可降解性。經(jīng)過葡聚糖修飾的藻藍蛋白在水中可以自組裝成膠束結(jié)構(gòu)，具有類似PEG的長循環(huán)性質(zhì)，因而在生物醫(yī)藥領(lǐng)域葡聚糖具有很好的應用價值。在制備藻藍蛋白-葡聚糖復合物的過程中，我們只加入了水為溶劑，通過美拉德反應使糖和蛋白結(jié)合在一起。美拉德反應也不同于其他的有機化學反應，在反應過程中同樣沒有添加任何有機化學試劑，這就為本發(fā)明合成的藻藍蛋白膠束的應用奠定了生物學基礎(chǔ)。在形成膠束的第二步，我們加入了蟲草素為抗腦癌藥物，通過非共價鍵與藻藍蛋白結(jié)合，自組裝形成最終的包裹藥物的膠束。
[0031]具體地，本發(fā)明的研究分為三大部分:首先通過美拉德反應將葡聚糖接枝到藻藍蛋白上形成復合物，然后，通過紅外光譜、SDS-PAGE電泳、接枝度、粒徑分布、Zeta電位、透射電鏡、釋放動力學等一系列方法，對藻藍蛋白-葡聚糖復合物進行了定性表征，證明了我們成功的將葡聚糖修飾到藻藍蛋白上面，并采用0ΡΑ法定量對接枝度進行了定量的表征。第二步是在確定藻藍蛋白接枝到葡聚糖上之后，利用葡聚糖-藻藍蛋白復合物對蟲草素進行包裹，通過自組裝機理形成藻藍蛋白-葡聚糖-蟲草素膠束。在對膠束的表征上，我們通過動態(tài)光散射檢測粒徑分布和Zeta電位，篩選出葡聚糖與藻藍蛋白的最佳比例。通過透射電鏡，我們可以清楚的看到膠束的形態(tài)及分布，其粒徑在50?80nm(當納米粒子的直徑小于200nm時，可以有效通過血腦屏障)，因此可以通過血腦屏障，而且對于小尺寸的膠束來說，可以有效的避免腎排斥，延長了膠束在血液中的作用時間，使其最終能在腫瘤組織處被動積累。最后，在合成膠束成功后，我們研究了合成的藻藍蛋白-葡聚糖-蟲草素膠束在細胞水平的抗腦癌作用，通過臺盼藍染色、定量的細胞計數(shù)、以及流式細胞術(shù)等實驗手段，證明了藻藍蛋白-葡聚糖-蟲草素膠束對腦癌細胞的生長具有抑制作用，可用于腦癌的治療。這也將成為納米材料用于腦癌治療的新方法，對于該疾病的治療研究有很大的指導意義。
[0032]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明制備的藻藍蛋白-葡聚糖-蟲草素膠束能夠穿過血腦屏障到達腫瘤處，對腦癌細胞具有顯著的抑制作用，而且膠束的中作為載體的藻藍蛋白對人體具有抗癌保健作用，同時包裹的天然抗癌藥物蟲草素的膠束對腦瘤細胞有很好的抑制作用。更重要的是，本發(fā)明克服了蟲草素在體內(nèi)24 h就完全代謝的問題，將蟲草素包裹在膠束里面，經(jīng)載體運輸?shù)竭_腦腫瘤處，還可以實現(xiàn)藥物的緩慢釋放，在血液中的留存作用時間較長，使其最終能在腫瘤組織處被動積累。
[0033]本方面制備藻藍蛋白-葡聚糖-蟲草素膠束所用材料均來源于天然有效成分，且合成過程沒有加入任何有機溶劑，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在腦癌的治療應用方面具有很大的潛力和前景。
[0034]另外，本方面選取葡聚糖接枝藻藍蛋白并包裹蟲草素形成膠束，將藻藍蛋白作為載體參與膠束的合成，提高了藻藍蛋白的應用潛力，同時將蟲草素包裹在膠束里面，擴大了蟲草素在腦癌治療方面的應用范圍，為有效治療腦癌提供了一條新的途徑。
[0035]本發(fā)明的制備方法可以有效包封抗癌藥物，并增加其抗腫瘤活性，減緩藥物釋放速度。藻藍蛋白-葡聚糖-蟲草素膠束合成成功，不僅為藻藍蛋白與蟲草素的應用提供了新思路，也為腦癌的研究和治療提供了新的方向。
【附圖說明】
[0036]圖1為藻藍蛋白-葡聚糖復合物的合成示意圖。
[0037]圖2為利用傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀對藻藍蛋白、葡聚糖以及干燥處理后的藻藍蛋白-葡聚糖復合物表征的紅外譜圖；a為藻藍蛋白的紅外譜圖，13為葡聚糖的紅外譜圖，c為葡聚糖與藻藍蛋白比例為1:1的反應合成的美拉德反應產(chǎn)物。
[0038]圖3為藻藍蛋白(P)、葡聚糖(D)、藻藍蛋白/葡聚糖混合物(P/D)和藻藍蛋白-葡聚糖復合物(P-D)的SDS-PAGE電泳圖。
[0039]圖4為鄰苯二甲醛法分析藻藍蛋白上葡聚糖的接枝度。
