刻度線，分裝到試劑瓶后在12rC下高壓滅菌30min，冷卻后放4°C冰箱保 存。
[0054] 酵母浸膏一蛋白腺一葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基:葡萄糖lOg，蛋白腺lOg，酵母膏5g，瓊脂 粉lOg，加水溶解在SOOmL錐形瓶中，充分?jǐn)埌杈鶆蚝?2rC滅菌30min，冷卻后4°C冰箱保存 備用。
[0化日]RPMI 1640液體培養(yǎng)液:取RPMI 1640(含心谷氨酷胺，不含碳酸氨鋼)粉末2. OSg， 加入10%葡萄糖溶液40ml(含糖終濃度2% )及MOPS粉6.906g，加蒸饋水至約為200血，混合 均勻后在22 °C用Imo 1 /L的化0田容液調(diào)抑約為7.0 ± 0.1，臨用前用0.22皿混合纖維膜過(guò)濾滅 困。
[0化6] 1.2儀器 AB204-N電子天平 梅特勒-巧利（上海）公司
[0化7] SVE-4A1超肆工作會(huì) 新加坡啟CQ公司 INCUCELL 55恒溫培養(yǎng)箱 德國(guó)MMM公司 VENTICELL 55干熱滅菌箱德國(guó)MMM公司 HS-9041高溫高壓采菌器 韓國(guó)HAHSHIN公司 不誘輛過(guò)濾器(2000ml) 江蘇天和儀器廠 96化璋養(yǎng)扳 秦圍COSTA反么哥
[0化引 可調(diào)式移液器 Thermo Electron ( h海)公司 SC-329常溫冰箱 中國(guó)海爾公司 -2(TC低溫冰柜 中國(guó)海爾公司 G-560E滿旋混合器 美國(guó)Si公司 M地iscan.MKJ酶疏後 美國(guó)前卻敞)虹hsys'tems.公司.
[0化9] 1.3實(shí)驗(yàn)菌株
[0060]質(zhì)控菌株：白色念珠菌ATCC10231，山東大學(xué)藥理教研室惠贈(zèng)；
[0061 ]實(shí)驗(yàn)菌株:千佛山醫(yī)院臨床分離的白色念珠菌；
[0062] 菌株鑒定:實(shí)驗(yàn)用菌株在科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基35°C下培養(yǎng)48小時(shí)，菌落呈綠 色或翠綠色的所有菌株再經(jīng)山東省疾病預(yù)防控制中屯、微生物研究室W標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)方法 鑒定為白色念珠菌。
[0063] 菌液制備:-20°C下保存的白色念珠菌室溫下解凍，接種到TTC-沙保羅瓊脂培養(yǎng)基 上，35°C培養(yǎng)2地，取發(fā)育良好的單一菌落再次接種，35°C培養(yǎng)24h，W保證菌株處于生長(zhǎng)期。 選取若干單個(gè)較大菌落，PBS配制成菌懸液，經(jīng)滿旋器振蕩均勻后W中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)管比 濁，調(diào)整樣品管與標(biāo)準(zhǔn)管濁度一致，此時(shí)白色念珠菌的菌濃度約為IX IO6CFlVmL,系列稀釋 即得到工作菌液，并W活菌計(jì)數(shù)進(jìn)行濃度驗(yàn)證。
[0064] 2.內(nèi)容與方法
[0065] 2.1鹽酸氨漠索與氣康挫聯(lián)合抗耐藥白色念珠菌作用測(cè)定
[0066] 根據(jù)化SI M27-A3方案的棋盤法，WRPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋藥液使其成為4倍 工作濃度，篩選ABH與化C聯(lián)合應(yīng)用的濃度范圍，即ABH終濃度為256~化g/mL，F(xiàn)LC的終濃度 為64~0.12扣g/mL。按濃度從低到高的順序分別吸取化C藥液50化，分別加入96孔平板的第 2~11列，按濃度從低到高的順序吸取ABH藥液50化，分別加入各96孔平板的第G~A行，除第 12列外各孔再分別加100化菌液，其余不足20化L的孔用RPMI-1640培養(yǎng)液補(bǔ)足。其中化為生 長(zhǎng)對(duì)照，只含菌液不含藥物，第12列為空白對(duì)照，只含RPMI-1640液體培養(yǎng)基。根據(jù)化SI M27-A3方案的要求，將加藥的96孔平板置35 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2地后，分別用XTT負(fù)載化 后W酶標(biāo)儀測(cè)定OD并記錄結(jié)果。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)S次。
[0067] 2.2評(píng)價(jià)方法與結(jié)果判定
[0068] 2.2. ILoewe additivity理論
