pedinophyllol C在制備治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化合物PedinophyllolC的新用途，具體涉及PedinophyllolC在制 備治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] NaLiu等人首次分離純化出化合物PedinophyllolC，并將成果發(fā)表在著名天 然產(chǎn)物雜志JournalofNaturalProduct上(HighlyOxygenatedent-Pimarane-Type DiterpenoidsfromtheChineseLiverwortPedinophylluminterruptumand TheirAllelopathicActivities，J.Nat.Prod.，2013, 76,1647-1653)。
[0003]目前尚未有該化合物關(guān)于黑色素瘤的活性報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種PedinophyllolC的醫(yī)藥用途。
[0005] 上述目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006]PedinophyllolC在制備治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用，所述PedinophyllolC化學(xué) 結(jié)構(gòu)式如下，
[0007]

【附圖說明】
[0008] 圖1 :BrdU免疫熒光檢測細(xì)胞增殖結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容。
[0010] 實(shí)施例1:PedinophyllolC的分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0011] PedinophyllolC的制備方法同文獻(xiàn)報(bào)道的制備方法（HighlyOxygenated ent-Pimarane-TypeDiterpenoidsfromtheChineseLiverwortPedinophyllum interruptumandTheirAllelopathicActivities?J.Nat.Prod. ?2013?76?1647-1653) 〇
[0012] 結(jié)構(gòu)確證：無色針狀（甲醇），熔點(diǎn)151_153°C。分子式為C2QH3Q03，不飽和度為6。 核磁共振氫譜數(shù)據(jù)sH (ppm，DMS0-d6, 500MHz) :H-1 (4. 06,br，s)，H-2 (1. 97,m)，H-2 (1. 53，m)，H-3(l. 81，m)，H-3(l. 30,m)，H-5(2. 78,dd，J= 5. 8,12. 6)，H-6(2. 64,dd，J= 5. 8， 18.6)，H-6 (2.31，dd，J= 12. 6,18.6)，H-ll(1.96,m)，H-ll(1.81，m)，H-12 (1.65,m)， H-12(l. 81，m)，H-14(6. 61，s)，H-15(5. 70,dd，J= 10. 5,17. 5)，H-16(5. 01，d，J= 10. 5)， H-16(4. 80,d，J= 17. 5)，H-17(l. 23,s)，H-18(l. 00,s)，H-19(l. 01，s)，H-20(0. 90,s); 核磁共振碳譜數(shù)據(jù)Sc (ppm，DMS0-d6,150Hz) :73. 1 (CH，1-C)，27. 1 (CH2, 2-C)，33. 5 (CH2， 3-C)，29. 7 (C，4-C)，36. 1 (CH，5-C)，37. 0 (CH2, 6-C)，201. 1 (C，7-C)，137. 9 (C，8-C)，76. 4 (C， 9-C)，42. 3 (C，10-C)，26. 2 (CH2,11-C)，30. 8 (CH2,12-C)，39. 1 (C，13-C)，143. 9 (CH，14-C)， 144. 3(CH，15-C)，113. 5(CH2，16-C)，28. 3(CH3，17-C)，32. 5(CH3，18-C)，21. 1(CH3，19-C)， 17. 4(CH3,20-C)。結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，因此可以確定本發(fā)明制備的化合物即為 文獻(xiàn)報(bào)道的PedinophyllolC〇
[0013] 實(shí)施例2:PedinophyllolC的藥理作用試驗(yàn)
[0014] 一、材料和儀器
[0015] 人A375黑色素瘤細(xì)胞株由第三軍醫(yī)大學(xué)贈(zèng)。PedinophyllolC自制，制備方法 見實(shí)施例1，HPLC歸一化純度大于98%。DMEM培養(yǎng)基、0. 25%胰酶購自美國Gibco公司。 MTT(3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽；四甲基偶氮唑藍(lán)）、DMS0 (二甲基亞 砜）、BrdU購自美國Sigma公司。鼠抗BrdU多克隆抗體購自美國ABcam公司。山羊抗鼠 二抗購自美國Cellsignaling公司。AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國 Promega公司。
[0016] 恒溫C02培養(yǎng)箱，普通冰箱，-80度冰箱均為美國Forma公司產(chǎn)品。超凈工作臺(tái) (中國蘇州凈化工程公司）。倒置顯微鏡，倒置熒光顯微鏡（Olympus公司）。電熱恒溫培 養(yǎng)箱（中國上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。自動(dòng)酶標(biāo)儀（日本W(wǎng)ako公司）。紫外分光光度儀（美 國Beckman公司）。J6-HC高速離心機(jī)（美國Beckman公司）。低溫微量離心機(jī)（德國 Eppendorf公司）。振蕩搖床（美國Forma公司）。
[0017] 二、試驗(yàn)方法
[0018] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0019] 1.1細(xì)胞復(fù)蘇
