用于減緩細胞衰老的包含rho激酶抑制劑的組合物及其用圖
【專利說明】用于減緩細胞衰老的包含RHO激酶抑制劑的組合物及其用 途
[oow] 相關申請 W02] 本申請要求2014年10月6日在韓國知識產權局提交的韓國專利申請 No. 10-2014-0134481的權益,其完整公開內容通過提述并入本文。 發(fā)明領域
[0003] 本公開設及用于減緩細胞衰老的組合物、減少哺乳動物中細胞衰老的方法、和治 療哺乳動物中細胞衰老相關癥狀的方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 衰老可定義為細胞分裂的永久停止。已在細胞水平觀察到復制性衰老或細胞衰老 作為老化模型。當持續(xù)培養(yǎng)細胞時,細胞分裂多次,但老化的細胞不再能分裂。衰老細胞對 程序性細胞死亡有抗性,且一些衰老細胞保持不分裂狀態(tài)達幾年。
[0006] 化O激酶是屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶的AGC (PKA/PKG/PKC)家族的激酶。包括 ROCKl和R0CK2在內的化〇有關的蛋白激酶(即ROCK)在哺乳動物、斑馬魚、爪贍狂enopus) 等中發(fā)現(xiàn)。人ROCKl具有ISOkDa的分子量,而且是小GT化Se化oA的主要下游效應物。 哺乳動物ROCK包括激酶域、卷曲螺旋區(qū)、和血小板-白細胞激酶C底物同源(Pleckstrin homology, PH)結構域,當化oA-GTP不存在時血小板-白細胞激酶C底物同源結構域通過自 身抑制性分子內折疊降低ROCK的激酶活性。 陽007] 由于ROCK在與細胞衰老有關的細胞過程中所起的作用,仍然需要開發(fā)用化O激酶 抑制劑減緩Cre化cing)細胞衰老的組合物和方法。 陽00引 發(fā)明概述
[0009] 提供一種用于在哺乳動物中治療與細胞中的脂褐素積累有關的癥狀的組合物,所 述組合物包含化O激酶抑制劑作為活性成分。所述細胞可W是具有脂褐素積累的皮膚組織 細胞、肌肉組織細胞或神經組織細胞。優(yōu)選地,所述哺乳動物是人。
[0010] 在一個方面,所述與脂褐素積累有關的癥狀是神經元蠟樣脂褐質沉積癥(NCL)、年 齡相關的黃斑變性、屯、臟的褐色萎縮、肢端肥大癥、去神經萎縮、脂質肌病、慢性阻塞性肺病 (COPD)、或其組合。
[0011] 提供一種用于在體外或在哺乳動物中減少細胞中脂褐素積累的組合物,所述組合 物包含化O激酶抑制劑作為活性成分。
[0012] 提供一種用于刺激人細胞的增殖的組合物,所述組合物包含化O激酶抑制劑作為 活性成分。在一個實施方案中,所述人細胞是成纖維細胞、肌細胞或神經細胞。在一個方面, 所述組合物用于治療皮膚皺紋、降低的修復傷口的能力、肌肉衰減癥(sarcopenia)、哈-格 二氏早老性綜合征化Utchinson-Gil化rd progeria syn化ome)、或其組合。提供一種減少 哺乳動物中細胞衰老的方法,包括通過對所述哺乳動物施用有效量的化〇激酶抑制劑來減 緩細胞衰老。
[0013] 提供一種治療哺乳動物中的與細胞衰老有關的癥狀的方法,其中所述方法包括通 過對所述哺乳動物施用有效量的化O激酶抑制劑來治療與細胞衰老有關的癥狀。
[0014] 提供一種治療哺乳動物中的胞內脂褐素積累相關癥狀的方法,其中所述方法包括 通過對所述哺乳動物施用有效量的化O激酶抑制劑來治療脂褐素積累相關病癥。
[0015] 提供一種刺激人細胞增殖的方法,包括:將所述人細胞暴露于有效量的化O激酶 抑制劑W刺激所述人細胞,其中所述人細胞是成纖維細胞、肌細胞或神經細胞。特別地,所 述暴露包括將有效量的化O激酶抑制劑施用給人體部位,其中所述部位是皮膚組織、肌肉 組織或神經組織。
[0016] 所述化O激酶抑制劑可W局部施用至包含具有脂褐素積累的細胞的皮膚組織、肌 肉組織或神經組織。在一個實施方案中,所述化O激酶抑制劑的施用通過將化O激酶抑制 劑局部施用至包含具有脂褐素積累的細胞的組織來進行。
[0017] 本申請的方法可用于治療皮膚皺紋、降低的修復傷口的能力、肌肉衰減癥、哈-格 二氏早老性綜合征、或其組合。
