一種淋巴靶向的類普魯士藍(lán)納米顆粒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種淋巴靶向的類普魯士藍(lán)納米顆粒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，癌癥的發(fā)病率呈明顯的上升趨勢，納米材料由于其特殊性質(zhì)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尤其是癌癥診斷和治療中的應(yīng)用越來越備受關(guān)注，納米材料有望解決傳統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)方法的局限性。然而，當(dāng)前納米材料的研究僅限于體外試驗(yàn)，其在人體內(nèi)的生物安全性得不到保障，嚴(yán)重限制了其進(jìn)一步發(fā)展。解決納米材料的生物安全性成為納米材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的關(guān)鍵問題。癌癥的主要生物學(xué)特征是侵襲和轉(zhuǎn)移，腫瘤轉(zhuǎn)移主要通過血管和淋巴管途徑實(shí)現(xiàn)，其中，淋巴管是其轉(zhuǎn)移的主要通道。腫瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移將會給治療帶來很大的困難，因此對淋巴管疾病和腫瘤的診斷具有重要意義。
[0003]透明質(zhì)酸是由兩個雙糖單位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的高分子聚合物，存在于動物體大部分的軟結(jié)締組織中，其主要功能是潤滑和保護(hù)細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞在粘彈性基質(zhì)上移動，穩(wěn)定膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并使其免受機(jī)械性破壞。人體內(nèi)的透明質(zhì)酸受體包括毛細(xì)淋巴管內(nèi)的淋巴內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體LYVE-1 ( Lymphat i c vascular endothelialhyaluronan receptor-1)和腫瘤細(xì)胞表面透明質(zhì)酸受體⑶44。因此，透明質(zhì)酸受體可被視為腫瘤特異性靶點(diǎn)，不僅可以作為癌癥治療的靶點(diǎn)，還可以作為淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤影像學(xué)診斷的新靶點(diǎn)。
[0004]普魯士藍(lán)是一種臨床用藥，是醫(yī)院的常規(guī)儲備藥物。普魯士藍(lán)長期的臨床用藥驗(yàn)證了其在人體內(nèi)可靠的生物安全性和代謝途徑。從結(jié)構(gòu)上說，普魯士藍(lán)是一種二價鐵和三價鐵混合價態(tài)的六氰絡(luò)鐵酸鹽，在普魯士藍(lán)納米粒子結(jié)構(gòu)中，二價鐵與碳原子相連，是低自旋的，三價鐵和氮原子相連，是高自旋的，在每個二價鐵-碳-氮-三價鐵的結(jié)構(gòu)單元中，共有5個未配對的電子，由于普魯士藍(lán)的這種特殊結(jié)構(gòu)，它可以縮短水質(zhì)子的橫向或縱向弛豫時間，從而用于磁共振成像。同時普魯士藍(lán)納米粒子內(nèi)的金屬離子與氰基由于通過配位鍵連接，因此非常牢固，不易產(chǎn)生毒性的游離金屬離子和氫氰酸，也不易產(chǎn)生氧自由基等有害物質(zhì)，因此安全性很高。此外，與傳統(tǒng)納米材料相比，如金納米棒，碳納米管等，普魯士藍(lán)納米粒子的光熱轉(zhuǎn)換效率較高，且光熱穩(wěn)定性強(qiáng)，在光聲成像應(yīng)用中具有很明顯的優(yōu)勢。已有研究證實(shí)了普魯士藍(lán)作為MRI造影劑的成像應(yīng)用(J.Mater.Chem.，2010，20，5251-5259 ;Inorganic Chemistry Communicat1ns , 2010 ,13 , 58-61 ；)和光聲造影劑的成像應(yīng)用(Chem.Commun.,2013,49,11029-11031;B1materials,2014,35,9844-9852.)。
