，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號 11400700059785 ;人肺癌A549細胞株，來源于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫 (CAS )，本實驗室液氮冷凍保存，備用。
[0050] 試驗方法： (1)動物模型制備：收取對數(shù)生長期的A549細胞，細胞計數(shù)后裝入50 mL離心管中，重 懸于50% PBS緩沖液（pH 7. 4)及50% Matrigel中，調(diào)整細胞濃度至8 X IO7細胞/mL，吹打 細胞，使其分散均勻。吸取細胞懸液，注射到裸鼠前右側(cè)乳腺脂肪墊，每只動物接種150 μ L (I. 2Χ IO7細胞/只），建立Α549裸鼠移植瘤模型。
[0051] (2)動物分組、給藥：腫瘤體積在200 mm3左右的荷瘤鼠 84只，采用隨機區(qū)組法分 為14組(每組6只）。1~7組動物經(jīng)尾靜脈注射給予二甲氧基姜黃素膠束，8~14組動物經(jīng)尾 靜脈注射給予二甲氧基姜黃素 DMSO溶液，給藥劑量以二甲氧基姜黃素計均為50 mg/kg。
[0052] (3)組織樣本采集、處理與測試：各組動物給藥后，按不同的時間點分別采集血漿 及腫瘤、心、肝、脾、肺、腎、腦等主要組織器官。組織采集后用生理鹽水沖洗干凈，稱重，加適 量5%葡萄糖溶液進行勻漿。以雙脫甲氧基姜黃素為內(nèi)標、乙酸乙酯為溶劑，液-液萃取法 從血漿和組織勻漿基質(zhì)中提取二甲氧基姜黃素和內(nèi)標，LC-MS/MS法定量測定各組織樣本中 二甲氧基姜黃素的藥物濃度。
[0053] 結(jié)果與結(jié)論：荷A549腫瘤細胞的雌性Balb/C裸小鼠經(jīng)尾靜脈注射分別給予等劑 量（50 mg/kg)二甲氧基姜黃素聚合物膠束和DMSO溶液制劑后藥物的組織分布見附圖6。 試驗結(jié)果顯示，與DMSO溶解所得的溶液制劑相比，聚合物膠束制劑顯著改變了二甲氧基姜 黃在體內(nèi)的組織分布特征，表現(xiàn)出明顯的腫瘤和心臟組織靶向分布。盡管兩種制劑在給藥 后15 min ~ 3h內(nèi)肝、脾、肺、腎和腦組織的藥物分布及其變化趨勢相似，但聚合物膠束組 動物在心臟及腫瘤組織中的藥物濃度顯著高于DMSO溶液組，且消除顯著變緩，從而使得在 給藥后相對較長時間內(nèi)維持較高的組織藥物濃度水平。結(jié)果提示，本發(fā)明所提供的二甲氧 基姜黃素聚合物膠束具有明顯的腫瘤及心臟組織靶向分布特征，可通過EPR效應(yīng)實現(xiàn)對腫 瘤組織的被動靶向，因此，適用于心臟系統(tǒng)相關(guān)疾病以及腫瘤的預防和臨床治療，特別是與 腫瘤放療或化療藥物聯(lián)用，對腫瘤臨床放療及化療所致心臟毒性等機體損傷進行預防和治 療，可能在增效的同時實現(xiàn)有效減毒，從而提高腫瘤臨床治療的耐受性和療效。
[0054] 實施例5 二甲氧基姜黃素聚合物膠束對人白血病阿霉素耐藥株K562/ADR細胞 裸鼠移植瘤生長抑制作用試驗 主要試驗材料：二甲氧基姜黃素聚合物膠束凍干制劑和不載藥的空白膠束制劑，按照 實施例3 (1)制得，臨用前加生理鹽水至所需濃度；鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液，上海復旦 張江生物醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品；Balb/C裸小鼠，雌性，5~6周齡，購自北京維通利華實驗 動物技術(shù)有限公司，合格證號11400700059785 ;人白血病阿霉素耐藥株K562/ADR細胞來源 于ATCC細胞庫，本實驗室液氮冷凍保存，備用。
[0055] 試驗方法： (1)荷瘤模型制備：收取對數(shù)生長期的K562/ADR細胞，細胞計數(shù)后裝入50 mL離心管 中，重懸于含50% Matrigel的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞濃度至8 X IO7細胞/mL， 吹打細胞，使其分散均勻。吸取細胞懸液，注射到裸鼠前右側(cè)乳腺脂肪墊，每只動物接種150 μ L (I. 2 X IO7細胞/只），建立裸鼠移植瘤模型。
