一種用于治療黑色素瘤的藥物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于治療黑色素瘤的藥物及其制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 姜黃素（Curcumin，簡(jiǎn)稱Cur)，化學(xué)名為（E,E)-l, 7-二（4-羥基-5-甲氧基）苯 基-1, 6-庚二稀-3, 5-二酮，分子式為C21H20O6，分子量為368. 37g/mol。
[0003] 姜黃素是從姜黃的根、莖部分提取出來的一種活性成分，廣泛存在于食品和醫(yī)藥 領(lǐng)域。在食品中常作為一種香料、著色劑、食品抗氧化劑，在醫(yī)藥領(lǐng)域中作為一種潛在的降 血糖和抗腫瘤藥物。其外觀為橙黃色粉末，物理性質(zhì)表現(xiàn)為熔點(diǎn)183°C，難溶于水和乙醚， 但易溶于乙醇、二甲亞砜（DMSO)和丙酮等有機(jī)溶劑。研究表明，姜黃素具有廣譜的抗氧化、 抗炎、抗細(xì)胞增殖、抗血管生成和抗腫瘤活性等諸多生物活性。然而其具有如下缺陷：水溶 性低使得其吸收速率低；在體內(nèi)代謝快導(dǎo)致生物利用率低，從而影響了它在臨床上的應(yīng)用。 為了提高其生物利用度，目前常用的方法有制備各種制劑如納米粒子、脂質(zhì)體、微球和姜黃 素衍生物等。
[0004] 黑色素瘤由于其傳播速率快和致死率高，因而是一種最致命的皮膚癌。據(jù)報(bào)道，在 2000年全世界有47, 700例黑色素瘤病例發(fā)生，其中，在美國(guó)新發(fā)病例20, 000~40, 000例， 其中每年死亡病例大約7, 700例。這給美國(guó)和全世界帶來了沉重的公共健康壓力。然而， 到目前為止，由于耐藥性問題導(dǎo)致目前仍缺乏有效的方法來治療這類疾病，因此，迫切需要 開發(fā)一種新的藥物來克服其耐藥性治療黑色素瘤。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種用于治療黑色素瘤 的藥物。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述用于治療黑色素瘤的藥物的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種用于治療黑色素瘤的藥物，由活性組 分組成或是由活性成分和載體組成；其中，活性成分為姜黃素與右旋龍腦。
[0008] 所述的姜黃素與所述的右旋龍腦按質(zhì)量比73674~294696 :400000配比；優(yōu)選按 質(zhì)量比73674 :400000配比。
[0009] 所述的載體是用于將所述的用于治療黑色素瘤的藥物制備成不同劑型的藥物輔 料。
[0010] 所述的用于治療黑色素瘤的藥物的劑型包括緩釋片劑、顆粒劑和凝膠劑。
[0011] 所述的用于治療黑色素瘤的藥物的制備方法，包括如下步驟：按劑型不同，將右旋 龍腦、姜黃素與載體混合，按不同劑型的制備方法制備得到；對(duì)于劑型為緩釋片劑時(shí)，制備 原則是先釋放右旋龍腦，再釋放姜黃素，更為有利于姜黃素的吸收和利用。
[0012] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：本發(fā)明提供的藥物能有效的治療 惡性黑色素瘤，且右旋龍腦和姜黃素聯(lián)合用藥對(duì)人體正常細(xì)胞毒性低，基本無明顯影響。
【附圖說明】
[0013] 圖1是不同濃度的姜黃素（Cur)對(duì)A375細(xì)胞活存率的變化結(jié)果圖；
[0014] 其中，"表示未添加，" + "表示添加。
[0015] 圖2是不同處理組對(duì)細(xì)胞內(nèi)姜黃素含量的影響結(jié)果圖；
[0016] 其中：對(duì)照組表示不添加NB或Cur處理，NB組表示添加40yg/mlNB處理，Cur 組表示添加20yMCur處理，NB+Cur組表示先添加40yg/mlNB處理12h后添加20yMCur 處理。
[0017] 圖3是不同處理組誘個(gè)導(dǎo)A375細(xì)胞內(nèi)SubG-I含量的變化結(jié)果圖；
[0018] 其中，"表示未添加，" + "表示添加。
[0019] 圖4是不同處理組激活A(yù)375細(xì)胞內(nèi)Caspase3/8/9的檢測(cè)結(jié)果圖；
[0020] 其中，對(duì)照組表示不添加NB或Cur處理，NB組表示添加40yg/mlNB處理，Cur組 表示添加20yMCur處理，NB+Cur組表示先添加40yg/mlNB處理12h后添加20yMCur 處理。
[0021] 圖5是不同處理組誘導(dǎo)A375細(xì)胞內(nèi)ROS含量的檢測(cè)結(jié)果圖；
[0022] 其中，對(duì)照組表示不添加NB或Cur處理，NB組表示添加40yg/mlNB處理，Cur組 表示添加20yMCur處理，NB+Cur組表示先添加40yg/mlNB處理12h后添加20yMCur 處理。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0024] 實(shí)施例1
[0025] 本實(shí)施例的右旋龍腦（英文名為naturalborneol，CAS登錄號(hào)為464-43-7,分子 式為CiqH17OH,分子量為154. 24)濃度為：40yg/ml，姜黃素濃度為20yM。
