);進樣:Wate瑪1525栗，717自動取樣器，進樣量為20出；工作站=Breeze色譜工作站。
[0102]實驗結果表明，DOX載藥率可達77%，DOX在EGFR-Dextran-Dox中的質(zhì)量百分比為 23%0
[0103]5、EGFR-Dextran-DOX抗腫瘤藥物的pH響應特性
[0104]將20毫升的EGFR-Dextran-DOX溶液置于透析中并浸入480毫升pH (4，5，6，7)緩沖液中，配制PH分別為4、5、6和7的樣品，在37 °C下于選定的時間間隔，取透析袋外I毫升的溶液通過HPLC檢測DOX的含量，并制成藥物釋放曲線，其中HPLC的參數(shù)同實施例4。
[0105]實驗結果如圖5所示，由圖5可知，EGFR-Dextran-DOX抗腫瘤藥物具有pH響應特性，調(diào)節(jié)PH值可達到控制DOX釋放的目的。因為外周循環(huán)血的pH值為7?7.4，而腫瘤局部及腫瘤細胞內(nèi)的pH值為4?6之間，因而EGFR-Dextran-DOX在血中可保持相對的穩(wěn)定，保證了大部分藥物在腫瘤局部釋放而發(fā)揮靶向治療作用，并降低了副作用。
[0106]6、細胞內(nèi)的EGFR-Dextran-DOX抗腫瘤藥物中DOX定位和實時監(jiān)測藥物釋放
[0107]利用共焦掃描顯微鏡熒光顯色觀察EGFR-Dextran-DOX抗腫瘤藥物中D0X。
[0108]實驗結果如圖6(a)、圖6(b)和圖6(c)所示，EGFR顯示綠色熒光，DOX顯示紅色熒光，重疊后顯示為黃色。
[0109]由圖6 (a)、圖 6 (b)和圖 6 (c)可知，EGFR-Dextran-DOX 中的 DOX 經(jīng) EGFR 介導的細胞內(nèi)吞后可以于胞內(nèi)釋放藥物進而到達其靶點而發(fā)揮細胞毒作用。
[0110]7、EGFR-Dextran-DOX及Dextran-DOX抗腫瘤藥物的抗腫瘤療效
[0111]選用荷人TNBC腫瘤細胞MDA-MB231 (EGFR高表達)及MDA-MB231 (EGFR敲除)的裸鼠為動物模型，3只小鼠/組，藥物濃度:I毫克/公斤體重，皮下注射給藥，2次/周，治療3周，觀察Dextran-DOX (實施例3所制備的)及EGFR-Dextran-DOX的抗瘤療效，以PBS緩沖液和DOX作為對照。
[0112]實驗結果如圖7所示，給予EGFR-Dextran-DOX納米粒子治療的小鼠，瘤體體積較Dextran-DOX及非革El向DOX納米粒明顯縮小，而Dextran-DOX的效果優(yōu)于非革El向D0X。說明低濃度下(I毫克/公斤體重),EGFR-Dextran-DOX的抗瘤活性較Dextran-DOX及非革E向性DOX納米顯著增強，而Dextran-DOX的抗腫瘤活性高于非靶向性D0X。
[0113]實施例6
[0114]制備抗腫瘤藥物
[0115]1、購買美國SANT CRUZE公司的EGFR單克隆抗體，使用近紅外染料Cy5.5和熒光探針標記并定量EGFR，將標記和定量好的EGFR單克隆抗體和實施例1制備的右旋糖酐納米藥物載體Dextran按摩爾比25:1進行混合，然后加入碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺得到第一混合液，其中，碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為10:1，旋糖酐納米藥物載體Dextran與碳二亞胺的摩爾比為1:100 ;用MES緩沖液調(diào)節(jié)第一混合液的pH為5，然后于室溫下反應4小時，MES緩沖液洗滌3次，得到中間產(chǎn)物；
[0116]2、將中間產(chǎn)物溶于無水DMSO中得到濃度為0.2g/mL的含有中間產(chǎn)物的溶液，將含有中間產(chǎn)物的溶液滴加入聯(lián)氨溶液中，并加入摩爾比為10:1的碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺得到第二混合液，其中，含有中間產(chǎn)物的溶液與聯(lián)氨溶液的體積比為3:2 ;將第二混合液于室溫下反應20小時，反應結束后，用甲醇沉淀，冷凍干燥得氨基修飾的中間產(chǎn)物；
[0117]3、將氨基修飾的中間產(chǎn)物溶于無水DMSO中，加入肉桂醛，在40°C下振蕩48小時，在去離子水中透析48小時，冷凍干燥，得到抗腫瘤藥物。
[0118]實施例7
[0119]制備EGFR-Dextran-DOX 抗腫瘤藥物
[0120]1、購買美國SANT CRUZE公司的EGFR單克隆抗體，使用近紅外染料Cy5.5和熒光探針標記并定量EGFR，將標記和定量好的EGFR單克隆抗體和實施例1制備的右旋糖酐納米藥物載體Dextran按摩爾比25:1進行混合，然后加入碳二亞胺和N-輕基琥?自酰亞胺得到第一混合液，其中，碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為8:1，旋糖酐納米藥物載體Dextran與碳二亞胺的摩爾比為1:80 ;用MES緩沖液調(diào)節(jié)第一混合液的pH為5，然后于室溫下反應3小時，MES緩沖液洗滌3次，得到中間產(chǎn)物；
[0121]2、將中間產(chǎn)物溶于無水DMSO中得到濃度為0.2g/mL的含有中間產(chǎn)物的溶液，將含有中間產(chǎn)物的溶液滴加入聯(lián)氨溶液中，并加入摩爾比為8:1的碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺得到第二混合液，其中，含有中間產(chǎn)物的溶液與聯(lián)氨溶液的體積比為3:2 ;將第二混合液于室溫下反應25小時，反應結束后，用甲醇沉淀，冷凍干燥得氨基修飾的中間產(chǎn)物；
