一種基于細(xì)胞膜包覆的腫瘤光療試劑及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于細(xì)胞膜包覆的腫瘤光療試劑及其制備方法和應(yīng)用，屬于抗腫瘤光療試劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是一種由控制細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制失常而引發(fā)的疾病，它可能在人體內(nèi)各個(gè)組織出現(xiàn)并且會(huì)侵入周圍正常組織從而發(fā)生轉(zhuǎn)移，成為危害人類生命健康的重要因素。傳統(tǒng)的癌癥的治療方法有外科手術(shù)切除、化學(xué)治療和放射線治療等，但由此造成的二次傷害往往大于癌癥本身，因此這些治療手段仍有待改進(jìn)。光動(dòng)力學(xué)療法是近年來(lái)發(fā)展出的一種新型癌癥輔佐性療法，由于其對(duì)正常組織傷害小、無(wú)藥物毒性積累及副作用小等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。其中，光敏劑是光動(dòng)力學(xué)療法的關(guān)鍵組分，它通過(guò)將光能傳遞給周圍的氧分子產(chǎn)生活性氧簇，從而殺死癌細(xì)胞。目前常見(jiàn)的光敏劑包括卟啉、吲哚菁綠、二氫卟吩E6、竹紅菌甲素以及四氯四碘熒光素二鉀等，都取得了一定的抗癌效果。卟啉作為第一代光敏物質(zhì)在光動(dòng)力學(xué)療法領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛，它在可見(jiàn)光波段有密集的吸收帶并且單線態(tài)氧產(chǎn)率高，光療效果好。
[0003]但是，由于卟啉分子之間的π-π堆疊作用使其極易在水溶液中形成聚集體，這種自猝滅現(xiàn)象很大程度上削弱了單線態(tài)氧的產(chǎn)率及光療的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于細(xì)胞膜包覆的腫瘤光療試劑及其制備方法和應(yīng)用。
[0005]技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種基于細(xì)胞膜包覆的腫瘤光療試劑，所述試劑為側(cè)鏈含有光敏劑分子和聚乙二醇分子的高分子殼聚糖。
[0006]作為優(yōu)選，所述高分子殼聚糖為乙二醇?xì)ぞ厶牵浞肿恿看笥?0000。
[0007]作為另一種優(yōu)選，所述光敏劑分子通過(guò)與高分子殼聚糖上的氨基反應(yīng)接枝在高分子殼聚糖上，其數(shù)量占?xì)ぞ厶侵貜?fù)單元數(shù)的百分比為0.2% -4%。
[0008]作為另一種優(yōu)選，所述光敏劑分子為原卟啉、吲哚菁綠、二氫卟吩E6或卟啉衍生物。
[0009]作為另一種優(yōu)選，所述聚乙二醇分子通過(guò)與高分子殼聚糖上的氨基反應(yīng)接枝在高分子殼聚糖上，其數(shù)量占?xì)ぞ厶侵貜?fù)單元數(shù)的百分比為2% -30%。
[0010]作為另一種優(yōu)選，所述聚乙二醇分子為X-聚乙二醇-Y，其中X是N-羥基琥珀酰亞胺酯或羧基，聚乙二醇分子量為1000-8000，Y是甲氧基、氨基或羧基。
[0011]本發(fā)明還提供了所述腫瘤光療試劑的制備方法，包括如下步驟:
[0012](I)聚乙二醇-殼聚糖的合成:
[0013]稱取殼聚糖和聚乙二醇，將二者分別溶于PBS緩沖液，迅速混合均勻后，室溫下振蕩過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為1k的透析袋透析純化，冷凍干燥，即得；
[0014](2)羧基活化:
[0015]稱取光敏劑、1-(3- 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，分別溶于二甲基亞砜，得各溶液；先將光敏劑溶液與1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺溶液混合反應(yīng)后，再加入N-羥基琥珀酰亞胺繼續(xù)反應(yīng)，使羧基活化完全，得待合成體系；
