免疫佐劑的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請人科?漢森有限公司于2011年10月14日提交的發(fā)明名稱為"免疫 佐劑"的中國專利申請No. 201180049679. 8的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及乳酸菌用于擴(kuò)大針對傳染原的特異性免疫應(yīng)答的用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 根據(jù)糧農(nóng)組織（FA0)和世界衛(wèi)生組織（WHO)的定義，益生菌是當(dāng)以適當(dāng)?shù)牧渴┯?時對宿主提供健康益處的活細(xì)菌（FA0/WH0 2001)。益生菌已經(jīng)顯示對不同的病癥諸如乳 糖吸收不良、急性腹瀉、抗生素相關(guān)性腹瀉、變態(tài)反應(yīng)和炎性腸病具有有益作用（Goldin和 Gorbach 2008)〇
[0004] 益生菌通常見于乳桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬和雙歧桿菌屬中。來自這些種屬的 許多菌株通常用于制備奶酪、酸奶和其他乳制品。
[0005] 益生菌被認(rèn)為尤其在腸道菌群水平上通過阻礙病原微生物的發(fā)育，和/或更直接 地作用于免疫系統(tǒng)進(jìn)行干預(yù)。例如，已經(jīng)觀察到攝入益生菌或包含這些細(xì)菌的發(fā)酵食品諸 如酸奶，導(dǎo)致病原菌的減少；就免疫系統(tǒng)而言，已經(jīng)報道了許多作用：激活參與特異性或非 特異性免疫應(yīng)答的細(xì)胞，諸如淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，增加免疫球蛋白且特別是IgA的水平； 增加激活免疫系統(tǒng)的細(xì)胞因子的水平，等等（綜述，參見，例如MEYDANI和HA(Am J Clin Nutr, 71，861-7217, 2000)。
[0006] 總之，對各種益生乳酸菌進(jìn)行的研究傾向于得出這樣的結(jié)論：一些種屬，或這些種 屬的至少一些菌株具有免疫刺激特性。
[0007] 在人類和動物中進(jìn)行的數(shù)個研究表明干酪乳桿菌屬（L.casei)的細(xì)菌對健康具 有有益作用，且特別是對免疫系統(tǒng)具有積極作用。
[0008] 在小鼠中的干酪乳桿菌研究
[0009] 在小鼠中已經(jīng)表明攝入含有干酪乳桿菌菌株DN-114 001的發(fā)酵乳增加對鼠傷寒 沙門氏菌感染的抵抗力[PAUBERT-BRAQUET 等，Int J Immunother，4:153, (1995)];已經(jīng)同 時觀察到巨噬細(xì)胞的激活和循環(huán)IgA的增加。
[0010] 已經(jīng)飼以副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillus paracasei ssp. paracasei) (干酪乳桿菌431K )的營養(yǎng)不良小鼠形成提高的針對肺炎球菌呼吸道感染的抵抗力 (Villena等2005)。這顯示為與對照組相比更有效地從血液中清除病原體和顯著更少的肺 損害。另外，白細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)目以及抗肺炎球菌的IgA增加（Villena等2005)。
[0011] 在人中的干酪乳桿菌研究