[0005]由于在普魯士藍(lán)晶胞中，過渡金屬離子占據(jù)兩個不同的位置，而這兩個位置上都可以用不同的其它過渡金屬來替代，導(dǎo)致類普魯士藍(lán)粒子極大的品種多樣性。因此類普魯士藍(lán)納米顆粒將有潛力解決其它多數(shù)納米材料生物安全性得不到保障且價格昂貴的醫(yī)學(xué)難題，其研究和應(yīng)用價值巨大。
[0006]然而，目前的普魯士藍(lán)納米顆粒的磁共振成像信號不足，對于普魯士藍(lán)納米的顆粒的保護(hù)修飾研究目前大部分利用非水溶性的有機(jī)物，而水溶性的有機(jī)物包裹的普魯士藍(lán)納米顆粒采用的是靜電吸附的方法，得到的產(chǎn)物在體內(nèi)生理?xiàng)l件下，有機(jī)層容易被破壞，形成裸露的普魯士藍(lán)納米顆粒，裸露的普魯士藍(lán)納米顆粒不溶于水環(huán)境，易被機(jī)體清除，同時生理鹽中的金屬離子與裸露的普魯士藍(lán)容易發(fā)生置換反應(yīng)，對生物體有潛在的毒性作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種淋巴靶向的類普魯士藍(lán)納米顆粒及其制備方法，通過在二乙三胺五乙酸上交聯(lián)上透明質(zhì)酸并螯合在釓離子上，形成穩(wěn)定的表面帶有透明質(zhì)酸的具有淋巴靶向的類普魯士藍(lán)納米顆粒。
[0008]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn):
[0009]一種淋巴靶向的類普魯士藍(lán)納米顆粒的制備方法，包括以下步驟:
[0010](1)將透明質(zhì)酸(HA)溶于緩沖溶液中，混合攪拌均勻后，配制成A溶液，其中，每毫升A溶液中含有l(wèi)_20mg的透明質(zhì)酸，再在攪拌條件下緩慢加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，反應(yīng)5-30min，用roS緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值到7，然后再加入二胺類連接劑，反應(yīng)6-48h后用去離子水透析處理，得到產(chǎn)物E;其中，透明質(zhì)酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和二胺類連接劑的質(zhì)量比為 1:(1-10): (2-20): (10-100)；
[0011](2)將二乙三胺五乙酸溶于緩沖溶液中，混合攪拌均勻后，配制成B溶液，其中，每毫升B溶液中含有l(wèi)_20mg的二乙三胺五乙酸，再在攪拌的條件下緩慢加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，反應(yīng)5-30min，用PBS緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值到7，然后再加入產(chǎn)物E，反應(yīng)6-48h后用去離子水透析處理，得到產(chǎn)物F;其中，二乙三胺五乙酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和產(chǎn)物E的質(zhì)量比為1:(1-10):(2-20): (0.2-1);
[0012](3)將六氰絡(luò)鐵酸鹽溶于溶劑中，混合攪拌均勻后，配制成C溶液，其中，每毫升C溶液中含有l(wèi)_20mg的六氰絡(luò)鐵酸鹽；
[0013](4)將釓鹽溶于溶劑中，混合攪拌均勻后，配制成D溶液，其中，每毫升D溶液中含有l(wèi)-20mg的釓鹽;
[0014](5)將C溶液磁力攪拌均勻，然后再逐滴加入D溶液，磁力攪拌反應(yīng)20-120min，離心分離得到產(chǎn)物G，將產(chǎn)物G溶于水中，形成產(chǎn)物G的溶液;其中，釓鹽與六氰絡(luò)鐵酸鹽的質(zhì)量比1:0.2-1；