[0016](3)光敏劑-聚乙二醇-殼聚糖的合成:
[0017]取步驟(I)所得聚乙二醇-殼聚糖溶于超純水中，并與步驟(2)所得待合成體系混合，室溫下振蕩過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為5k的透析袋在二甲基亞砜中透析純化，再用超純水透析純化，然后冷凍干燥，即得，于-20°C中冷凍保存，備用；
[0018]最后，本發(fā)明提供了所述腫瘤光療試劑在制備光敏劑中的應(yīng)用。
[0019]作為優(yōu)選，所述光敏劑為抗腫瘤光動(dòng)力學(xué)療法中所用的光敏劑。
[0020]作為另一種應(yīng)用，所述光敏劑為細(xì)胞成像中所用光敏劑。
[0021]本發(fā)明光療試劑的分子結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)附圖1。
[0022]為了實(shí)現(xiàn)不同的光療效果，所以本發(fā)明試劑中所述光敏劑分子可以選自原卟啉、吲哚菁綠、二氫卟吩E6或卟啉衍生物中的一種。
[0023]由于卟啉分子可以通過(guò)疏水相互作用插入到細(xì)胞膜中，起到對(duì)高分子錨定的作用，因此本發(fā)明光療試劑可以很快將細(xì)胞膜包覆，在短時(shí)間內(nèi)即可用于之后的光動(dòng)力學(xué)療法與細(xì)胞成像。利用這種多位點(diǎn)錨定的細(xì)胞膜包覆策略，使得卟啉分子均勻分散在細(xì)胞膜表面而不被內(nèi)吞，因此有效抑制了卟啉分子間由于聚集形成的自猝滅，在很大程度上提高的單線態(tài)氧產(chǎn)率與熒光亮度。
[0024]因此，本發(fā)明利用卟啉分子的疏水特性，將柔性的殼聚糖高分子錨定在細(xì)胞膜表面，從而把接枝的原卟啉分離開來(lái)。此外，聚乙二醇(PEG)側(cè)鏈的引入進(jìn)一步增強(qiáng)了高分子的兩親性，防止其在細(xì)胞膜表面形成自組裝。原卟啉分子在特定波長(zhǎng)的光照下，不僅可以產(chǎn)生單線態(tài)氧殺死癌細(xì)胞，還能實(shí)現(xiàn)具有免清洗效果的細(xì)胞膜成像。
[0025]綜上所述，本發(fā)明試劑不僅大大增強(qiáng)了其作為光敏劑的光動(dòng)力學(xué)療效，還提高了原卟啉的熒光產(chǎn)率，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了該分子在免清洗成像方面的應(yīng)用。
[0026]有益效果:相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明試劑在沒(méi)有光照的情況下對(duì)細(xì)胞的毒性非常低，但在一定波長(zhǎng)的照射下，較游離卟啉分子其光動(dòng)力學(xué)毒性極大提高。最重要的是，本發(fā)明還有效解決了卟啉分子之間的自猝滅效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了基于卟啉分子的細(xì)胞膜成像。
[0027]此外，本發(fā)明試劑還具有以下優(yōu)勢(shì):
[0028](I)卟啉作為第一代光療試劑，已經(jīng)在光動(dòng)力學(xué)療法領(lǐng)域擁有廣泛的應(yīng)用，并且在臨床上取得了良好的效果，而本發(fā)明在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高了卟啉的光動(dòng)力學(xué)毒性；
[0029](2)本發(fā)明光療試劑的組成成分殼聚糖、PEG以及原卟啉都具備良好的生物相容性，因此該試劑對(duì)細(xì)胞的毒性很低。MTT試驗(yàn)顯示，原卟啉含量為5 μ g/mL時(shí)，該試劑無(wú)光照條件下對(duì)細(xì)胞活力幾乎無(wú)影響，從而證明了該試劑良好的生物相容性；