[0012] 在健康成人中，在受試者口服接種脊髓灰質(zhì)炎疫苗的研究中補(bǔ)充含鼠李糖乳桿 菌LGG? (Lact〇bacillus rhamnosusLGG脅）（LGG?)或干酪乳桿菌431.備的化學(xué)酉愛化 乳在第8天時導(dǎo)致循環(huán)中和抗體滴度增加。特別地，脊髓灰質(zhì)炎病毒特異性免疫球蛋白 △ (184)、186和181增加（如￥代％等2005)。作者得出結(jié)論益生菌誘發(fā)免疫應(yīng)答，其可以通 過增加病毒中和抗體的產(chǎn)生來提供使細(xì)胞免受病毒感染的增強(qiáng)的全身保護(hù)（de Vrese等， 2005)。該文章報道的結(jié)果顯示盡管在同一方向上相關(guān)且有指示，但差異并非在所有情況下 顯著。關(guān)于干酪乳桿菌431:1<的僅有的統(tǒng)計學(xué)顯著的結(jié)果是對血清型-2-特異性IgM的作 用是統(tǒng)計學(xué)顯著的。在兒童中使用BB-12"的研究顯示增加的糞便IgA
[0013] 在兒童中的數(shù)個研究已經(jīng)顯示益生菌株動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalis ssp.lactis)，BB-12· 的免疫調(diào)節(jié)特性。將在斷奶配方中 施用于在12個月齡時已經(jīng)完成了口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗接種的7名兒童（15至31個月 大）顯著增加了糞便中的總IgA和抗脊髓灰質(zhì)炎病毒IgA的濃度，這可以促進(jìn)增強(qiáng)的針對 胃腸道感染的粘膜抵抗力（Fukushima等，1998)。在嬰兒的飲食中引入牛乳時配方奶喂養(yǎng) 的嬰兒在其1歲期間攝入U3G+和BB-12K的組合導(dǎo)致牛乳特異性IgA分泌細(xì)胞的增加 (Rautava等，2006)。與對照組相比，在早產(chǎn)嬰兒中，持續(xù)21天口服給予BB-：! 2 導(dǎo)致增加 的糞便IgA。另外，體重、糞便中的醋酸鹽和乳酸鹽的濃度均較高，后一發(fā)現(xiàn)表明改善的乳糖 硝化。在益生菌組中糞便中的鈣衛(wèi)蛋白減少，證明改善的粘膜免疫力和對飲食抗原和細(xì)菌 抗原的炎性應(yīng)答減輕（Mohan等，2008)。
[0014] 在干酪乳桿菌43丨以外的其他干酪乳桿菌菌株中的流感疫苗模型
[0015] 對于其他益生菌株的采用流感疫苗模型的早期研究的結(jié)果已經(jīng)被描述。在先導(dǎo)研 究中，在86名70歲以上的老年受試者（η = 86)中持續(xù)7周攝入含有益生菌株干酪乳桿 菌（Lactobacillus casei)DN_114 001的發(fā)酵乳制品導(dǎo)致對流感疫苗接種的改善的免疫應(yīng) 答。與對照組中相比，在益生菌組中針對特定流感菌株的血清保護(hù)率和血清轉(zhuǎn)換率持續(xù)較 高。另外，流感特異性抗體滴度在疫苗接種后增加，在益生菌產(chǎn)品組中與對照組相比持續(xù)較 高。然而，組間的差異在統(tǒng)計學(xué)上并不顯著（Boge等，2009)。隨后，在持續(xù)13周攝入含有 干酪乳桿菌DN-114 001的發(fā)酵乳飲料或未發(fā)酵的對照乳制品的222名老年志愿者（平均 年齡85歲）中進(jìn)行了驗證性研究。還在此研究中，在疫苗接種后與對照組相比，在益生菌 產(chǎn)品組中特異性抗體滴度持續(xù)較高。在整個產(chǎn)品消費(fèi)期期間，相對于對照組在益生菌組中， B菌株抗體滴度和血清轉(zhuǎn)換顯著較高。在B菌株和H3N2菌株接種后5個月仍然觀察到通過 治療意向（ITT)分析的組間血清轉(zhuǎn)換率的顯著性差異（Boge等，2009)。
[0016] 在健康成人志愿者（η = 50)中，口服攝入含發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum) CECT5716的膠囊顯著地增加流感疫苗接種后的抗原特異性IgA和總IgM并且使 得在疫苗接種后2周，與對照組相比在益生菌組中這些抗體的濃度較高。另外，在益生菌組 中在流感疫苗接種后2周，自然殺傷（NK)細(xì)胞的產(chǎn)生增加。最后，與對照組相比，在攝入益 生菌的組中在疫苗接種后5個月期間流感樣病的發(fā)病率較低，在5個月時（在二月）組間 具有顯著性差異（Olivares等，2007)。
