備對(duì)照組之用。
[0022] L3 實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM(GIBCO公司Cat.No. 12100-061Lot.No. 758137);胎牛血清 (浙江天杭生物科技有限公司Lot.No. 100419) ;NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat. No.11810-033Lot.No. 1088387)Jrypsin(AMRESC0 公司批號(hào)：2010/04) ;EDTA(AMRESCO 公司批號(hào)：2009/10);PenicillinGSodiumSalt(AMRESC0公司批號(hào)：2010242); Str印tomycinSulfate(AMRESO)公司批號(hào)：2010382);無(wú)水乙醇（南京化學(xué)試劑有限公司 批號(hào)：080310182) ;MTT(Biosharp批號(hào)：0793);PBS(實(shí)驗(yàn)室自配）；
[0023] 1. 4實(shí)驗(yàn)器材：萊卡倒置顯微鏡（德國(guó)Leica型號(hào)：DMlL);可見(jiàn)-紫外光微孔板檢 測(cè)儀（美國(guó)MD公司型號(hào)：SPECTRAMAX190) ;C02培養(yǎng)箱（FORMA型號(hào)：3111);超凈臺(tái)（蘇 凈集團(tuán)安泰公司制造型號(hào)：SW-CJ-ZFD);純水儀（美國(guó)Spring公司型號(hào)：S/N020579);精 密移液器（法國(guó)吉爾森公司型號(hào)：P2);電子天平（德國(guó)賽多利斯有限公司型號(hào)：BT323S); 全自動(dòng)高壓滅菌鍋（日本SANK)公司型號(hào)：MLS-3020);臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精密 實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào)：DHG9123A);冰箱（西門子公司型號(hào)：KG18V21TI);液氮罐（CBS型號(hào)： 2001);低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠型號(hào)：KA-1000) ;0.2ym濾器（MILLIP0RE型 號(hào)：SLGP033RB) ;10cm培養(yǎng)皿（NEST公司）、96孔培養(yǎng)板（NEST公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)板；離心管、 移液管、Tips若干。
[0024] 2實(shí)驗(yàn)方法：
[0025]1)P815 細(xì)胞用DMEM+10%FBS于 37°C、5%C02 進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)（10cm培養(yǎng)皿）， 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml0.25 %胰蛋白 酶-0. 04%EDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其 轉(zhuǎn)入離心管中，1000 rpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3X104個(gè)/ml。2)將細(xì)胞種入96孔 培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180y1，培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中（37°C，5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。 3)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般長(zhǎng)至50%-70%，加入烏雞白鳳膠囊溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。4) 24h 后加入20yIMTT溶液（5mg/ml，即0. 5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。5) 4h后扣板法倒去上清，用 吸水紙輕輕拍干，每孔加入200y1二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶 解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。6)同時(shí)設(shè)置本底（不加細(xì)胞，只加培 養(yǎng)液），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定6個(gè) 復(fù)孔。7)結(jié)果以藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率表示：細(xì)胞增值抑制率（％) = (對(duì)照孔OD值-給藥 孔OD值）/對(duì)照孔OD值X100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0026] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果：MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時(shí)，對(duì) P815細(xì)胞增殖抑制有差異（P〈0. 05)，劑量在lOmg/ml時(shí)該差異具有顯著性（P〈0. 01)，當(dāng)劑 量達(dá)到15-20mg/ml時(shí)有極顯著性差異（P〈0. 001)。
[0027] 表1烏雞白鳳膠囊對(duì)小鼠肥大細(xì)胞癌P815細(xì)胞增殖抑制影響研宄（X土SD)
[0028]
[0029] 注：與對(duì)照組比較，*P〈0. 01 ;#P〈0. 001
[0030] 4實(shí)驗(yàn)結(jié)論：烏雞白鳳膠囊可以抑制小鼠肥大細(xì)胞癌P815細(xì)胞增殖，減少小鼠肥 大細(xì)胞癌P815細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)目，該作用呈劑量依賴性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種烏雞白鳳膠囊的制備方法，由去毛爪腸的烏雞540g、丹參108g、地黃216g、醋香 附108g、人參108g、白芍108g、煅牡蠣40g、鹿角霜40g、銀柴胡22g、甘草27g、黃芪27g、醋 鱉甲54g作為原料藥制成，其特征在于所述的方法由下列步驟組成：取上述藥材加入到CO2 超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力 15-30MPa，溫度30-50°C，CO2流量l-3ml/g生藥.min,萃取時(shí)間150-180min，得超臨界萃取 物，加入淀粉20g，70%乙醇制顆粒，干燥，裝膠囊，制成800粒，每粒重0. 3g。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述烏雞白鳳膠囊的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取夾 帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述烏雞白鳳膠囊的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取的 萃取壓力20MPa，溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥?min，萃取時(shí)間160min。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述烏雞白鳳膠囊在制備抑制小鼠肥大細(xì)胞癌P815細(xì)胞增殖藥 物中的應(yīng)用，其特征在于烏雞白鳳膠囊由去毛爪腸的烏雞540g、丹參108g、地黃216g、醋香 附108g、人參108g、白芍108g、煅牡蠣40g、鹿角霜40g、銀柴胡22g、甘草27g、黃芪27g、醋 鱉甲54g作為原料藥制成，制備方法為：取去毛爪腸的烏雞540g、丹參108g、地黃216g、醋 香附l〇8g、人參108g、白芍108g、煅牡蠣40g、鹿角霜40g、銀柴胡22g、甘草27g、黃芪27g、 醋鱉甲54g，加入到0)2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百 分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C，CO2流量l-3ml/g生藥.min,萃取時(shí)間 150-180min，得超臨界萃取物，加入淀粉20g，70 %乙醇制顆粒，干燥，裝膠囊，制成800粒， 每粒重0. 3g。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述烏雞白鳳膠囊在制備抑制小鼠肥大細(xì)胞癌P815細(xì)胞增殖藥物 中的應(yīng)用，其特征在于烏雞白鳳膠囊的制備方法中所述〇)2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶 劑的體積百分比為5%。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述烏雞白鳳膠囊在制備抑制小鼠肥大細(xì)胞癌P815細(xì)胞增殖藥物 中的應(yīng)用，其特征在于烏雞白鳳膠囊的制備方法中所述〇)2超臨界萃取的萃取壓力20MPa， 溫度40°C，CO2流量2ml/g生藥?min，萃取時(shí)間160min。
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥制劑領(lǐng)域，具體提供一種烏雞白鳳膠囊的制備方法，由去毛爪腸的烏雞540g、丹參108g、地黃216g、醋香附108g、人參108g、白芍108g、煅牡蠣40g、鹿角霜40g、銀柴胡22g、甘草27g、黃芪27g、醋鱉甲54g作為原料藥制成，采用超臨界萃取制備而成，使得含量有很大提高，用量減少，本發(fā)明還提供了烏雞白鳳膠囊在制備抑制小鼠肥大細(xì)胞癌P815細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【IPC分類】A61K35/586, A61P35/00, A61K9/48, A61K35/618, A61K35/32, A61K36/8905, A61K35/57
【公開(kāi)號(hào)】CN104906303
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510340606
【發(fā)明人】李洋
【申請(qǐng)人】南京華寬信息咨詢中心
【公開(kāi)日】2015年9月16日
【申請(qǐng)日】2015年6月18日