[0020] 將凍存在液氮罐中的A375黑色素瘤細(xì)胞取出，迅速放入37°C的溫水中，輕輕搖動(dòng) 使其盡快融化（大約lmin)。然后吸出細(xì)胞懸液，加入到已加有2mL培養(yǎng)基的離心管中，輕 輕吹打混勻，800r/min，離心5min，棄去上層培養(yǎng)基。用含有10 %FBS和1 %的青霉G/鏈霉 素的DMEM培養(yǎng)基8mL制成細(xì)胞懸液后，接種至10cm培養(yǎng)盤中。然后置于5%C02、37°C恒 溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0021] 1.2細(xì)胞傳代
[0022] 顯微鏡下觀察細(xì)胞融合度達(dá)80% -90%時(shí)即可進(jìn)行傳代。先用2mLPBS洗滌細(xì)胞 2次，然后加入0. 25 %的胰酶lmL。輕輕水平搖動(dòng)培養(yǎng)盤，使消化液能覆蓋細(xì)胞的表面，然后 置于37°C溫箱中消化約lmin。置于顯微鏡下見細(xì)胞變圓回縮，然后迅速加入lmL含有FBS 的培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打至細(xì)胞分散均勻，然后根據(jù)細(xì)胞密度按照1:2或1:3傳代，重 新接種于新的培養(yǎng)盤中，置于5%C02、37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0023] 1. 3細(xì)胞凍存
[0024] 取1盤處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化并收集到離心管中，1OOOr/min離心 5min，棄上清。然后加入lmL凍存液，輕輕吹散細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液加入到1. 5mL 的凍存管中。在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，保存時(shí)間，保存者的姓名。先將凍存管放入4°C 冰箱，放置約30min。接著置于-20°C冰箱，放置約2h。然后放于-80°C超低溫冰箱中放置 過夜。第二天將凍存的細(xì)胞置于液氮罐中長期保存。
[0025] 2、細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線
[0026] (1)取對(duì)數(shù)生長期A375黑色素瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2X104/mL。
[0027] (2)將細(xì)胞懸液接種于12孔板中，1. 5mL/孔。
[0028] (3) 12h后，待細(xì)胞貼壁，換lmL無血清DMEM培養(yǎng)基，并分別用5ymol/L PedinophyllolC和DMS0 (對(duì)于DMS0 稀釋的PedinophyllolC，控制DMS0 濃度在 1/1000 以下，確保對(duì)細(xì)胞無害）處理，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)平行孔，置于5%C02、37°C恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn) 行培養(yǎng)。
[0029] (4)分別于他、2411、4811、7211、9611終止培養(yǎng)，收集各組細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶 消化，離心，重懸。
[0030] (5)細(xì)胞計(jì)數(shù)：吸取細(xì)胞混懸液10iiL，加入等體積的臺(tái)酚藍(lán)區(qū)分活細(xì)胞，吸取 10yL混合液輕輕加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板凹槽中，保證無空隙和氣泡。倒置顯微鏡下，計(jì)數(shù)周邊四 個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，代入公式：原細(xì)胞混懸液濃度（細(xì)胞數(shù)/mL) = (4個(gè)大方格的細(xì)胞數(shù) /4)X104X稀釋倍數(shù)。
[0031] (6)計(jì)算活細(xì)胞數(shù)目，繪制細(xì)胞生長曲線。
[0032]3、MTT法檢測細(xì)胞增殖
[0033] (1)取對(duì)數(shù)生長期的A375細(xì)胞，消化，離心，重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液中細(xì)胞的密 度為 2X104/mL。
[0034] (2)將各組細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，200yL每孔，每組細(xì)胞3個(gè)平行孔，同 時(shí)設(shè)空白對(duì)照孔（只加入培養(yǎng)基）。
[0035] (3) 12h待細(xì)胞貼壁后，換200yL無血清DMEM培養(yǎng)基，并分別用5ymol/L PedinophyllolC和DMS0 處理。
[0036] (4)分別于0、1、2、3、4天終止培養(yǎng)。
[0037] (5)向每孔加入濃度為5mg/mL的四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT) 20yL繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4h。
[0038] (6)吸棄各小孔內(nèi)的培養(yǎng)基，加入200yLDMS0,在微振蕩器上振蕩10min，使結(jié)晶 物充分溶解。
[0039] (7)以空白對(duì)照孔調(diào)零，采用自動(dòng)酶標(biāo)儀測定各孔570nm處的吸光光度值（0D 值），以對(duì)應(yīng)的0D值表示細(xì)胞增殖能力，各組取3個(gè)平行孔的平均值，以時(shí)間為橫軸，以各吸 光度值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。
[0040] 4、BrdU免疫熒光檢測細(xì)胞增殖
[0041] (1)準(zhǔn)備爬片：將爬片放入75%酒精中浸泡24h消毒處理。
[0042] (2)將無菌爬片放置24孔培養(yǎng)板內(nèi)，取對(duì)數(shù)生長期的A375黑色素瘤細(xì)胞，消化，離 心，制成細(xì)胞懸液，2X104cell/孔，接種于放有爬片的孔中。
