用1 %醋酸溶液洗5次，自然晾 干；每孔加入200y1 10mmol/LTris溶液（pH10. 5)，振蕩器上振搖20min使與腫瘤細(xì)胞堿 性氨基酸殘基結(jié)合的SRB溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定540nm波長(zhǎng)處吸光度?？瞻讓?duì)照組和藥物處理 組的吸光度表不為〇D_tMl ，54C^D〇Dsample，5400 其中一塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板不給藥處理，在細(xì)胞 自接種起培養(yǎng)24h后按上述步驟處理，其平均吸光度設(shè)為。本實(shí)施例中以TAM作為 陽(yáng)性對(duì)照，操作步驟與DEX給藥組相同，TAM給藥組的終濃度為1、2、5、10、20、25、30、40、50、 100yM(A549 細(xì)胞系）和 0? 2、2、5、10、15、20、25、50、100yM(H1299 細(xì)胞系）。細(xì)胞存活率 按公式1-1計(jì)算：
[0035] 結(jié)果顯示（圖1、2) :DEX在A549和H1299細(xì)胞中的IC5Q(抑制50%細(xì)胞增殖所需 的藥物濃度）均> 500yM，遠(yuǎn)大于TAM的IC5(I，說(shuō)明DEX對(duì)耐藥性肺癌細(xì)胞體外增殖無(wú)明顯 抑制作用。
[0036] 討論：抗腫瘤藥物的研宄步驟一般為先進(jìn)行體外研宄，再選擇體外藥效較好的藥 物進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)。本實(shí)施例研宄了DEX對(duì)體外肺癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明DEX對(duì)耐藥 性非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體外增殖無(wú)明顯抑制作用。這一試驗(yàn)結(jié)果與后期DEX可顯著抑制體內(nèi) 耐藥性肺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的結(jié)果形成明顯的對(duì)比，說(shuō)明相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明之前無(wú) 法預(yù)料DEX對(duì)耐藥性肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有顯著的抑制作用。
[0037] 實(shí)施例2 :
[0038] DEX對(duì)體內(nèi)非小細(xì)朐肺癌耐藥務(wù)棺瘤樽塑中腫瘤牛長(zhǎng)的抑制作用（DEX單齊1丨量）
[0039] 本實(shí)施例研宄了DEX對(duì)人耐藥性非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞接種的裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制 作用。
[0040] BALB/c裸鼠飼養(yǎng)一周后接種A549細(xì)胞（原發(fā)性耐藥細(xì)胞系）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 八549細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶-0.53臟〇1/160了4溶液消化制備成單細(xì)胞懸液，1，000印111離心 5min，細(xì)胞用PBS洗兩次，用PBS調(diào)整細(xì)胞密度為2X107個(gè)/ml。在無(wú)菌條件下于裸鼠左側(cè) 皮下脂肪墊皮下注射0. 2ml細(xì)胞懸液（約4X106個(gè)細(xì)胞）。用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑 (D_)和短徑U，計(jì)算腫瘤體積V(V=D^XD^2/〗）。
[0041] 將A549細(xì)胞原位接種到20只BALB/c裸鼠乳腺位置，得到異種移植的非小細(xì)胞 肺癌腫瘤模型，當(dāng)裸鼠的平均腫瘤體積約為50mm3時(shí)，隨機(jī)分為4組，每組5只。DEX的給 藥方式為口服灌胃，藥物溶劑為玉米油。給藥方案如下：（1)空白對(duì)照組：每天灌胃玉米油 0. lmL;(2)DEX組：每天灌胃含DEX的玉米油溶液0. lmL，DEX給藥劑量為8mg/kg;(3)埃羅 替尼陽(yáng)性對(duì)照組：每天灌胃含埃羅替尼的4%SBE-0-環(huán)糊精溶液0. lmL，埃羅替尼給藥劑 量為20mg/kg;⑷舒尼替尼陽(yáng)性對(duì)照組：每天灌胃含舒尼替尼的1，2_丙二醇溶液0. lmL， 舒尼替尼給藥劑量為20mg/kg。各組每天給藥前測(cè)定腫瘤體積。
[0042] 結(jié)果顯示（圖3、4) :DEX給藥組腫瘤體積顯著小于空白對(duì)照組和埃羅替尼、舒尼替 尼陽(yáng)性對(duì)照組。
[0043] 討論：A549為具有原發(fā)性耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，小分子靶向藥物埃羅替尼 和舒尼替尼對(duì)其腫瘤大小的抑制作用較小，這也進(jìn)一步證實(shí)了其耐藥特性。DEX給藥組腫瘤 體積顯著小于空白對(duì)照組和小分子靶向藥物給藥組，說(shuō)明DEX對(duì)耐藥性腫瘤具有較好的抑 制作用。
