mL。
[0172] 使用ELISA技術(shù)依照制造商（IBL-America, Inc.，MN，USA)隨上述A型流感IgG ELISA試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)分析血漿中的疫苗特異性IgGl和IgG3,并且采用下列的改良： 通過(guò)稀釋度為1:2000的對(duì)人IgGl或IgG3特異的二級(jí)辣根過(guò)氧化物（HRP)綴合抗體（Alpha Diagnostic Inti. Inc.，Texas, USA)檢測(cè)與固定化抗原結(jié)合的樣品中的特異性抗體。在底 物反應(yīng)后，添加終止溶液，并且在60分鐘內(nèi)用分光光度計(jì)在450nm測(cè)量0D。顯色的顏色強(qiáng) 度與檢測(cè)到的IgG特異性抗體的量成正比。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線直接確定樣品中的IgGl或IgG3 的量。在此測(cè)定中A型流感IgG的檢出限為1. 09U/mL。
[0173] 唾液中的疫苗特異性抗體
[0174] 使用 ELISA 技術(shù)依照制造商（IBL-America, Inc.，MN，USA)隨 A 型流感 IgG/IgA/ IgM ELISA試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)分析唾液中的疫苗特異性抗體IgG、IgA和IgM。這些測(cè)定提 供的微量滴定板已經(jīng)預(yù)先包被有A型流感抗原。通過(guò)對(duì)人IgG、IgA或IgM特異的二級(jí)酶聯(lián) 抗體檢測(cè)與固定化抗原結(jié)合的樣品中的特異性抗體。在底物反應(yīng)后，通過(guò)吸取終止溶液在 60分鐘內(nèi)用分光光度計(jì)在450nm測(cè)量0D。顯色的顏色強(qiáng)度與檢測(cè)到的IgG、IgA或IgM-特 異性抗體的量成正比。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線直接確定每個(gè)樣品中的特異性抗體的量。在這些測(cè)定 中A型流感IgG、IgA或IgM的檢出限為分別為1. 09U/mL、1. 29U/mL和1. 17U/mL。
[0175] 血漿中的破傷風(fēng)特異性IgG
[0176] 使用ELISA技術(shù)依照制造商（武漢生物制品研究所，武漢，中國(guó)）隨破傷風(fēng)抗體 Elisa試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)分析血漿中的破傷風(fēng)特異性抗體。在此試劑盒中提供的微量滴 定板已經(jīng)預(yù)先包被有對(duì)破傷風(fēng)特異性IgG特異的抗體。然后向適宜的微量滴定板孔中添加 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品。對(duì)破傷風(fēng)特異性IgG特異的生物素綴合的多克隆抗體制劑和與HRP綴合的 抗生物素蛋白也添加至每個(gè)微量滴定板孔中并孵育。然后向每孔添加 TMB底物溶液，并且 含有破傷風(fēng)特異性IgG、生物素綴合抗體和酶聯(lián)抗生物素蛋白的孔顯示顏色變化。通過(guò)添加 硫酸溶液終止酶-底物反應(yīng)，并通過(guò)分光光度計(jì)在450nm的波長(zhǎng)測(cè)量顏色變化。通過(guò)將樣 品的0D與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來(lái)確定樣品中破傷風(fēng)特異性IgG的濃度。在此測(cè)定中破傷風(fēng)特異 性IgG的檢測(cè)范圍為0. 1-40IU/L，且檢測(cè)低限為0. 1IU/L。
[0177] 血漿中的總抗體
[0178] 使用 ELISA 技術(shù)依照制造商（Groundwork Biotechnology Diagnosticate, San Diego, USA)隨人免疫球蛋白ELISA試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)分析血漿IgA、IgG、IgM、IgGl和 IgG3的總濃度。對(duì)于使用ELISA法的這些抗體，終止溶液將顏色從藍(lán)色改變?yōu)辄S色，并且 使用分光光度計(jì)在450nm測(cè)量顏色的強(qiáng)度。為了測(cè)量樣品中抗體的濃度，每個(gè)ELISA試劑 盒包括一組校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品。在與樣品同時(shí)一式兩份地測(cè)定校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品，并且得到相對(duì)于抗體 濃度的0D標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后通過(guò)將樣品的0D與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來(lái)確定樣品中抗體的濃度。對(duì) 于IgGl和IgG3的檢出限為0· 01mg/mL。IgG、IgA和IgM測(cè)定的靈敏度分別為L(zhǎng) Omg/mL、 0· 01mg/mL 和 0· lmg/mL。