[0069] Loewe additivity (LA)理論的基本思想認(rèn)為藥物不可能和它本身發(fā)生相互作用， 因此將藥物單用或聯(lián)用產(chǎn)生相同藥效的濃度(等效位點(diǎn))進(jìn)行比較。其分析方法分?jǐn)?shù)抑菌濃 度指數(shù)法(fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)，表述女曰下：
[0070] X FIC=FI Ca+F I Cb = Ca/M I Ca+Cb/MI Cb
[0071] MICa和MICb分別是藥物A和B單用時(shí)的最小抑菌濃度，Ca與Cb為兩藥聯(lián)用時(shí)達(dá)到相 同藥效時(shí)各自的濃度。FICIM為括抗作用，F(xiàn)ICI在0.5與4之間為相加或無(wú)關(guān)作用，F(xiàn)ICI < 0.5定義為協(xié)同作用。
[0072] 2.2.2Bliss independence理論
[0073] Blissindependence(BI)理論是WAE(藥物各濃度下真菌生長(zhǎng)百分率的理論值 與實(shí)驗(yàn)值之差)為數(shù)據(jù)分析模型。AE模型表述如下：
[0074] AE = EAXEB-Ecomb
[0075] 其中，Ea為A藥單用時(shí)真菌的生長(zhǎng)率，扣為8藥單用時(shí)真菌的生長(zhǎng)率，Ewmb為A藥和B 藥聯(lián)用時(shí)真菌的生長(zhǎng)率。結(jié)果分析時(shí)，通過(guò)S SYN與XANT，即96孔板中所有正值A(chǔ) E和負(fù)值 A E的加和為指標(biāo)來(lái)判斷兩種藥物的相互作用。當(dāng)AE的絕對(duì)值<100%時(shí)，表示為弱協(xié)同或 弱括抗作用；當(dāng)A E的絕對(duì)值介于100%與200%之間時(shí)，表示為中等協(xié)同或括抗作用，當(dāng)A E 的絕對(duì)值大于200%時(shí)，表示為為強(qiáng)協(xié)同或括抗作用。
[0076] 3.結(jié)果
[0077] 3.1鹽酸氨漠索與氣康挫聯(lián)合抗耐藥白色念珠菌作用結(jié)果
[0078] 3.1.1鹽酸氨漠索與氣康挫聯(lián)合的最低有效抑菌濃度
[0079] 各孔中真菌生長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)的計(jì)算方法為：
[0080] 真菌生長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)=(各孔OD值-空白對(duì)照孔OD值)/生長(zhǎng)對(duì)照孔OD值
[0081] 按上述公式計(jì)算平板中各孔真菌生長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)，取能夠抑制真菌生長(zhǎng)80%的最低聯(lián) 用藥物濃度為判讀終點(diǎn)。
[0082] ABH與化C聯(lián)合抗真菌作用時(shí)，對(duì)耐藥白色念珠菌呈現(xiàn)強(qiáng)協(xié)同作用，但對(duì)白色念珠 菌的敏感株和非白色念珠菌來(lái)說(shuō)無(wú)協(xié)同作用?，F(xiàn)把耐藥株CAlO和CA16在加藥96孔板中的生 長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果列表如下(表1-3)所示。
[0083] 表.1.用棋盤表示Affl與化C的聯(lián)合用藥抗耐藥白色念珠菌CAlO生長(zhǎng)百分率（W FICI法換算的藥物最佳作用組合用灰色標(biāo)出）。
[0085] 表.2.用棋盤表示Affl與化C的聯(lián)合用藥抗耐藥白色念珠菌CA16生長(zhǎng)百分率（W FICI法換算的藥物最佳作用組合用灰色標(biāo)出）。
[0087] 3.1.2FICI模型和A E模型評(píng)價(jià)ABH與FLC聯(lián)用的協(xié)同作用
[008引FICI模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)為FICI值，F(xiàn)ICI <0.5則定義為協(xié)同作用。由表3可W看出，各 組合的FICI值均小于0.5,表現(xiàn)為較強(qiáng)的協(xié)同作用。
[0089] A E模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)為X SYN與XANT，由表3可W看出，各組I： SYN和SANT的總和 均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于200%，表現(xiàn)為強(qiáng)烈的協(xié)同作用，ABH與化C聯(lián)用對(duì)抗CAlO和CA16的S維圖如圖1 和圖2。從圖中可W直觀的看出不同藥物組合均具有強(qiáng)烈的協(xié)同作用。圖片與上述數(shù)值分析 具有一致性。