[0018] 附圖簡述
[0019] 運些和/或其他方面從對例示性實施方案連同所附附圖的下列描述來看將變得 明顯且更容易領會的。
[0020] 圖1,該示例圖顯示了暴露于多種濃度的化O激酶抑制劑Y-27632、Fasudil和 SR3677的細胞的細胞集落形成; 陽02U 圖2,該系列圖繪出了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. 5 iiM)情況下培養(yǎng)的衰老成纖維細胞(37次細胞傳代后)的相對細胞數(shù)對時間;
[0022] 圖3是顯微鏡圖像,其例示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧y M)情況下培養(yǎng) 的衰老成纖維細胞(37次細胞傳代后)的細胞形狀;
[0023] 圖4是細胞在各種細胞生長階段的百分比的圖,其例示了化O激酶抑制劑Y-27632 和化SUdil對衰老成纖維細胞(37次細胞傳代后)的細胞周期的影響; W24] 圖5是顯微鏡圖像的圖,其例示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧y M)、 FasudiUS y M)和SR3677 (0. 5 y M)的情況下在含瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)衰老成纖維細胞(37次 細胞傳代后)的結果; 陽0巧]圖6至8是例示了在存在化〇激酶抑制劑Y-27632 (5 y M)、Fasudi 1巧y M)和 SR3677(0. SiiM)的情況下培養(yǎng)的衰老成纖維細胞(37次細胞傳代后)的衰老有關的 (SA) - 0 -半乳糖巧酶活性(圖6A、7A和8A的a和b)的顯微鏡圖像的圖,和例示具有衰老 有關的(SA)-P-半乳糖巧酶活性的細胞的百分比的圖(圖6B、7B和8B);
[0026] 圖9,該組圖顯示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. 5 iiM)的情況下培養(yǎng)的成纖維細胞(37次細胞傳代后)中脂褐素的量;
[0027] 圖10,該組圖顯示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. 5 iiM)的情況下培養(yǎng)的成纖維細胞(37次細胞傳代后)中的反應性氧種類; 陽02引 圖11,該組圖顯示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. 5 iiM)的情況下培養(yǎng)的成纖維細胞(37次細胞傳代后)的線粒體膜電位;
[0029] 圖12,該圖顯示了在存在化〇激酶抑制劑Y-27632(5 yM)、FasudiUSyM)和 SR3677 (0. 5 y M)的情況下培養(yǎng)的成纖維細胞(38次細胞傳代后)中的DNA損傷程度,通過 指示DNA損傷程度的DNA曽星測定法值NA comet assay)測量; W30] 圖13是顯微鏡圖像的圖,其例示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧y M)、 FasudiUSiiM)和SR3677 (0.5 iiM)的情況下培養(yǎng)的成肌細胞(11次細胞傳代后)中的細胞 形狀變化; 陽03U 圖14,該組圖顯示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. SiiM)的情況下培養(yǎng)的成肌細胞(11次細胞傳代后)中的脂褐素量; 陽03引 圖15,該組圖顯示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. SiiM)的情況下培養(yǎng)的成肌細胞(11次細胞傳代后)中的反應性氧種類; 陽03引 圖16,該組圖顯示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. SiiM)的情況下培養(yǎng)的成肌細胞(11次細胞傳代后)中的線粒體膜電位; W34] 圖17是顯微鏡圖像的圖,其例示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧y M)、 FasudiUS y M)和SR3677 (0. 5 y M)的情況下培養(yǎng)的早老性成纖維細胞(progeric fibroblasts) (17次傳代后)中的細胞形狀變化;