[0026] 1.體外抗黑色素瘤活性檢測(cè)
[0027] ⑴實(shí)驗(yàn)材料
[0028] 本實(shí)驗(yàn)中所用的惡性黑色素瘤細(xì)胞A375購(gòu)自于美國(guó)ATCC;姜黃素，購(gòu)于Sigma公 司；右旋龍腦，購(gòu)于中國(guó)藥品與生物制品檢定所；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT)粉末及二甲基亞砜 (DMSO)，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)液及胰酶，購(gòu)于美國(guó)Invitrogen(Carlsbad,CA)公 司；96孔板，購(gòu)于美國(guó)Corning公司。
[0029] (2)實(shí)驗(yàn)方法
[0030]將A375細(xì)胞培養(yǎng)于含體積百分比10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)3天 后，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和細(xì)胞密度，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到80%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。將胰酶（常規(guī) 操作，工作液濃度為〇. 25 %，下同）消化下后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，1000 rpm離心3min 后棄去上清，加含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基3ml，槍吸打10次以上，務(wù)必使細(xì)胞 重懸均勻，取10y1細(xì)胞混懸液臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)活細(xì)胞數(shù)后用新鮮培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為 I. 8X104cells/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100yI;24h后，一組不加任何藥物，一組只 加40yg/ml右旋龍腦lOOyl，一組只加入20yM姜黃素lOOyl，另一組先加40yg/ml右 旋龍腦50y1處理12h再加20yM姜黃素50y1。72h之后，在顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞的生 長(zhǎng)狀態(tài)。然后每孔加入MTT(5mg/ml) 20y1，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。4h后小心吸去孔內(nèi) 的上清液。之后每孔加入150y1的DMS0,震蕩lOmin，490nm測(cè)吸光值。計(jì)算細(xì)胞存活率， 細(xì)胞存活率=OD實(shí)驗(yàn)/OD對(duì)照X100%。母頭驗(yàn)重見二次。
[0031] (3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
[0032] 如圖1所示，相比單獨(dú)Cur處理，NB與Cur聯(lián)合處理之后，細(xì)胞存活率從 38. 70 ±2. 19 %下降到33. 83 ±3. 71%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NB能提高姜黃素（Cur)抑制A375 惡性黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
[0033] 2.A375細(xì)胞內(nèi)姜黃素的含量檢測(cè)
[0034] (1)實(shí)驗(yàn)材料
[0035] 含 1 % (v/v)TritionX-100 的NaOH溶液（NaOH的濃度為 0?lmol/L)，簡(jiǎn)稱細(xì)胞裂 解液。
[0036] (2)實(shí)驗(yàn)方法
[0037] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，計(jì)數(shù)，以8XIO4個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔 培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中（37°C，5%C02)培養(yǎng)24h后。分別加入40μg/mlNB、20yMCur以 及40yg/mlNB+20yMCur(該組為先用NB處理12h后再加入Cur)處理0. 5h、lh、2h和4h 后，抽去培養(yǎng)基，加入ImLPBS(0. 01M、pH7. 2,下同）清洗細(xì)胞3遍除去細(xì)胞外的右旋龍腦 和姜黃素，然后加入200yL細(xì)胞裂解液，振蕩IOmin后，在熒光酶標(biāo)儀下進(jìn)行姜黃素含量的 測(cè)定。其中，激發(fā)波長(zhǎng)為425nm，發(fā)射波長(zhǎng)為545nm。進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
