沙美特羅在治療二型糖尿病、胰島素抵抗藥物上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及沙美特羅在治療胰島素抵抗，抗二型糖尿病 藥物上的應(yīng)用和治療二型糖尿病的藥物。 技術(shù)背景
[0002] 二型糖尿病成為最主要的糖尿病類型，患病人口增長迅速且日趨年輕化，胰島素 抵抗是二型糖尿病的主要發(fā)病原因。市場上主要治療胰島素抵抗的胰島素增敏劑藥物主要 是噻唑烷二酮類（TZD)抗糖尿病藥，噻唑烷二酮類藥物作為可以治療胰島素抵抗的抗糖尿 病藥物，是由于此類化合物是PPARY受體的激動劑，PPARY激活后可以調(diào)節(jié)CAP蛋白的表 達(dá)，Cbl/CAP連接蛋白又會激活其下游蛋白Crk、TClO等分子，它們最終將促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn) 子將葡萄糖由胞外裝運(yùn)到胞內(nèi)，以達(dá)到降低血糖目的。但由于此類藥物會引發(fā)心衰、水腫及 肝功能障礙等不良反應(yīng)，因此研究新型胰島素增敏劑類抗糖尿病藥物是很必要的。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，沙美特羅（Salmeterol)，具有強(qiáng)大的抑制肺肥大細(xì)胞釋放過敏反應(yīng) 介質(zhì)作用，可抑制吸入抗原誘發(fā)的早期和遲發(fā)相反應(yīng)，降低氣道高反應(yīng)性。主要用于哮喘 (包括夜間哮喘和運(yùn)動性哮喘）、喘息性支氣管炎和可逆性氣道阻塞。本發(fā)明通過大量的實(shí) 驗(yàn)研究，發(fā)明了沙美特羅在制備治療或預(yù)防糖尿病藥物中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有市場上胰島素增敏劑類藥物較少的不足，本發(fā)明為治療二型糖尿病、胰 島素抵抗更多的選擇，發(fā)明沙美特羅在治療或預(yù)防糖尿病的藥物中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明研究表明，沙美特羅（Salmeterol)，CAS號：89365-50-4,化學(xué)名稱： 4-(1-羥基-2-(6-(4-苯基丁氧基）己基氨基）乙基）-2-(羥甲基）苯酚，分子式：C25H37NO4, 分子量：415. 57,分子結(jié)構(gòu)：
[0006]
[0007] 3T3-L1細(xì)胞建立胰島素抵抗模型，油紅0染色鑒定細(xì)胞模型后，沙美特羅作用于 建模成功的胰島素抵抗的3T3-L1細(xì)胞，24h后測定細(xì)胞葡萄糖的消耗量，當(dāng)藥物濃度為 I. 5nmol/L時(shí)與正常組、陽性最有藥物濃度組的葡萄糖消耗量已不存在差異性，且葡萄糖消 耗量最高。因此，可以確定沙美特羅具有提高3T3-L1胰島素抵抗模型細(xì)胞葡萄糖消耗量的 藥物作用效果（參見圖1)。
[0008]SD雄性大鼠采用高糖高脂飼料飼喂，小劑量STZ(鏈脲佐菌素）注射誘導(dǎo)的方法構(gòu) 建二型糖尿病大鼠模型。沙美特羅作用于模型大鼠四周后藥物組的血糖值均降到了正常值 范圍內(nèi)（參見附圖2)，肝臟和血液中的葡萄糖含量均降到了正常值范圍內(nèi)（附圖3)，甘油 三酯和總膽固醇含量已趨于正常值（附圖4、5)，游離脂肪酸和胰島素含量值已于正常組之 間不存在差異性（見表1)，與模型組之間存在差異性，表明沙美特羅具有降低血糖、抗糖尿 病的功效。ELISA法測定PPARy蛋白表達(dá)量發(fā)現(xiàn)沙美特羅具有提高PPARy蛋白表達(dá)量的 功能（見表2)。
[0009] 表1沙美特羅對二型糖尿病模型大鼠游離脂肪酸和胰島素含量影響

【附圖說明】：
[0014] 圖1為沙美特羅對胰島素抵抗3T3-L1細(xì)胞模型葡萄糖消耗量影響柱狀圖；
[0015] 圖2為沙美特羅對二型糖尿病模型大鼠血糖影響變化折線圖；
[0016]圖3為沙美特羅對二型糖尿病模型大鼠肝臟和血液中的葡萄糖含量影響柱狀圖；
[0017] 圖4為沙美特羅對二型糖尿病模型大鼠甘油三酯含量影響柱狀圖；
[0018] 圖5為沙美特羅對二型糖尿病模型大鼠總膽固醇含量影響柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】：
[0019] 下面通過具體的實(shí)驗(yàn)，證明沙美特羅具有治療胰島素抵抗，抗糖尿病的功效。
[0020] 實(shí)施例1 :
[0021] U3T3-L1細(xì)胞胰島素抵抗模型構(gòu)建：
[0022] (1)將生長狀態(tài)良好的3T3-L1細(xì)胞消化后，以3*104個(gè)/mL細(xì)胞密度接種到6孔 板中，2mL/孔，基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)。36h換液一次，換液兩次后細(xì)胞即可達(dá)到90% -100%細(xì)胞 密度，繼續(xù)用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，使細(xì)胞處于接觸抑制狀態(tài)。
[0023] (2)匯合（接觸抑制）兩天后（DAY0)，換細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基一培養(yǎng)兩天，根據(jù)細(xì)胞 培養(yǎng)基的顏色決定是否換液，一般24-36h換一次培養(yǎng)液。