[0035] 圖18,該組圖顯示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. 5 iiM)的情況下培養(yǎng)的早老性成纖維細胞(17次傳代后)中的脂褐素量;
[0036] 圖19,該組圖顯示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. SiiM)的情況下培養(yǎng)的早老性成纖維細胞(17次傳代后)中的反應性氧種類;
[0037] 圖20,該組圖顯示了在存在化O激酶抑制劑Y-27632巧yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. SiiM)的情況下培養(yǎng)的早老性成纖維細胞(17次傳代后)的線粒體膜電位;
[0038] 圖21,該圖顯示了在存在化〇激酶抑制劑Y-27632(5 yM)、FasudiUSyM)和 SR3677(0. SiiM)的情況下培養(yǎng)的早老性成纖維細胞(17次傳代后)中的DNA損傷程度,通 過指示DNA損傷程度的DNA曽星測定法測量;和
[0039] 圖22是例示了在存在化〇激酶抑制劑Y-27632 (5 y M)、FasudiUS y M)和 SR3677(0. SiiM)的情況下培養(yǎng)的早老性成纖維細胞(17次傳代后)的SA-P-半乳糖巧酶 活性的顯微鏡圖像的圖(圖22A的a-e),和例示具有SA- 0 -半乳糖巧酶活性的細胞的百分 比的圖(圖22B)。 W40] 圖23顯示了在應用Y-27632或作為對照的DMSO后年老小鼠的時間匹配的傷口大 小和傷口外觀。
[0041] 圖24代表免疫組織化學實驗結果,其顯示Y-27632處理在年老小鼠(19個月齡) 的傷口愈合中起著重要作用。
[0042] 圖25代表W下實驗結果,其顯示傷口重塑組織的橫截面面積中膠原沉積的厚度 掲示了在老年小鼠中用Y-27632處理的傷口相比于用DMSO處理的傷口中更密集和更厚的 膠原。 陽0創(chuàng)圖26代表了顯示年老小鼠中用Y-27632處理的傷口相比于用DMSO處理的傷口中 表皮中的PCNA+細胞的實驗結果。 W44] 發(fā)明詳述
[0045] 現(xiàn)將對例示性的實施方案進行詳細提述,其例子例示在附圖中,其中相似的參照 編號從頭到尾指相似的要素。在此方面,目前的例示性實施方案可能具有不同形式且不應 理解為受限于本文中陳述的說明。因此,下文僅通過參照附圖描述了例示性實施方案W解 釋各方面。如本文中使用的,術語"和/或"包括一個/種或多個/種所列關聯(lián)項的任意和 所有組合。表述如"至少一個/種"在置于一組要素之前修飾整組要素而不修飾該組的單 個要素。另外的方面部分將在下面的說明書中陳述,而部分從說明書將是明顯的,或者可通 過實踐呈現(xiàn)的例示性實施方案得知。
[0046] 提供可用于減緩細胞衰老的組合物,其中所述組合物包含化O激酶抑制劑作為活 性成分。
[0047] 化O激酶,也稱為"化O-有關的蛋白質激酶(ROCK)",是屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶 的AGC(PKA/PKG/PKC)家族的激酶。在哺乳動物、斑馬魚、爪贍等中發(fā)現(xiàn)ROCK(例如ROCKl 和R0CK2)。人ROCKl具有ISOkDa的分子量且是小GT化Se化oA的主要下游效應物。哺 乳動物ROCK包含激酶域、卷曲螺旋區(qū)、和血小板-白細胞激酶C底物同源(Plec