[0043] (3) 12h待細(xì)胞貼壁后，換lmL無血清DMEM培養(yǎng)基，并分別用5ymol/ LPedinophyllolC和DMS0 處理。
[0044] (4)72h后，在培養(yǎng)基中加入 10y1BrdU(lmg/mL)，37°C培養(yǎng)lh。
[0045] (5)取出24孔板，以冷PBS洗5minX2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫30min。
[0046] (6)PBS洗 5minX3 次。
[0047] (7) 2mol/LHCl處理，室溫lOmin后，37°C20min〇
[0048] (8)細(xì)胞用 1%TritonX-100 通透處理，洗 5minX3 次。
[0049] (9) 10%山羊血清封閉，室溫，lh。
[0050](10)加入BrdU單克隆抗體（1:300 稀釋），37°C1. 5h。
[0051] (11)1\卩851'搖洗5111111\3次。
[0052](12)加BrdU二抗（1:300)，室溫避光lh后，IXPBST洗 3 次。
[0053] (13)DAPI染色液染細(xì)胞核15min。
[0054] (14)PBS洗 5minX3 次。
[0055] (15)加1滴抗焚光淬滅封片液，中性樹膠封片，焚光顯微鏡下觀察、照相。
[0056] 5、統(tǒng)計(jì)分析
[0057] 應(yīng)用SPSS17. 0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及單因素方差分析進(jìn)行數(shù) 據(jù)分析，數(shù)據(jù)用X±S表示，P〈0. 05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0058] 三、結(jié)果及結(jié)論
[0059] 細(xì)胞形態(tài)觀察及計(jì)數(shù)顯示，與DMS0對(duì)照組比，PedinophyllolC處理A375細(xì)胞 24h、48h、72h后，活細(xì)胞數(shù)顯著降低達(dá)44. 5%。結(jié)果見表1(與對(duì)照組比*P〈0. 05，**P〈0. 01， 下同）。
[0060]MTT結(jié)果顯示，PedinophyllolC能顯著抑制A375細(xì)胞增殖，0D值呈濃度（5ymol/ L、10ymol/L、20ymol/L)依賴性下降達(dá)27.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表2〇
[0061] 通過BrdU免疫焚光染色進(jìn)一步證實(shí)PedinophyllolC能抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖， 5ymol/LPedinophyllolC處理A375細(xì)胞3天后，與對(duì)照（26. 07±2. 59%)相比，實(shí)驗(yàn)組 BrdU陽性細(xì)胞百分比（7. 55 ±2. 76% )顯著降低（P= 0. 000)。結(jié)果見圖1 (#P〈0. 01)。
[0062] 本實(shí)驗(yàn)檢測了PedinophyllolC對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響，細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT分 析結(jié)果均證明PedinophyllolC可顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞生長，且細(xì)胞數(shù)與Pedinophyllol C濃度呈依賴性下降。BrdU免疫熒光染色也顯示PedinophyllolC處理后BrdU陽性 細(xì)胞百分比顯著低于對(duì)照組，說明PedinophyllolC可抑制A375黑色素瘤細(xì)胞增殖。 PedinophyllolC可能是黑色素瘤的有效靶向治療藥物。
[0063] 表1PedinophyllolC劑量依賴性抑制A375細(xì)胞增殖（細(xì)胞計(jì)數(shù)法，單位：X104/ mL) (X±S,n= 3)
[0064]
[0065]表 2PedinophyllolC劑量依賴性抑制A375 細(xì)胞增殖（MTT法，0D570) ( 5r±S，n =3)
[0066]
【主權(quán)項(xiàng)】
I. Pedinophyllol C在制備治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用，所述Pedinophyllol C化學(xué)結(jié) 構(gòu)式如下，
【專利摘要】本發(fā)明公開了Pedinophyllol？C在制備治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用，屬于藥物領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)檢測了Pedinophyllol？C對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響，細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT分析結(jié)果均證明Pedinophyllol？C可顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞生長，且細(xì)胞數(shù)與Pedinophyllol？C濃度呈依賴性下降。BrdU免疫熒光染色也顯示Pedinophyllol？C處理后BrdU陽性細(xì)胞百分比顯著低于對(duì)照組，說明Pedinophyllol？C可抑制A375黑色素瘤細(xì)胞增殖。Pedinophyllol？C可能是黑色素瘤的有效靶向治療藥物。
【IPC分類】A61K31/122, A61P35/00
【公開號(hào)】CN105055382
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510578311
【發(fā)明人】趙東順
【申請(qǐng)人】趙東順
【公開日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年9月13日