[0024](3)誘導(dǎo)培養(yǎng)基一培養(yǎng)兩天后（DAY2)，換誘導(dǎo)培養(yǎng)基二，培養(yǎng)兩天根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng) 基顏色決定是否換液，一般24-36h換一次培養(yǎng)液，換液時(shí)一定要緩慢、輕柔避免出現(xiàn)細(xì)胞 漂浮現(xiàn)象。
[0025](4)誘導(dǎo)培養(yǎng)基二培養(yǎng)兩天后（DAY4)，換回基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，36_48h換一次培養(yǎng) 液，換液時(shí)一定要緩慢、輕柔避免出現(xiàn)細(xì)胞漂浮現(xiàn)象，一般培養(yǎng)4-5天左右（DAY8)，即完成 細(xì)胞誘導(dǎo)分化。
[0026] 2、胰島素抵抗3T3-L1細(xì)胞模型染色鑒定：
[0027] (1)固定：將誘導(dǎo)完成的3T3-L1細(xì)胞6孔板中細(xì)胞培養(yǎng)液緩緩吸出，0.OlMPBS緩 慢清洗兩遍后加入1%多聚甲醛細(xì)胞固定液，固定15min。
[0028] (2)染色：吸出1 %多聚甲醛細(xì)胞固定液，0.0 lMPBS緩慢清洗兩遍，加入油紅0染 色劑2mL染色20min。
[0029] (3)沖洗：吸出染色劑，超純水沖洗三次，鏡檢觀察細(xì)胞狀態(tài)拍照記錄。
[0030] 3、沙美特羅作用于3T3-L1胰島素抵抗細(xì)胞模型：
[0031] (1)將誘導(dǎo)分化建模成功的3T3-L1細(xì)胞分為模型組、溶劑對照組、羅格列 酮0. 5nmol/L濃度組、羅格列酮I.Onmol/L濃度組、羅格列酮I. 5nmol/L濃度組、藥物 0. 5nmol/L濃度組、藥物I.Onmol/L濃度組、藥物I. 5nmol/L濃度組、藥物2.Onmol/L濃度 組、藥物2. 5nmol/L濃度組，與未進(jìn)行誘導(dǎo)分化的正常組一共分為11組，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。
[0032] (2)將陽性藥物及794ap儲存液溶解后，用液體細(xì)胞培養(yǎng)基按照上述分組的濃度 稀釋至特定濃度，溶劑對照組加入對應(yīng)體積〇. 5 %DMS0,正常組、模型組則加入對應(yīng)體積液 體細(xì)胞培養(yǎng)基。所有實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用基礎(chǔ)培養(yǎng)基置于二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0033] (3)細(xì)胞培養(yǎng)12h、24h、36h時(shí)分別吸正常組細(xì)胞培養(yǎng)基用葡萄糖測定試劑盒進(jìn)行 葡萄糖含量測定并記錄。
[0034] (4)在葡萄糖消耗量最高峰的培養(yǎng)時(shí)刻分別吸取不同組細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行葡萄糖含 量測定并記錄。
[0035] (5)以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，將記錄的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
[0036]根據(jù)圖1沙美特羅對胰島素抵抗3T3-L1細(xì)胞模型葡萄糖消耗量影響柱狀圖，可以 看出：可知沙美特羅最優(yōu)藥物濃度可以很好地促進(jìn)胰島素抵抗模的細(xì)胞正常分解葡萄糖， 且與陽性藥物羅格列酮之間已不存在差異性。
[0037] 實(shí)施例2:
[0038] 1、SD大鼠二型糖尿病模型的構(gòu)建：
[0039] (1) 80只SPF級別的雄性SD大鼠，體重為120±20克，基礎(chǔ)大鼠鼠糧試喂養(yǎng)3天 后，隨機(jī)挑選出7只作為模型對照組，仍舊飼喂基礎(chǔ)鼠糧，其它的大鼠開始飼喂高糖高脂鼠 糧，所有大鼠均自由飲用自來水。每天更換飲水，每兩天清理糞便，每三天稱量一次體重并 記錄。
[0040] (2)飼喂兩周后，斷食不斷水，空腹IOh后尾靜脈采血針取血，測定大鼠血糖，并記 錄結(jié)果。此后每周測定一次空腹血糖，仍每三天測定并記錄體重。
[0041] (3)飼喂6周后，模型組大鼠斷食不斷水空腹14h后按照25mg/kg的劑量腹腔注射 鏈脲佐菌素（STZ)注射液。
[0042] (4)注射STZ三天后，斷食不斷水空腹IOh后測定大鼠血糖，如此測定兩次后若血 糖均高于11.lmmol/L則認(rèn)定SD大鼠II型糖尿病模型構(gòu)建成功。
[0043] 2、沙美特羅作用于二型糖尿病SD大鼠模型
[0044] (1)分組：將構(gòu)建成功的II型糖尿病模型大鼠按照血糖由高到低一條龍的分組方 式分成7組，依次為模型組、陽性組、lmg/kg藥物濃度組、3mg/kg藥物濃度組、5mg/kg藥物濃 度組、7mg/kg藥物濃度組、溶劑對照組，與原來正常組一起一共分成8