[0044] 實(shí)施例3 :
[0045] DEX對(duì)體內(nèi)非小細(xì)朐肺癌耐藥務(wù)棺瘤樽塑中腫瘤牛長(zhǎng)和轉(zhuǎn)務(wù)的抑制作用（DEX多 齊丨丨量）
[0046] 本實(shí)施例研宄了 DEX對(duì)入耐藥性非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞接種的裸鼠腫瘤生長(zhǎng)和早期 轉(zhuǎn)移的抑制作用。
[0047] Nu/nu裸鼠飼養(yǎng)一周后接種A549細(xì)胞（原發(fā)性耐藥細(xì)胞系）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 八549細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶-0.53臟〇1/160了4溶液消化制備成單細(xì)胞懸液，1，000印111離心 5min，細(xì)胞用PBS洗兩次，用PBS調(diào)整細(xì)胞密度為2X107個(gè)/ml。在無(wú)菌條件下于裸鼠左側(cè) 皮下脂肪墊皮下注射0. 2ml細(xì)胞懸液（約4X106個(gè)細(xì)胞）。用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑 (D_)和短徑U，計(jì)算腫瘤體積V(V=D^XD^2/〗）。
[0048] 將A549細(xì)胞原位接種到30只Nu/nu裸鼠乳腺位置，得到異種移植的非小細(xì)胞肺 癌腫瘤模型，當(dāng)裸鼠的平均腫瘤體積約為50mm3時(shí)，隨機(jī)分為6組，每組5只。DEX的給藥方 式為口服灌胃，藥物溶劑為10% (w/v)羥丙基-0-環(huán)糊精。給藥方案如下：（1)空白對(duì)照 組：每天灌胃10 % (w/v)羥丙基-0 -環(huán)糊精0.lmL; (2)DEX0. 5mg/kg組：每天灌胃含DEX 的10% (w/v)羥丙基-0 -環(huán)糊精溶液0?lmL，DEX給藥劑量為0? 5mg/kg; (3)DEX2mg/kg 組：每天灌胃含DEX的10 % (w/v)羥丙基--環(huán)糊精溶液0.lmL，DEX給藥劑量為2mg/kg; (4)DEX4mg/kg組：每天灌胃含DEX的10 % (w/v)羥丙基-0 -環(huán)糊精溶液0?lmL，DEX給 藥劑量為4mg/kg; (5)TAM陽(yáng)性對(duì)照組：每天灌胃含TAM的10% (w/v)羥丙基-環(huán)糊精 溶液0.lmL，TAM給藥劑量為50mg/kg; (6)GEM陽(yáng)性對(duì)照組：每三天尾靜脈注射含GEM的生 理鹽水溶液〇.lmL，GEM給藥劑量為20mg/kgq3d。各組每天給藥前測(cè)定腫瘤體積及裸鼠體 重；給藥最后1天，測(cè)定（1)、（3)、（4)、（5)、（6)組裸鼠血象指標(biāo)；最后1天給藥后，處死裸 鼠，摘?、拧ⅱ?、⑷組裸鼠腫瘤同側(cè)的腋下淋巴結(jié)，考察各組淋巴結(jié)大小，衡量腫瘤早期 轉(zhuǎn)移的水平。
[0049] 結(jié)果顯示（圖5、6、7、8、9) :DEX給藥組腫瘤體積顯著小于空白對(duì)照組和TAM、GEM 陽(yáng)性對(duì)照組，且DEX對(duì)腫瘤大小的抑制作用呈劑量依賴性。DEX組淋巴結(jié)大小明顯小于空白 對(duì)照組，DEX對(duì)腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯的抑制作用。給藥期間，各組裸鼠體重均無(wú)顯 著變化；給藥最后一天，各組裸鼠血象指標(biāo)除白細(xì)胞水平外，其它指標(biāo)DEX給藥組與空白對(duì) 照組無(wú)明顯差異，藥物安全性良好。
[0050] 討論：A549為具有原發(fā)性耐藥的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，化療藥物GEM和內(nèi)分泌 治療藥物TAM對(duì)其腫瘤大小的抑制作用較小，這也進(jìn)一步證實(shí)了其耐藥特性。DEX給藥組腫 瘤體積顯著小于空白對(duì)照組和化療藥物、內(nèi)分泌治療藥物給藥組，且其對(duì)腫瘤的抑制作用 呈劑量依賴性，說(shuō)明DEX對(duì)耐藥性腫瘤具有較好的抑制作用。腫瘤轉(zhuǎn)移的第一步常常是轉(zhuǎn) 移到鄰近淋巴結(jié)，造成淋巴結(jié)腫大，因此，淋巴結(jié)的大小可作為衡量腫瘤轉(zhuǎn)移的早期指標(biāo)。 DEX給藥組淋巴結(jié)大小顯著小于空白對(duì)照組，說(shuō)明DEX對(duì)腫瘤的早期轉(zhuǎn)移具有良好的抑制 效果。裸鼠體重變化及血象指標(biāo)常作為衡量藥物毒性的兩大指標(biāo)，本實(shí)施例中，DEX給藥組 裸鼠體重與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異，從一個(gè)方面說(shuō)明了DEX藥物安全性良好；裸鼠血象指 標(biāo)除白細(xì)胞水平外，其它指標(biāo)DEX給藥組與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異，而白細(xì)胞水平是目前 臨床報(bào)道的DEX常見(jiàn)不良反應(yīng)，該不良反應(yīng)在一定范圍內(nèi)是可以被患者接受的，另外，DEX對(duì)白細(xì)胞水平的影響小于TAM和GEM，說(shuō)明DEX給藥安全性值得信賴。