[0179] 唾液中的總抗體
[0180] 使用ELISA技術(shù)并且依照制造商（USCNLIFE?武漢，中國(guó)）隨人分泌性免疫球蛋白 A，SIgA ELISA試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)分析唾液SIgA的總濃度。在此試劑盒中提供的微量滴 定板已經(jīng)預(yù)先包被有對(duì)SIgA特異的抗體。然后向適宜的微量滴定板孔中添加標(biāo)準(zhǔn)品或樣 品。對(duì)SIgA特異的生物素綴合的多克隆抗體制劑和與HRP綴合的抗生物素蛋白也添加至 每個(gè)微量滴定板孔中并孵育。然后向每孔添加 TMB底物溶液，并且含有SIgA、生物素綴合抗 體和酶聯(lián)抗生物素蛋白的孔顯示顏色變化。通過(guò)添加硫酸溶液終止酶-底物反應(yīng)，并通過(guò) 分光光度計(jì)在450nm的波長(zhǎng)測(cè)量顏色變化。通過(guò)將樣品的0D與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來(lái)確定樣品 中SIgA的濃度。在此測(cè)定中SIgA的檢出限一般為3. 9ng/mL，并且檢測(cè)低限定義為可與0 區(qū)分的最低蛋白濃度。
[0181] 使用 ELISA 技術(shù)依照制造商（ZeptoMetrix Corporation, NY, USA)隨定量人 IgG ELISA/定量人IgM ELISA試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)分析唾液IgG或IgM的總濃度。調(diào)整樣品 的濃度以獲得最適檢測(cè)濃度。在這些測(cè)定中提供的微量滴定板已經(jīng)預(yù)先包被有對(duì)人IgG或 IgM特異的多克隆抗體。將標(biāo)準(zhǔn)品或樣品一式兩份地添加至適宜的微量滴定板孔并孵育。 吸取與HRP綴合的檢測(cè)劑抗體至每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品孔中。孵育后，向每孔添加 TMB底物溶 液，并且含有人IgG或IgM的孔中顯示藍(lán)色。通過(guò)添加硫酸溶液終止酶-底物反應(yīng)，并且發(fā) 生從藍(lán)色至黃色的顏色變化。通過(guò)分光光度計(jì)在450nm的波長(zhǎng)測(cè)量顏色變化。通過(guò)將樣品 的0D與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來(lái)確定樣品中IgG或IgM的濃度。在這些測(cè)定中IgG和IgM的檢出 限一般為3. 9ng/mL，并且檢測(cè)低限定義為可與0區(qū)分的最低蛋白濃度。
[0182] 血漿中的 11-2, INF-γ 和 IL-10
[0183] 使用 ELISA 技術(shù)依照制造商（Quantikine' R&D Systems, Inc.，MN, USA)隨人 IL-2/INF- γ /IL-10免疫測(cè)定試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)分析細(xì)胞因子的血漿濃度。在這些測(cè)定 提供的微量滴定板已經(jīng)預(yù)先包被有對(duì)IL-2、IFN-y或IL-10特異的單克隆抗體。一式兩份 吸取標(biāo)準(zhǔn)品和樣品至孔中，并且存在的細(xì)胞因子被固定化抗體結(jié)合。洗掉任何未結(jié)合物質(zhì) 后，將對(duì)IL-2、IFN-y或IL-10特異的酶聯(lián)多克隆抗體加入至孔中。洗滌去除任何未結(jié)合 的抗體-酶試劑后，將底物溶液加入至孔中，并且與初始步驟中結(jié)合的細(xì)胞因子的量成比 例地顯色。停止顯色，并且通過(guò)分光光度計(jì)在450nm的波長(zhǎng)測(cè)量顏色的強(qiáng)度。通過(guò)將樣品 的0D與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來(lái)確定樣品中細(xì)胞因子的濃度。在這些測(cè)定中IL-2、IFN-y或IL-10 的檢出限一般分別小于7· 0、8· 0和3. 9pg/mL。
[0184] 吞噬作用和吞噬細(xì)胞殺傷
[0185] 根據(jù)以前由Saresella及同事（1997)描述的方法確定吞作用和殺傷。全血白 細(xì)胞（⑶13+細(xì)胞）與經(jīng)調(diào)理的異硫氰酸熒光素-標(biāo)記的（FITC-標(biāo)記）白色念珠菌芽生孢 子孵育用于吞噬作用和殺傷測(cè)定。僅活的FITC-標(biāo)記的白色念珠菌芽生孢子用作對(duì)照。