[0015](6)將產(chǎn)物F加入到產(chǎn)物G的溶液中，混合攪拌均勻，反應(yīng)4_24h后用去離子水透析處理，得到表面帶有透明質(zhì)酸的淋巴靶向的類普魯士藍(lán)納米顆粒;其中，產(chǎn)物G與產(chǎn)物F的質(zhì)量比為1:0.2-2。
[0016]上述制備方法中，主要采用的是四步法合成具有淋巴靶向的類普魯士藍(lán)納米顆粒。其中，第一步是通過二胺類連接改變透明質(zhì)酸反應(yīng)官能團(tuán)羧基，使之變?yōu)榘被?第二步是使帶有氨基官能團(tuán)的透明質(zhì)酸通過EDC、NHS反應(yīng)交聯(lián)上二乙三胺五乙酸，得到連接有透明質(zhì)酸的二乙三胺五乙酸產(chǎn)物;第三步是使釓鹽與六氰絡(luò)鐵酸鹽反應(yīng)，形成類普魯士藍(lán)納米顆粒;第四步是使帶有透明質(zhì)酸的二乙三胺五乙酸螯合在釓離子上，形成穩(wěn)定的表面帶有透明質(zhì)酸的淋巴靶向的類普魯士藍(lán)納米顆粒產(chǎn)物。
[0017]上述制備方法中，二乙三胺五乙酸是一種具有二乙烯三胺骨架的多元羧酸，對金屬離子具有很強(qiáng)的螯合作用，其螯合能力比EDTA強(qiáng)100倍左右。由于二乙三胺五乙酸能形成八個配位鍵，而過渡金屬的配位鍵一般少于八個，因此，二乙三胺五乙酸可以交聯(lián)上其它的分子，形成衍生物后再與金屬螯合，其穩(wěn)定性和生物相容性較好。
[0018]上述制備方法中，優(yōu)選地，所述透明質(zhì)酸的分子量為6千-7萬。透明質(zhì)酸是由兩個雙糖單位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的高分子聚合物，存在于動物體大部分的軟結(jié)締組織中，其主要功能是潤滑和保護(hù)細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞在粘彈性基質(zhì)上移動，穩(wěn)定膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并使其免受機(jī)械性破壞。透明質(zhì)酸受體可被視為腫瘤特異性靶點(diǎn)，不僅可以作為癌癥治療的靶點(diǎn)，還可以作為淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤影像學(xué)診斷的新靶點(diǎn)。
[0019]上述制備方法中，優(yōu)選地，所述緩沖溶液可以為MES緩沖溶液、PBS緩沖溶液、Tris緩沖溶液、HEPES緩沖溶液、TES緩沖溶液、MOPS緩沖溶液和PIPES緩沖溶液等中的一種。
[0020]上述制備方法中，優(yōu)選地，所述二胺類連接劑可以為脂肪族二胺或飽和環(huán)二胺;優(yōu)選地，所述脂肪族二胺可以為乙二胺、1，3_丙二胺和2，2_ 二甲基-1，3-丙二胺等中的一種；更加優(yōu)選地，所述飽和環(huán)二胺可以為環(huán)己二胺。
[0021 ] 上述制備方法種，優(yōu)選地，所述六氰絡(luò)鐵酸鹽可以為亞鐵氰化鉀、亞鐵氰化鈉和亞鐵氰化銨等中的一種。
[0022]上述制備方法中，優(yōu)選地，所述溶劑可以為水、乙醇和乙二醇等中的一種。
[0023]上述制備方法中，優(yōu)選地，所述釓鹽可以為氯化釓、硝酸釓和硫酸釓等中的一種。由于在普魯士藍(lán)晶胞中，過渡金屬離子占據(jù)兩個不同的位置，而這兩個位置上都可以用不同的其它過渡金屬來替代，當(dāng)用釓離子取代三價鐵的位置時，能夠增加結(jié)構(gòu)單元中未配對的電子數(shù)，從而有效的增強(qiáng)磁共振成像效果。
[0024]本發(fā)明還提供了一種利用上述制備方法制備得到的表面帶有透明質(zhì)酸的淋巴靶向的類普魯士藍(lán)納米顆粒。該納米顆粒內(nèi)核層為類普魯士藍(lán)納米顆?？僧a(chǎn)生磁共振信號和光聲信號，外層為透明質(zhì)酸，外層與內(nèi)核層通過二乙三胺五乙酸與釓強(qiáng)配位交聯(lián)，有效的保護(hù)類普魯士藍(lán)