[0122]3、將氨基修飾的中間產(chǎn)物溶于無水DMSO中，加入阿霉素，在40°C下振蕩60小時，在去離子水中透析48小時，冷凍干燥，得到EGFR-Dextran-DOX抗腫瘤藥物。
[0123]以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【主權項】
1.一種右旋糖酐納米藥物載體，其特征在于，包括羧基化的右旋糖酐納米粒子，所述羧基化的右旋糖酐納米粒子的粒徑為20?100納米。2.一種右旋糖酐納米藥物載體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 在保護氣體氛圍中，將右旋糖酐溶于溶劑中，制備得到第一溶液； 在保護氣體氛圍中，將硝酸鈰銨溶于硝酸中，制備得到第二溶液； 在保護氣體氛圍中，將所述第二溶液注入所述第一溶液中，并于20?30°C下反應5?10分鐘，加入丙烯酸，再于20?30°C下反應20?30分鐘，加入N, N-亞甲基雙丙烯酰胺，然后于20?30°C下繼續(xù)反應4?6小時，分離純化，得到所述右旋糖酐納米藥物載體，所述右旋糖酐納米藥物載體包括羧基化的右旋糖酐納米粒子，所述羧基化的右旋糖酐納米藥物粒子的粒徑為20?100納米。3.根據(jù)權利要求2所述的右旋糖酐納米藥物載體的制備方法，其特征在于，所述分離純化的方法為:將反應液的pH調(diào)至中性，然后將反應液裝入透析袋中，在去離子水中透析72小時，冷凍干燥，得到所述右旋糖酐納米藥物載體。4.一種抗腫瘤藥物，其特征在于，包括阿霉素和肉桂醛中的一種及如權利要求1所述的右旋糖酐納米藥物載體，所述阿霉素和肉桂醛中的一種通過腙鍵連接于所述右旋糖酐納米藥物載體上。5.一種抗腫瘤藥物，其特征在于，包括阿霉素和肉桂醛中的一種、EGFR抗體及如權利要求I所述的右旋糖酐納米藥物載體，所述EGFR抗體與所述右旋糖酐納米藥物載體相連，所述阿霉素和肉桂醛中的一種通過腙鍵連接于所述右旋糖酐納米藥物載體上。6.根據(jù)權利要求5所述的抗腫瘤藥物，其特征在于，所述阿霉素和肉桂醛中的一種的質(zhì)量百分比為23%。7.一種抗腫瘤藥物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 混合EGFR抗體和如權利要求1所述的右旋糖酐納米藥物載體，并加入碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺得到第一混合液，將所述第一混合液的pH值調(diào)節(jié)為4.5?5，于室溫下反應2?4小時，分離純化得到中間產(chǎn)物； 將所述中間產(chǎn)物溶于溶劑中得到含有中間產(chǎn)物的溶液，將所述含有中間產(chǎn)物的溶液滴加入聯(lián)氨溶液中，并加入碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺得到第二混合液，將所述第二混合液于室溫反應20?25小時，分離純化得到氨基修飾的中間產(chǎn)物； 將所述氨基修飾的中間產(chǎn)物溶于溶劑中，加入阿霉素和肉桂醛中的一種，在35?40°C下振蕩48?72小時，分離純化后得到所述抗腫瘤藥物。8.根據(jù)權利要求7所述的抗腫瘤藥物的制備方法，其特征在于，所述EGFR抗體和所述右旋糖酐納米藥物載體的摩爾比為20?30:1。9.根據(jù)權利要求7所述的抗腫瘤藥物的制備方法，其特征在于，所述并加入碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺得到第一混合液的步驟中，所述碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為5?10:1。10.根據(jù)權利要求7所述的抗腫瘤藥物的制備方法，其特征在于，所述并加入碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺得到第二混合液的步驟中，所述碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為5?10:1。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種右旋糖酐納米藥物載體及其制備方法與抗腫瘤藥物及其制備方法。該右旋糖酐納米藥物載體包括羧基化的右旋糖酐納米粒子，所述羧基化的右旋糖酐納米粒子的粒徑為20～100納米。粒徑為20～100納米的羧基化右旋糖酐納米粒子具有良好的生物包容性及降解性，可以用于負載藥物作用于人體，并且由于羧基化的右旋糖酐本身的結構特點，可以通過腙鍵負載藥物，腙鍵對pH敏感，在特定的pH環(huán)境下斷裂而靶向釋放藥物。因此，上述右旋糖酐納米藥物載體可以用于建立pH響應的釋藥系統(tǒng)，以提高療效，減少副作用。
【IPC分類】A61K47/48, A61K47/26, A61K31/704, A61K9/19, A61K39/395, A61P35/00
【公開號】CN105148279
【申請?zhí)枴緾N201510366568
【發(fā)明人】謝妮, 朱婷, 萬麗麗, 齊素文
【申請人】深圳市第二人民醫(yī)院
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年6月26日