[0186] 通過(guò)對(duì)吞噬細(xì)胞（⑶13+細(xì)胞）設(shè)門(mén)（gating)和計(jì)算吞噬細(xì)胞相關(guān)的綠色熒光細(xì) 胞的百分比來(lái)確定吞噬作用和殺傷。此程序基于下列的觀察：FITC-標(biāo)記的白色念珠菌芽 生孢子在用溴化乙錠（EtBr)染色后喪失其綠色熒光且獲得紅色熒光。因此，內(nèi)化的白色念 珠菌芽生孢子仍然是綠色的，而貼壁的和未被吞噬的芽生孢子染成紅色。吞噬和殺死的PMN 的百分比與綠色的-和雙重標(biāo)記的-綠色和紅色的數(shù)目相等。
[0187] 使用裝配有在488nm下工作的風(fēng)冷的15mW氬離子激光的Coulter EPICS XL流式 細(xì)胞儀進(jìn)行吞噬作用和殺傷的細(xì)胞計(jì)數(shù)分析?；诩s10, 〇〇〇次事件的登記采集多參數(shù)數(shù) 據(jù)并且使用Coulter System II軟件分析。借助于525nm帶通濾波器測(cè)量來(lái)自FITC的綠 色熒光，而通過(guò)620nm帶通濾波器測(cè)量來(lái)自EtBr的紅色熒光。
[0188] 鑒定四個(gè)不同的組：吞噬細(xì)胞與貼壁的FITC-標(biāo)記的白色念珠菌芽生孢子 貼壁率），吞噬細(xì)胞與攝入的和貼壁的FITC-標(biāo)記的白色念珠菌芽生孢子貼壁和攝入 率），吞噬細(xì)胞與僅攝入的FITC-標(biāo)記的白色念珠菌芽生孢子攝入率），和無(wú)相互作用 的吞噬細(xì)胞無(wú)相互作用）。
[0189] 自然殺傷細(xì)胞活性
[0190] 通過(guò)用50mL預(yù)溫（37°C )的完全培養(yǎng)基填充50mL測(cè)試試管開(kāi)始自然殺傷（NK)細(xì) 胞評(píng)估。通過(guò)在37°C水浴中快速攪動(dòng)來(lái)快速?gòu)?fù)溫解凍一小瓶K562靶細(xì)胞。當(dāng)冰熔化時(shí)， 從水浴移除小瓶，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有溫完全培養(yǎng)基的試管中并輕輕混合。細(xì)胞懸液在 室溫下在1500rpm離心5min。棄去上清液，并將細(xì)胞沉淀物重懸于lmL完全培養(yǎng)基中。通 過(guò)臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)確定細(xì)胞數(shù)目，并且將細(xì)胞濃度在完全培養(yǎng)基中調(diào)整至lXl〇5/mL。如靶 細(xì)胞一樣復(fù)溫解凍和制備效應(yīng)器細(xì)胞。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)確定細(xì)胞數(shù)目，并且將細(xì)胞濃 度在完全培養(yǎng)基中調(diào)整至lxl〇5/mL。對(duì)于"高對(duì)照"樣品，將30μ1 IL-2(200U/mL)加入至 效應(yīng)器細(xì)胞懸液中。將效應(yīng)器細(xì)胞與K562靶細(xì)胞以25:1E:T的比率以200 μ 1的最終體積 混合。使用單獨(dú)的靶細(xì)胞作為對(duì)照。將所有試管渦旋并在1500rpm離心3min。然后在濕 化C0J?箱中將試管孵育120min。每個(gè)試管加入50 μ 1 DNA染色溶液，渦旋并在冰上孵育 5min。最后，加入250 μ1 PBS，并通過(guò)流式細(xì)胞儀分析樣品。ΝΚ細(xì)胞活性計(jì)算為以25:1的 Ε:Τ比率殺死的％靶細(xì)胞。
[0191] CD4陽(yáng)性Τ淋巴細(xì)胞
[0192] 采用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)使用與人CD4(由大多數(shù)胸腺細(xì)胞，成熟Τ輔助細(xì)胞的亞 群，和單核細(xì)胞（以低水平）表達(dá)的59kDa細(xì)胞表面受體）反應(yīng)的單克隆抗體（藻紅蛋白 抗人⑶4 ;eBioscience?，San Diego，USA)分析⑶4+T細(xì)胞。此抗體被預(yù)滴定且通過(guò)正常人 PBMC的流式細(xì)胞檢測(cè)分析進(jìn)行測(cè)試。其以100 μ 1的總?cè)旧w積以5 μ 1 (0. 125 μ g)/百萬(wàn) 個(gè)細(xì)胞使用。
[0193] 實(shí)施例5
[0194] 使用 SAS 包 9· 2 版（SAS Institute Inc.，Cary, NC, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0195] 多重比較（MC)
[0196] 為多重性的緣故通過(guò)Holm-Bonferroni法（Holm 1979)調(diào)整主要功效變量。僅相 關(guān)的配對(duì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較：干酪乳桿菌431 ?飲