[0056] (2)動物分組與給藥規(guī)程：至瘤體積達150~200 mm3,將荷瘤動物隨機分為4組， 每組動物數(shù)n=10。其中，I :陰性對照組(空白膠束)、II :鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液組（4 mg/kg)、III :二甲氧基姜黃素聚合物膠束組（50 mg/kg)、IV :鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液（4 mg/kg)+二甲氧基姜黃素聚合物膠束（50 mg/kg)聯(lián)用組。自分組當日起，經(jīng)尾靜脈注射連 續(xù)給藥3周，鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液每3天給藥1次，二甲氧基姜黃素聚合物膠束每天 給藥1次，每次給藥體積均為5 mL/kg。陰性對照組每天1次給予等體積空白膠束溶液。
[0057] (3)觀察指標：給藥期間每3天測量一次體重和瘤體積，于末次給藥24h后處死動 物，剝?nèi)×鼋M織，稱重，以陰性對照組為參照，按下式計算瘤重增長抑制率：TGI= (1 -處理 組平均瘤重/對照組平均瘤重）X 100%。
[0058] 結(jié)果與結(jié)論：鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液組（II組）和二甲氧基姜黃素聚合物膠 束組(III組）的瘤重及TGI分別為695±28 mg、27. 1%和379±24 mg、60. 2%。與陰性對照 組相比，對于阿霉素耐藥瘤株K562/ADR在裸鼠體內(nèi)的增殖，前者幾乎不顯示抑制作用（p > 0. 05)，而40 mg/kg劑量的二甲氧基姜黃素聚合物膠束能顯著延緩腫瘤生長，且在與鹽酸 多柔比星脂質(zhì)體注射液聯(lián)用時（IV組）顯示更強的腫瘤生長抑制作用，該組的瘤重及TGI分 別為268±13 mg、71.8%。體重測量結(jié)果顯示，II組動物在給藥期間的一般狀態(tài)較差，且體 重減輕1〇~15%，表明鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液存在明顯的系統(tǒng)毒性；III組動物體重略有 增加，與空白對照組無顯著差異（P > 0.05) ;IV組動物在給藥4-8 d內(nèi)體重略有減輕，平均 ~7%，但此后至試驗結(jié)束期間，動物體重恢復至與空白對照組基本一致，顯示二甲氧基姜黃 素對鹽酸多柔比星所造成機體損傷具有快速恢復的能力。綜合以上試驗結(jié)果表明，本發(fā)明 所提供的二甲氧基姜黃素聚合物膠束具有顯著的體內(nèi)抑瘤活性，并顯示對鹽酸多柔比星的 協(xié)同增效減毒作用。
【主權(quán)項】
1. 一種二甲氧基姜黃素聚合物膠束，其特征在于：以包括疏水鏈段和親水鏈段的兩親 性嵌段共聚物為基礎(chǔ)載體材料，在水溶液中經(jīng)自組裝制備具有典型核-殼結(jié)構(gòu)的載藥聚合 物膠束，二甲氧基姜黃素被包載于膠束的疏水內(nèi)核中，所得載藥膠束平均粒徑為10 Iim~ 100 nm，多分散系數(shù)〈 0? 1〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的二甲氧基姜黃素聚合物膠束，其特征在于：所述基礎(chǔ)載體材 料為親水嵌段A與疏水嵌段B的重量比為3:7~7:3的AB型兩嵌段共聚物，其親水嵌段 A為數(shù)均分子量在750~5000間的聚乙二醇或聚乙二醇單甲醚，其疏水嵌段B為數(shù)均分子 量在1000~50000間的聚丙交酯、聚乙交酯、聚乙丙交酯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚二氧環(huán)己 酮、或其衍生物中的一種，并可采用疏水性基團進行封端修飾，疏水性基團優(yōu)選BOC-苯丙 氨酸。3. 根據(jù)權(quán)利要求1~2所述的二甲氧基姜黃素聚合物膠束，其特征在于：所述二甲氧基 姜黃素與兩親性嵌段共聚物的重量比為0.5:99. 5 ~ 50:50,優(yōu)選重量比為1:99 ~ 30:70。