[0090] 表.3. WFICI模型和A E模型評(píng)價(jià)鹽酸氨漠素和氣康挫聯(lián)合用藥抗真菌作用
[0092] 注解:FLC:氣康挫;ABH:鹽酸氨漠索;MIC:最低抑菌濃度;MICa:藥物單用時(shí)氣康挫 的最低抑菌濃度;Ca:藥物聯(lián)用時(shí)氣康挫的最低抑菌濃度;MICb:藥物單用時(shí)鹽酸氨漠索的最 低抑菌濃度;Cb :藥物聯(lián)用時(shí)鹽酸氨漠索的最低抑菌濃度;FICI:分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)；X SYN: 96孔板中所有正值A(chǔ) E之和；X ANT: 96孔板中所有負(fù)值A(chǔ) E之和。
[0093] 上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范 圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不 需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍W內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鹽酸氨溴索聯(lián)合氟康唑在制備抗真菌產(chǎn)品中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是:所述產(chǎn)品為藥物。3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是:所述真菌為白色念珠菌。4. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是:所述鹽酸氨溴索與氟康唑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的有效濃 度配比：氟康唑:鹽酸氨溴索=1:64。5. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是:所述應(yīng)用時(shí)鹽酸氨溴索的最低抑菌濃度為：128 yg/mL〇6. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是:所述應(yīng)用時(shí)氟康唑的最低抑菌濃度為:2yg/mL。7. -種抗真菌產(chǎn)品，其特征是：以鹽酸氨溴索和氟康唑?yàn)橹饕钚猿煞帧?. 如權(quán)利要求7所述的抗真菌產(chǎn)品，其特征是，所述鹽酸氨溴索與氟康唑的有效濃度配 比為氟康唑:鹽酸氨溴索= 1:64。9. 如權(quán)利要求7所述的抗真菌產(chǎn)品，其特征是，所述鹽酸氨溴索的最低濃度為：128yg/ mL〇10. 如權(quán)利要求7所述的抗真菌產(chǎn)品，其特征是，所述氟康挫的最低濃度為:2yg/mL。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了鹽酸氨溴索聯(lián)合氟康唑的抗真菌產(chǎn)品及其應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明以多種方法研究氟康唑和鹽酸氨溴索聯(lián)用對(duì)耐藥白色念珠菌的靜態(tài)與動(dòng)態(tài)聯(lián)合抗真菌作用。鹽酸氨溴索與氟康唑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的有效濃度配比：氟康唑：鹽酸氨溴索＝1:64(μg/mL)，最低抑菌濃度分別為：128μg/mL與2μg/mL。鹽酸氨溴索聯(lián)合氟康唑時(shí)，可以增強(qiáng)氟康唑?qū)δ退幇咨钪榫目咕钚裕梢援a(chǎn)生協(xié)同抗真菌作用，并能夠逆轉(zhuǎn)耐藥白色念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥性，為新藥的開(kāi)發(fā)及老藥新用提供了研究方向。
【IPC分類】A61K31/137, A61P31/10, A61K31/4196
【公開(kāi)號(hào)】CN105663126
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610186067
【發(fā)明人】孫淑娟, 李秀云, 張才擎, 韓毅, 崔學(xué)艷
【申請(qǐng)人】山東省千佛山醫(yī)院
【公開(kāi)日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2016年3月29日