培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分 為:DMEM高糖培養(yǎng)液+10 %胎牛血清+1 %雙抗(青鏈霉素），以終濃度為0(空白對照組）、lyg/ mL、5yg/mL、1 Oyg/mL、50yg/mL、100yg/mL、150yg/mL、200yg/mL 將石墨稀量子點加入各個含 新鮮培養(yǎng)基的孔板中，同時以RANKL(終濃度50ng/mL)、M-CSF(終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)BMMS細(xì) 胞向破骨細(xì)胞分化，分別培養(yǎng)24h和72h，利用CCK-8法對細(xì)胞活性進(jìn)行檢測，觀察石墨烯量 子點對RNAKL誘導(dǎo)下BMMs細(xì)胞增殖作用的影響。
[0029] 結(jié)果如圖1所示，由圖可見，在24h組或是72h組中，低濃度的石墨烯量子點（小于 100yg/mL)對破骨細(xì)胞分化過程中的細(xì)胞增殖無明顯影響，高濃度的石墨烯量子點（大于 150yg/mL)對破骨細(xì)胞分化過程中的細(xì)胞增殖具有明顯的抑制效應(yīng)，*P<0.05，#P<0.01。
[0030] 2、石墨烯量子點濃度依賴性減少RANKL誘導(dǎo)的TRAP陽性細(xì)胞產(chǎn)生 [0031] 分組情況：
[0032] 組1:無 RANKL、M-CSF誘導(dǎo)，無石墨烯量子點陰性對照組；
[0033] 組2:RANKL(終濃度50ng/mL)+M-CSF(終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)，無石墨烯量子點陽性 對照組；
[0034] 組3:RANKL(終濃度50ng/mL)+M-CSF(終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)，終濃度lyg/mL石墨烯 量子點實驗組；
[0035] 組4:RANKL(終濃度50ng/mL)+M-CSF(終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)，終濃度5yg/mL石墨烯 量子點實驗組；
[0036] 組5:RANKL(終濃度50ng/mL)+M-CSF(終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)，終濃度10yg/mL石墨烯 量子點實驗組；
[0037] 組6: RANKL (終濃度50ng/mL) +M-CSF (終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)，終濃度50yg/mL石墨烯 量子點實驗組；
[0038] 組 7:RANKL(終濃度 50ng/mL)+M-CSF(終濃度 50ng/mL)誘導(dǎo)，終濃度 100yg/mL 石墨 稀量子點實驗組；
[0039] 組8: RANKL (終濃度 50ng/mL) +M-CSF (終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)，終濃度 150yg/mL 石墨 稀量子點實驗組；
[0040] 將BMMs細(xì)胞以1 X 103個/孔接種于96孔板，待細(xì)胞長滿后棄掉培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分 為:DMEM高糖培養(yǎng)液+10 %胎牛血清+1 %雙抗(青鏈霉素），以終濃度為0、lyg/mL、5yg/mL、10 yg/mL、50yg/mL、100yg/mL、150yg/mL將石墨稀量子點加入各個含新鮮培養(yǎng)基的孔板中，同 時以RANKL(終濃度50ng/mL)、M-CSF(終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)BMMS細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。誘導(dǎo) 培養(yǎng)72h后行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色:棄置培養(yǎng)基后用PBS清洗3次，一次3min，4% 多聚甲醛固定20min，PBS清洗3次，一次3min，抗酒石酸酸性磷酸酶染液染色(0. lmg/ml of naphthol AS-MX phosphate，0.3mg/ml of Fast Red Violet LB復(fù)染），避光染色lh，棄置 染液，PBS漂洗3次后每孔加入100yL PBS待觀察。光鏡下可見TRAP陽性細(xì)胞被染成紫紅色 (圖2中姻）。
[0041 ]根據(jù)細(xì)胞核數(shù)量統(tǒng)計TRAP陽性細(xì)胞個數(shù)，分別統(tǒng)計破骨細(xì)胞數(shù)量(TRAP陽性，核大 于3)，TRAP相對強度。結(jié)果提示破骨細(xì)胞總細(xì)胞數(shù)量在毒性濃度范圍內(nèi)隨著石墨烯量子點 用量的增加而降低（圖2中B圖），同時，TRAP相對強度隨著石墨烯量子點的用量增加而降低 (圖2中C圖），證明石墨烯量子點具有濃度依賴性抑制破骨細(xì)胞的生成。當(dāng)石墨烯量子點終 濃度為臨界毒性濃度50yg/mL時，抑制效果最明顯(#P<0.01)。
[0042] 3、石墨烯量子點濃度依賴性減少RANKL誘導(dǎo)的多核成熟破骨細(xì)胞形成 [0043] 分組情況：
[0044] 組1 :RANKL(終濃度50ng/mL)+M-CSF(終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)，無石墨烯量子點對照 組；
[0045] 組2:RANKL(終濃度50ng/mL)+M-CSF(終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)，終濃度5yg/mL石墨烯 量子點實驗組；
[0046] 組3:RANKL(終濃度50ng/mL)+M-CSF(終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)，終濃度10yg/mL石墨烯 量子點實驗組；
[0047] 組4: RANKL (終濃度 50ng/mL) +M-CSF (終濃度50ng/mL)誘導(dǎo)，終濃度 100yg/mL 石墨 稀量子點實驗組。
[0048] 將BMMs細(xì)胞以1 X 103個/孔接種于96孔板，待細(xì)胞長滿后棄掉培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分 為:DMEM高糖培養(yǎng)液+10 %胎牛血清+1 %雙抗(青鏈霉素），以終濃度為0、5yg/mL、1 Oyg/mL、 100yg/mL將石墨烯量子點加入各個含新鮮培養(yǎng)