[0017] 盡管有這些研究，由于益生菌的健康益處是菌株依賴性的，對一種益生菌株所證 明的功能效應(yīng)不一定能夠延伸至其他菌株（聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization) (2002). Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. Report of a Joint FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. London/Ontario (食品中益生菌的評價原則。關(guān)于起草食品中益生菌的評價原則 的 FA0/WH0 聯(lián)合工作組。倫敦 / 安大略）：FA0/WH0 和 Rijkers GT，Bengmark S，Enck P, 等(2010)Guidance for substantiating the evidence for beneficial effects of probiotics: current status and recommendations for future research (用于證明益生 菌的有益作用的證據(jù)的指導(dǎo)原則：現(xiàn)狀和未來研究的建議）J Nutr 140,671S-676S)。由于 關(guān)于動物雙歧桿菌乳亞種和副干酪乳桿菌副干酪亞種（干酪乳桿菌431?)的免 疫調(diào)節(jié)作用的人類數(shù)據(jù)非常稀少，認(rèn)為在使用流感疫苗接種激發(fā)的對照的、足夠統(tǒng)計學(xué)效 力的實驗中進(jìn)一步研究這兩種益生菌株的作用是很重要的，因為仍然需要進(jìn)一步開發(fā)更有 效的用于引起有效免疫應(yīng)答的技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明人已經(jīng)顯示將干酪乳桿菌431或BB-12與流感疫苗聯(lián)合施用產(chǎn)生比僅用疫 苗所見的更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。因此本發(fā)明涉及用于通過共同施用益生菌諸如干酪乳桿菌431 或BB-12與流感疫苗來加強(qiáng)疫苗的效率的方法。本發(fā)明還涉及用于這種治療中的組合物。
【附圖說明】
[0019] 圖1研究組在基線和第42天時的疫苗特異性血漿IgG，其中*表示與安慰劑迷你 飲料顯著不同，**表示與安慰劑膠囊顯著不同。
[0020] 圖2研究組在基線和第42天時的疫苗特異性血漿IgGl，其中*表示與安慰劑迷你 飲料顯著不同，**表示與安慰劑膠囊顯著不同。
[0021] 圖3研究組在基線和第42天時的疫苗特異性血漿IgG3,其中*表示與安慰劑迷你 飲料顯著不同，**表示與安慰劑膠囊顯著不同。
[0022] 圖4研究組在基線和第42天時的疫苗特異性唾液IgG。
[0023] 圖5研究組在基線和第42天時的疫苗特異性唾液IgA，其中*表示與安慰劑迷你 飲料顯著不同，**表示與安慰劑膠囊顯著不同。
[0024] 圖6研究組在基線和第42天時的疫苗特異性唾液IgM，其中**表示與安慰劑膠囊 顯著不同。
【具體實施方式】
[0025] 為了檢驗益生菌對免疫應(yīng)答的作用，為了下列的原因本研究利用了流感疫苗模 型：
[0026] ?對病原體的天然暴露是高度不可控的和不可預(yù)測的，并且通過使用疫苗模型， 以對死亡的或減毒的微生物（疫苗）的可控暴露來替代天然暴露。疫苗引發(fā)體內(nèi)免疫應(yīng)答， 免疫應(yīng)答指示免疫系統(tǒng)引起針對病原體的抗原特異性應(yīng)答的能力（Albers等，2005)。對疫 苗接種的應(yīng)答是廣泛使用的免疫功能的標(biāo)志物，其提供關(guān)于營養(yǎng)素對保護(hù)性體內(nèi)免疫應(yīng)答 性的作用的高質(zhì)量信息（Albers等，2005)。疫苗模型是經(jīng)過充分研究的模型，并且因此結(jié) 果易于與來自先前研究的結(jié)果相比較。流感疫苗年年都被使用，并且因此是簡單易得的模 型。該模型可以在大量的人群中使用，使得其易于招募到足