[0038] (3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
[0039] 如圖2所示，對(duì)比空白對(duì)照組，NB組處理后其細(xì)胞內(nèi)姜黃素含量無明顯變化，可是 NB+Cur組卻顯著提高了細(xì)胞內(nèi)Cur的含量并呈時(shí)間依賴性。在0. 5、l、2、4h后，NB+Cur組 中Cur的含量分別從對(duì)照組的2. 57提高到3. 23、3. 47、3. 99和4. 36 (10Vg)，比Cur組的 3. 21、3.40、3. 55 和 3. 86 (10Vg)分別提高了L01、L02、L12 和L13 倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 右旋龍腦顯著的提高了姜黃素在細(xì)胞內(nèi)的吸收。
[0040] 3.流式細(xì)胞分析
[0041] (1)實(shí)驗(yàn)材料
[0042] PI染料（濃度是 50yg/ml)
[0043] (2)實(shí)驗(yàn)方法
[0044] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，計(jì)數(shù)，以2XIO4個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔 板，置于培養(yǎng)箱中（37°C，5%C02)培養(yǎng)24h后。分別加入40μg/mlNB、20yMCur、以及 40yg/mlNB+20yMCur(該組為先用NB處理12h后再加入Cur)處理72h后，抽去培養(yǎng)基， 加入ImLPBS清洗細(xì)胞3遍除去細(xì)胞外的右旋龍腦和姜黃素，然后加入胰酶消化，1500rpm 離心5min，收集細(xì)胞，加入-20°C預(yù)冷的70%乙醇lmL，混勾，4°C過夜固定，次日，1500rpm離 心5min，去上清，用PBS洗2遍，加500yIPI染液，混勻后避光靜置20min后，過300目篩， 上機(jī)檢測(cè)。每個(gè)樣品至少分析10000個(gè)細(xì)胞。
[0045] (3)結(jié)果與分析
[0046] 如圖3所示，相比對(duì)照組而言，NB組內(nèi)并沒有出現(xiàn)明顯的凋亡細(xì)胞峰，其SubG-I僅 為2. 5 %，Cur組處理后凋亡細(xì)胞峰從對(duì)照組的I. 4%提高到27. 5 %，而相比Cur組，NB+Cur組中的細(xì)胞凋亡峰從27. 5%提高到75%，流式細(xì)胞結(jié)果表明，加入NB后，能顯著提高Cur 誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的subG-1峰升高，表明NB和Cur聯(lián)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
[0047] 4.Caspase(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶）活性檢測(cè)
[0048] ⑴實(shí)驗(yàn)材料
[0049] Caspase底物Caspase3、Caspase8、Caspase9
[0050] (2)實(shí)驗(yàn)方法
[0051] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，計(jì)數(shù)，以IOXIO4個(gè)細(xì)胞/孔接種于IOcm皿中， 置于培養(yǎng)箱中（37°C，5%C02)培養(yǎng)24h后。分別加入40μg/mlNB、20yMCur以及40yg/ mlNB+20yMCur處理72h，然后收集細(xì)胞，加入一定量的RIPA細(xì)胞裂解液（RIPA裂解液由 50mMTris-HCl(pH7. 4)、150mMNaCl, 1 %NonidetP-40 和 0? 1 %SDS配制而成，添加量視 細(xì)胞數(shù)目而定），冰上孵育Ih后，在IlOOOg下離心30min，取上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中。 然后采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。然后分別移取Caspase底物（Caspase3、8、9)，以每孔 4y1加入96孔熒光板中，再加入100yg不同處理后獲得的細(xì)胞蛋白，用PBS補(bǔ)至總體積 160y1/孔，置于37°C避光培養(yǎng)lh，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)為380nm，發(fā) 射波長(zhǎng)為460nm)，每個(gè)樣品平行三次。
[0052] (3)結(jié)果與分析
[0053] 如圖4所示，NB組或Cur組降低了Caspase9的活性和輕微提高了Caspase3和 Caspase8活性，而與NB或Cur組比較，NB+Cur組合顯著提高了Caspase3、8活性和輕微提 高了Caspase9的活性，表明NB能顯著提高Cur激活Caspase3、8、9的活性。