[0040]圖5為藻藍蛋白-葡聚糖-蟲草素膠束的粒徑分布。
[0041]圖6為藻藍蛋白-葡聚糖-蟲草素膠束的Zeta電位測量結(jié)果。
[0042]圖7為藻藍蛋白-葡聚糖-蟲草素膠束的透射電鏡圖。
[0043]圖8為藻藍蛋白-葡聚糖-蟲草素膠束的體外緩釋性能測試結(jié)果。
[0044]圖9為各處理組臺盼藍染色后的細胞照片。
[0045]圖10為各處理組細胞存活率統(tǒng)計結(jié)果。
[0046]圖11為流式細胞術(shù)檢測C6細胞凋亡的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0047]以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設備。
[0048]除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
[0049]以下實施例中所用材料為:
(1)細胞株:大鼠腦膠質(zhì)瘤細胞細胞(C6細胞系)由中國科學院深圳先進技術(shù)研究所提供，經(jīng)本實驗室傳代培養(yǎng)。
[0050] (2)主要試劑:藻藍蛋白(Phycocyanin)，購自浙江臺州賓美生物科技有限公司；葡聚糖(Dextran)，購自廣州鵬辰生物科技有限公司；蟲草素(Cordycepin)，購自廣州威佳生物科技有限公司；胰酶、高糖DMEM培養(yǎng)基均為GIBC0BRL公司產(chǎn)品；新生小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；24孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)基板為美國Corning康寧公司產(chǎn)品。[0051 ] (3)儀器:德國LE0公司場發(fā)射掃描電鏡LE0 1530 VP，Nikon顯微鏡，日本Olympus公司光學倒置顯微鏡，Sigma32184高速冷凍離心機，Thermo C02培養(yǎng)箱，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠78-1磁力攪拌器，HV-85高壓滅菌器，無菌操作臺，廣州科橋?qū)嶒灱夹g(shù)設備有限公司恒溫水浴鍋等。
[0052]實施例1藻藍蛋白-葡聚糖復合物的制備 1、制備藻藍蛋白-葡聚糖復合物
藻藍蛋白-葡聚糖復合物的合成示意圖如附圖1所示。具體地，方法如下:
51.取5支試管稱量5份、每份20mg的藻藍蛋白分別加入試管中，分別稱量5mg、10mg、20mg、40mg、80mg分子量為70KD葡聚糖，分別加入5支試管中，使試管中葡聚糖與藻藍蛋白的比例分別為 0.25:1，0.5:1，1:1，2:1，4:1;
52.每支試管加入lml去離子水，超聲震蕩至葡聚糖和藻藍蛋白均完全溶解；
53.將溶液的pH值調(diào)節(jié)到3.8，然后將混合溶液冷凍干燥；
54.將冷凍干燥的固體放在裝有飽和KBr溶液的密閉容器中(相對濕度為79%)，置于60°C下進行美拉德反應48 h;美拉德反應產(chǎn)物即為藻藍蛋白-葡聚糖復合物。
[0053]將美拉德反應產(chǎn)物用去離子水溶解，同樣每支試管加入lml的去離子水配成溶液，將所得樣品溶液置于4°C冰箱中保存。
[0054]2、藻藍蛋白-葡聚糖復合物的表征 (1)傅里葉紅外光譜檢測
分別將藻藍蛋白、葡聚糖以及干燥處理后的藻藍蛋白-葡聚糖復合物放入研缽中，加入一定量的KBr，研磨均勻使混合物研磨到粒度小于2μπι，以免散射光影響，之后放入干燥機中進行干燥處理，在油壓機上用lOMPa左右的壓力將混合物壓成透明薄片，上機測定。
[0055]結(jié)果如附圖2所示，圖中，譜圖a在1657cm—1有一強的吸收峰，是藻藍蛋白上的C=0伸縮振動;在1546 cm—1有一強吸收峰，是藻藍蛋白上的酰胺亞基N-H的彎曲振動。譜圖b在1649的吸收峰為葡聚糖上的C=0的伸縮振動。譜圖c相比譜圖a和譜圖b，在1546 cm—1處有弱吸收峰是由于葡聚糖的接枝在藻藍蛋白上面減弱了原譜圖a中1546 cm—1處的N-H的彎曲振動。這就說明了葡聚糖與藻藍蛋白發(fā)生了N-H反應，從而說明我們的美拉德反應合成是成功的。
[0056](2