[0051] 實(shí)施例4:
[0052] DEX對(duì)體外非小細(xì)朐肺癌細(xì)朐訐務(wù)的影晌
[0053] 本實(shí)施例研宄了 DEX對(duì)轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞體外迀移的影響
[0054] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25 %胰酶-0.53mmol/LEDTA溶液消化、計(jì)數(shù)。將 H1299 (轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系）按1X106個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)12h后，用200yL 槍頭在培養(yǎng)板上劃直線，PBS溶液將劃下的細(xì)胞清洗干凈，然后進(jìn)行給藥，DEX給藥組的終 濃度為〇. 1、1、1〇、40yM，采用無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵育12h。孵育結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，EVOS倒 置顯微鏡下觀察空白對(duì)照組與DEX給藥組腫瘤細(xì)胞的迀移情況，每個(gè)樣品拍攝3處照片測(cè) 量劃痕寬度。
[0055] 結(jié)果顯示（圖10、11) :DEX給藥組劃痕寬度明顯大于空白對(duì)照組，且DEX抑制肺癌 細(xì)胞迀移的作用呈劑量依賴性。
[0056] 討論：腫瘤細(xì)胞迀移是腫瘤轉(zhuǎn)移的第一步，腫瘤細(xì)胞的迀移能力在一定程度上代 表了其發(fā)生轉(zhuǎn)移的能力。DEX能明顯抑制劃痕的愈合，說(shuō)明其對(duì)腫瘤細(xì)胞的迀移能起到較好 的抑制作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 地塞米松及其藥學(xué)上可用的鹽在治療耐藥性腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的應(yīng)用，所述腫瘤為具有耐藥性或轉(zhuǎn)移性的小細(xì)胞肺癌或非 小細(xì)胞肺癌。3. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的應(yīng)用，所述腫瘤為具有耐藥性或轉(zhuǎn)移性的非小細(xì)胞肺癌。4. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的應(yīng)用，其中所述的地塞米松和其他種類的抑制/治療腫瘤 的藥物聯(lián)合使用，或地塞米松單獨(dú)使用。5. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的應(yīng)用，其中所述的應(yīng)用為在用藥對(duì)象的體內(nèi)施用，所述的 用藥對(duì)象為動(dòng)物或人。6. 地塞米松及其藥學(xué)上可用的鹽在制備用于治療耐藥性腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤的藥物中 的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6中所述的應(yīng)用，所述腫瘤為具有耐藥性或轉(zhuǎn)移性的小細(xì)胞肺癌或非 小細(xì)胞肺癌。8. 根據(jù)權(quán)利要求6中所述的應(yīng)用，所述腫瘤為具有耐藥性或轉(zhuǎn)移性的非小細(xì)胞肺癌。9. 根據(jù)權(quán)利要求6中所述的應(yīng)用，其中所述的地塞米松和其他種類的抑制/治療腫瘤 的藥物聯(lián)合使用，或地塞米松單獨(dú)使用。10. 根據(jù)權(quán)利要求6中所述的應(yīng)用，其中所述的藥物在用藥對(duì)象的體內(nèi)施用，所述的用 藥對(duì)象為動(dòng)物或人。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種治療耐藥性和轉(zhuǎn)移性肺癌的方案及其制劑和用途，該方案包括使用有效量的地塞米松或其可藥用的鹽。本發(fā)明的治療方案能顯著抑制耐藥性肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，降低耐藥性和轉(zhuǎn)移性肺癌的治療成本和風(fēng)險(xiǎn)，且無(wú)明顯毒副作用。
【IPC分類】A61K31/573, A61P35/00, A61P35/04
【公開號(hào)】CN104940212
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510330069
【發(fā)明人】周田彥, 盧煒, 李良, 李健, 王麗杰, 袁茵
【申請(qǐng)人】北京大學(xué)
【公開日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2015年6月16日