定 在1500mV。使用標準校準曲線和ESA-提供的HPLC軟件、根據代謝物的峰面積測定樣品濃 度。將樣品濃度對蛋白質含量校準。在一些情況中，根據需要用流動相稀釋樣品或注射至 多50μ1樣品，W確保硫醇水平在標準曲線范圍內。結果如圖7中所示。 W85] 實施例7 :BCM-7對DNA甲基化水平的作用 W86] 使用如上所述的甲基-CpG結合結構域（MBD)蛋白質-富集的基因組測 序（MBD-seq)，研究由BCM-7誘導的整體DNA甲基化水平燈rivediM.等人，Mol. 化arm. 2014)，而使用Agi1entV3微陣列忍片、從未處理對照組甜-SY5Y細胞和用1μΜ BCM-7處理4小時的細胞得到mRNA翻譯微陣列數據。
[0087]使用EasyDNA試劑盒（InvitrogenK1800-01)、應用適合的細胞系方案從樣品中 提取基因組DNA。使用CovarisS2與如下設置進行片段化：工作期10%，強度5, 200秒過程 中200個循環(huán)/觸發(fā)。得到具有200bp平均長度的片段。功率模式為頻率掃描，溫度6-8Γ， 水位12。將最大5μg載入帶有AFA放大器的微管中的130μ1化is-EDTA。對于具有較 少DNA輸入的樣品（降至500ng)，用Tris邸TA按照1:5稀釋DNA。用Agilent2100、應用 DNA1000忍片分析具有5-3μg輸入的DNA。在旋轉蒸發(fā)器中濃縮輸入低于3μg的DNA至 25μ1，并用高靈敏度DNA忍片檢查片段分布。使用Meth}dCap試劑盒值iagenode,Belgium) 俘獲甲基化DM。收率典型地為0. 5 - 8ng總俘獲的DM。隨后使用Illumina基因組分析 儀II(IlluminaGenomeAnalyzerII)對片段測序。用FluostarOptima平板讀出器與 如ant-iTPicoGreendsDNA測定試劑盒（InvitrogenP7589)在 480/520nm測定片段化和 俘獲的DNA濃度。
[0088] 為了制備DM文庫，將DM樣品制備基本混合物組UDNASamplePr巧Master MixSet1)(肥BE6040)與MultiplexingSamplePreparation01igo試劑盒巧6 份 樣品，Illumina陽-400-1001)組合。使用完整片段化的DM并且遵循肥B方案，使 用MultiplexingSamplePreparationOligo試劑盒中提供的多路測序連接物。用 2%瓊脂糖凝膠進行文庫的大小篩選（X〇wRange叫traAgaroseBiorad161-3107)。 使用化b+ladderdnvitrogen10787-018)，并且在120V運行凝膠電泳化rs。切下 300bps+/-50bps片段并且用Qiagen凝膠提取試劑盒柱（Qiagen28704)洗脫且用23μ1EB 洗脫。
[0089] 使用具有如下改變的Illumina文庫擴增指數方案：使用22μ1DNA并且進行21 個循環(huán)運行。用QiaquickPCR純化柱（Qiagen28101)純化樣品并且用1:5稀釋的50μ1 邸洗脫，且在旋轉蒸發(fā)器中濃縮至10μ1。使1μ1上Agilent2100服DM忍片，并通過用 Agilent2100進行涂片分析測定濃度。將樣品稀釋至lOnM。用化0H變性后，將樣品稀釋 至16pM。根據ClusterStationUserGuide制備配對-末端流動池。根據HiSeq用戶指 南進行測序（進行多路PE運行），其中對于配對末端運行使用2x51個循環(huán)。
[0090] 全部基因組DNAMBD-測序掲示出差別甲基化轉錄物（DMTs)，如錯誤發(fā)現率 (抑時<0.1和AN0VA、隨后post-hocstudent'St-檢驗（p<0. 05)所定義。轉錄物包括基 因和非編碼RNAs，它們是差別甲基化的/轉錄的。使用IngenuityPathwayAnalysis(IPA) 工具評價特定生物學或功能相關途經中BCM-7誘導的表現遺傳改變和轉錄改變，且鑒定了 顯示最高影響的途經。結果如表4中所示。還將負責乳糖代謝和乳糖合成的基因的表現遺 傳狀態(tài)的改變報道為在BCM7下改變，如圖8和9中所示。 陽0川表4 :在BCM-7影響下差別甲基化轉錄物的列表[0092]
[0093] 實施例8 :BCM-7對小腸中乳糖酶水平的作用