[0030](3)殼聚糖高分子上剩余的氨基帶有的正電荷，會(huì)與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜發(fā)生靜電相互作用，增加與細(xì)胞膜的親和力，因而進(jìn)一步延長(zhǎng)了試劑在細(xì)胞膜上的保持時(shí)間；
[0031 ] (4)本發(fā)明可作為一種基于細(xì)胞膜包覆的光療應(yīng)用平臺(tái)，通過(guò)替換光敏劑來(lái)達(dá)到不同的光療效果。
【附圖說(shuō)明】
[0032]圖1:本發(fā)明光療試劑的分子結(jié)構(gòu)圖；
[0033]圖2:本發(fā)明實(shí)施例1所得光療試劑的結(jié)構(gòu)式；
[0034]圖3:本發(fā)明實(shí)施例1所得光療試劑的分子結(jié)構(gòu)圖；
[0035]圖4:為原卟啉、乙二醇?xì)ぞ厶?20%聚乙二醇和乙二醇?xì)ぞ厶?20%聚乙二醇-4%原卟啉在無(wú)光照條件下對(duì)A549肺癌細(xì)胞的毒性評(píng)價(jià)；
[0036]圖5:為乙二醇?xì)ぞ厶?20%聚乙二醇-4%原卟啉與原卟啉在光照條件下對(duì)A549肺癌細(xì)胞的毒性評(píng)價(jià)；
[0037]圖6:為乙二醇?xì)ぞ厶?20%聚乙二醇-4%原卟啉對(duì)A549肺癌細(xì)胞細(xì)胞膜的染色效果圖；
[0038]圖7:為經(jīng)瘤內(nèi)注射后原卟啉和乙二醇?xì)ぞ厶?20%聚乙二醇-4%原卟啉在裸鼠體內(nèi)的熒光成像圖；
[0039]圖8:為經(jīng)過(guò)原卟啉和乙二醇?xì)ぞ厶?20%聚乙二醇-4%原卟啉光動(dòng)力學(xué)治療后的裸鼠腫瘤體積隨時(shí)間變化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040]實(shí)施例1
[0041](I)首先以乙二醇?xì)ぞ厶?glycol chitosan)和N-輕基琥泊酰亞胺醋-聚乙二醇2000-甲氧基(NHS-PEG2000-0Me)為原料，合成PEG分子占?xì)ぞ厶侵貜?fù)單元數(shù)的百分比為20%的前體，即殼聚糖-20% PEG。分別稱取40mg NHS-PEG2000_0Me和20mg乙二醇?xì)ぞ厶?，將二者分別溶于PBS緩沖液(pH 7.4，50mM)，迅速混合均勻后，在搖床中室溫下反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為1k的透析袋透析3天進(jìn)行純化，最后在凍干機(jī)中凍干制成殼聚糖-20% PEGo
[0042](2)隨后，以殼聚糖-20% PEG、原卟啉(PpIX)U-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)以及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)為原料合成PpIX分子占?xì)ぞ厶侵貜?fù)單元數(shù)的百分比為4%的光療試劑:殼聚糖-20% PEG-4% PpIXo稱取2.2mg PpIX,6.6mg EDC和5.2mgNHS,并分別溶于ImL 二甲基亞砜(DMSO)。先將PpIX與EDC混合反應(yīng)1min后，再加入NHS繼續(xù)反應(yīng)20min，使羧基活化完全。
[0043](3)隨后，將殼聚糖-20% PEG溶于ImL超純水中，并與以上反應(yīng)體系混合，在搖床中室溫下反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束后，先用截留分子量為5k的透析袋在DMSO中透析純化3天，再用超純水透析純化I天。最后在凍干機(jī)中冷凍干燥制得光療試劑:殼聚糖-20% PEG-4%ΡρΙΧ，并于_20°C中冷凍保存。
[0044]上述方法所得試劑記為乙二醇?xì)ぞ厶?20%聚乙二醇-4%原卟啉，其結(jié)構(gòu)式和分子結(jié)構(gòu)圖分別見(jiàn)附圖2和附圖3