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3所述的二甲氧基姜黃素聚合物膠束的制備方法，其特征在于，采 用薄膜水化法制備，具體步驟如下： 將二甲氧基姜黃素和嵌段共聚物材料溶解于有機溶劑中； 經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除步驟（1)中的有機溶劑，以形成均勻的藥膜； 于步驟（2)所得藥膜中加入水性溶劑，在一定溫度下水化溶解，得到所述的二甲氧基姜 黃素聚合物膠束。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的二甲氧基姜黃素聚合物膠束的制備方法，其特征在于步驟 (1)中所述有機溶劑選自甲醇、乙醇、異丙醇、叔丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、乙腈、丙 酮、四氫呋喃、二甲基甲酰胺中的至少一種，優(yōu)選使用乙醇，且其用量與二甲氧基姜黃素的 重量比為（0.5~2.0) mL:l mg。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的二甲氧基姜黃素聚合物膠束的制備方法，其特征在于步驟 (3 )中所述水性溶劑為符合醫(yī)藥用途的水或其電解質(zhì)溶液，用量為步驟（1)中有機溶劑用量 的1~5倍（v/v)，在35~60°C下水化溶解藥膜。7. -種二甲氧基姜黃素聚合物膠束載藥系統(tǒng)，其特征在于：包含權(quán)利要求1~6所述 的二甲氧基姜黃素聚合物膠束以及藥學上可接受的藥用輔料。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的二甲氧基姜黃素聚合物膠束載藥系統(tǒng)，其特征在于：添加藥 學上可接受的輔料制成口服固體制劑，用于口服途徑給藥；或者制成凍干粉制劑，用于注射 或口服途徑給藥。9. 根據(jù)權(quán)利要求7~8所述的二甲氧基姜黃素聚合物膠束載藥系統(tǒng)，其特征在于：所述 藥學上可接受的藥用輔料選自凍干保護劑、抗氧劑、金屬離子絡(luò)合劑、等滲調(diào)節(jié)劑、填充劑、 粘合劑、崩解劑、潤滑劑中的至少一種，其用量占整個體系的重量比為〇~99. 9%之間。10. 權(quán)利要求1~9任一所述的二甲氧基姜黃素聚合物膠束載藥系統(tǒng)在制備抗腫瘤、抗 氧化、抗炎、抗菌、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗老年癡呆藥物中的用途， 優(yōu)選與腫瘤放療或化療藥物聯(lián)用，對腫瘤臨床放療和化療所致心臟毒性等機體損傷進行預 防和治療，發(fā)揮增敏、增效、減毒的作用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種二甲氧基姜黃素聚合物膠束及其制備方法、以及該聚合物膠束的注射或口服給藥系統(tǒng)與醫(yī)藥用途。該載藥膠束以兩親性嵌段共聚物作為載體材料，在水溶液中經(jīng)自組裝自發(fā)形成典型的核-殼結(jié)構(gòu)，粒徑分布均勻，二甲氧基姜黃素在水性介質(zhì)中的溶解度和熱力學穩(wěn)定性顯著提高，且有效降低其在體內(nèi)的滲漏、降解和代謝，實現(xiàn)了長循環(huán)和腫瘤組織被動靶向，從而提高藥效和安全性。根據(jù)臨床適應(yīng)癥的具體需要，本發(fā)明所提供的載藥膠束可制成凍干粉等制劑，注射或口服途徑使用，用于抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗老年癡呆等，特別適用于與腫瘤放療或化療藥物聯(lián)用，發(fā)揮增敏、增效、減毒的作用。
【IPC分類】A61P35/00, A61P25/28, A61K47/34, A61K31/12, A61P3/06, A61P39/06, A61P9/10, A61P37/02, A61P31/04, A61K9/107
【公開號】CN105012234
【申請?zhí)枴緾N201510216062
【發(fā)明人】許卉, 劉卉, 劉珂, 江云霞
【申請人】煙臺大學
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年4月30日