[0094] 從斷奶開始對NOD小鼠（雄性和雌性）使用富含來自斷奶的β-酪蛋白A1或A2 乳蛋白的膳食。運些膳食由SpecialtyFeedsPty.Ltd. (Australia)制備，W確保足夠的 組成和營養(yǎng)。在10周或20周對來自每一性別和膳食的小鼠組（η= 10)實施安樂死。在 解剖時，采集組織樣品并儲存在-80°C在RNAlater?中。在本研究中跟蹤40只NOD小鼠： 10只/組（雄性/雌性:A1/A2)。 陽0河使用來自Ambion(Austin,T訝的RNAqu劇-4PCR試劑盒分離來自細胞培 養(yǎng)物的RNA用于RNA轉錄分析。方法與制造商的方案所述相同。用面ase處理分離的RNA W純化RNA，然后使用ND-lOOONano化op分光光度計進行RNA定量。如上所述、使用來自 Roche(Indianapolis,IN)的第一鏈cDNA合成來合成cDNA。加入RNA(lmg)、dNTP混合物 (ImM)、隨機六聚體引物化OmM)與足夠分子生物學等級的&0,W達到13ml的最終樣品體 積。使每一樣品在65°C變性5分鐘，然后置于冰上。加入轉錄RT(20個單位/ml) (Roche)、 ProtectorRNase抑制劑（40U/ml) (Roche)、5轉錄物逆錄酶反應緩沖液（Roche)和分 子生物學等級&0,并將最終體積調整至20ml。隨后在PTC熱循環(huán)儀（MJResearch,St. 化uno,QC，Canada)中在25°C溫育10分鐘和在55°C溫育30分鐘。最終，通過在85°C溫育 5分鐘抑制逆轉錄酶。 W96] 使用一式S份樣品、應用來自Roche的Li曲t切cler480qRT-PCR機器進 行qRT-PCR測定燈rivedi等人，Mol.I^armcol.，2014)。使用最終體積為20ml的 5mlcDNA模板、lOmM正義和反義引物、來自Roche的10mlSYBRGreenIMaster和 地2〇進行qRT-PCR。用于該目的的引物是正向5' -GGAGTGTCACCCACAGACAG-3'和反向 5'-GAACACAAGCTACACGGGGA-3'。使樣品通過如下方案：在95°C溫育5分鐘，然后是95°C10 秒、60°C20秒和72°C30秒的45個循環(huán)，隨后是95°C5秒、65°C1分鐘和97°C的單一循環(huán)， 用于解鏈曲線，然后是在40°C冷卻90秒。在平板上運行無模板對照品（NTC)，生成解離曲 線W測定非特異性產物，并且校準W避免任何非特異性擴增。使用Roche定量方法D值Ct) 分析數據，并對β-肌動蛋白水平校準，結果如圖10中所示。
[0097] 盡管通過實施例描述了本發(fā)明，但是應當理解，可W在不脫離如權利要求所定義 的本發(fā)明范圍的情況下進行改變和變型。此外，如果存在與具體特征的已知等效特征，則并 入運類等效特征，如同本說明書中具體設及的一樣。
【主權項】
1. 組合物用于預防或減輕動物的乳糖不耐受癥狀的用途，其中該組合物包含β-酪蛋 白，且其中β-酪蛋白包含至少75%重量的β-酪蛋白Α2。2. 如權利要求1所述的用途，其中β-酪蛋白包含至少90%重量的β-酪蛋白Α2。3. 如權利要求1或權利要求2所述的用途，其中β-酪蛋白包含100%β-酪蛋白Α2。4. 如權利要求1 一 3任一項所述的用途，其中所述組合物是乳或乳制品。5. 如權利要求4所述的用途，其中所述乳是鮮乳、乳粉、由粉末重構的液體乳、脫脂乳、 均化乳、煉乳、低倍濃縮乳、巴氏殺菌乳或非巴氏殺菌乳。6. 如權利要求4所述的用途，其中所述乳制品是奶油、酸牛奶、夸克食品、干酪、黃油或 冰淇淋。7. 如權利要求1 一 6任一項所述的用途，其中乳糖不耐受癥狀包括腹部氣脹和痙攣、腸 胃氣脹、腹瀉、惡心、胃隆隆聲和嘔吐的一種或多種。8. 如權利要求1 一 7任一項所述的用途，其中預防或減輕乳糖不耐受癥狀是動物對消 耗所述組合物的急性響應。9. 如權利要求1 一 7任一項所述的用途，其中所述組合物使動物在將來暴露于乳糖時 傾向于預防或減輕乳糖不耐受癥狀。10. 如權利要求1 一 9任一項所述的用途，其中所述動物是人、狗或貓。11. 用于預防或減輕動物的乳糖不耐受癥狀的組合物，該組合物包含β-酪蛋白，且其 中β-酪蛋白包含至少75%重量的β-酪蛋白Α2。12. 乳在制備用于預防或減輕動物的乳糖不耐受癥狀的組合物中的用途，其中所述乳 包含β-酪蛋白，且其中β-酪蛋白包含至少75%重量的β-酪蛋白Α2。13. β-酪蛋白Α2在制備用于預防或減輕動物的乳糖不耐受癥狀的組合物中的用途， 其中所述乳品包含酪蛋白，且其中所述組合物包含至少75%重量的β-酪蛋白Α2。14. 如權利要求13所述的用途，其中β-酪蛋白Α2是乳成分。15. 用于預防或減輕動物的乳糖不耐受癥狀的方法，包括使動物消耗包含β-酪蛋白 的組合物，或給動物提供用于消耗的該組合物，其中β-酪蛋白包含至少75%重量的β-酪 蛋白Α2。
【專利摘要】用于預防或減輕動物的乳糖不耐受癥狀的方法，包括使動物消耗包含β-酪蛋白的組合物或給動物提供用于消耗的該組合物，其中β-酪蛋白包含至少75％重量的β-酪蛋白A2。這種作用是急性的(暴露于組合物后)和進行性的(即將暴露于乳糖)。
【IPC分類】A61K35/20, A61P1/00
【公開號】CN105431156
【申請?zhí)枴緾N201480039570
【發(fā)明人】A·J·克拉克
【申請人】艾爾牛奶有限公司
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2014年7月10日
【公告號】CA2917492A1, EP3019180A1, US20160136238, WO2015005804A1