一種可細(xì)胞原位包覆的多孔凍凝膠及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一類新型可細(xì)胞原位包覆的多孔凍凝膠的制備方法：雙鍵功能化的高分子溶解到甘油或者二甲基亞砜和血清的磷酸緩沖溶液中，將細(xì)胞均勻分散到此溶液中，緩慢冷凍，然后交聯(lián)形成細(xì)胞原位包覆的多孔凍凝膠。本發(fā)明還公開了上述制備方法所制得的多孔凍凝膠。所制備的多孔凍凝膠，具有良好的生物相容性、高彈性和貫通孔結(jié)構(gòu)，可以作為細(xì)胞載體和組織工程/修復(fù)支架材料等，在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域有廣泛的用途。
【專利說明】
一種可細(xì)胞原位包覆的多孔凍凝膠及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一類新型多孔凍凝膠細(xì)胞載體的制備，屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近幾十年中，多孔高分子材料在疾病的診斷及治療、再生醫(yī)學(xué)以及組織器官的修復(fù)或替換等領(lǐng)域表現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景，其研究也越來越來受到人們的重視。聚合物凍凝膠由于具有良好的生物相容性、滲透性、貫通孔結(jié)構(gòu)以及高彈性等特性，在細(xì)胞載體、醫(yī)用敷料、組織工程支架等生物醫(yī)用領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。
[0003]目前凍凝膠制備過程中通常采用純水或者磷酸緩沖溶液作為溶劑，冷凍過程不利于細(xì)胞的存活?，F(xiàn)在報道的凍凝膠支架需要預(yù)先制備，然后再進(jìn)行細(xì)胞的種植，但是這種細(xì)胞負(fù)載方式會造成凍凝膠內(nèi)部細(xì)胞分布不均勻，進(jìn)而導(dǎo)致組織再生不均勻，影響再生組織的形狀及功能。
[0004]細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的長期存活。細(xì)胞凍存液中含有的甘油或二甲基亞砜能夠提高細(xì)胞膜對水的通透性，緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。將細(xì)胞凍存液用作大分子單體的溶劑，不僅可以降低凍凝膠制備中的冷凍過程對細(xì)胞的損傷，也可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在凍凝膠中的均勻分布。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的問題在于提供一種可以完成細(xì)胞均勻包覆、同時具有良好的吸水性和高彈性以及貫通孔結(jié)構(gòu)的生物相容性凍凝膠及其制備方法。
[0006]本發(fā)明多孔凍凝膠的制備方法的技術(shù)方案是:雙鍵功能化的高分子(例如:聚乙二醇，殼聚糖，透明質(zhì)酸，硫酸軟骨素，明膠等)溶液在冷凍狀態(tài)下交聯(lián)，形成具有多孔結(jié)構(gòu)的凍凝膠，具體為:
(1)雙鍵功能化的高分子(聚乙烯醇或者透明質(zhì)酸或者殼聚糖或者明膠)的合成:高分子溶解在磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入N，N-二甲基甲酰胺，攪拌均勻，然后加入催化劑(三乙胺或者二甲氨基吡啶)，攪拌均勻后加入一定量的甲基丙烯酸縮水甘油酯，聚合物和三乙胺(或者二甲氨基吡啶)的摩爾比為1:5?100，三乙胺(或者二甲氨基吡啶)與甲基丙烯酸縮水甘油酯的摩爾比為1:1。3 7 ° C攪拌I?15天，透析，凍干，得到雙鍵功能化的高分子；
(2)雙鍵功能化的聚乙二醇(PE⑶A)合成:將聚乙二醇溶解在甲苯中，120?160攝氏度回流半小時以上，共沸除水，冷卻到室溫，然后加入催化劑碳酸鉀或碳酸鈉或三乙胺，再加入丙烯酰氯，聚乙二醇和丙烯酰氯的摩爾比為1:2?12，20?60攝氏度下反應(yīng)5?24小時，抽濾，在過量乙醚中重沉淀，得到PEGDA ；
(3)細(xì)胞原位包覆的多孔凍凝膠的制備:將細(xì)胞均勻分散到上述功能化高分子的細(xì)胞凍存液溶液中，然后與氧化還原聚合引發(fā)劑混合均勻，緩慢低溫冷凍，冷凍反應(yīng)6?24小時；或者和光聚合引發(fā)劑，緩慢低溫冷凍，紫外光照5分鐘，得到多孔凍凝膠。
[0007]所述的氧化還原聚合引發(fā)劑為過硫酸胺/四甲基二乙胺。
[0008]所述的光引發(fā)劑為2-輕基-4’-(2-輕乙氧基)-2_甲基苯丙酮。
[0009]所述的細(xì)胞凍存液為甘油或二甲基亞砜和血清的磷酸緩沖溶液，其中甘油或二甲基亞砜的體積濃度為5%?15%，血清的體積濃度為10%?80%。
[0010]本發(fā)明還公開了上述合成方法所制得的多孔凍凝膠。
[0011]本發(fā)明同時還公開了上述合成方法所制得的多孔凍凝膠可以作為細(xì)胞載體和組織工程支架材料。
[0012]透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素是在體內(nèi)很多組織存在的一種生物材料，在體內(nèi)可生物降解;殼聚糖和明膠也是具有良好生物相容性的天然高分子材料。聚乙二醇(PEG)是Π)Α批準(zhǔn)的可用于體內(nèi)的具有生物惰性的生物材料，它在體內(nèi)不會引起凝血反應(yīng)，通過腎臟排出體內(nèi)。細(xì)胞凍存是可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞長期存活保存方法。采用以上材料結(jié)合細(xì)胞凍存過程制備新型多孔凍凝膠，不僅具有具有良好的生物相容性，還實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞在多孔凍凝膠支架中的均勻分布，它的貫通孔結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的生長、增殖、分化以及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，其可以作為細(xì)胞載體和組織工程/修復(fù)支架材料等，具有有益的技術(shù)效果和廣泛應(yīng)用前景。
[0013]
【附圖說明】
[0014]圖1為實(shí)施例1所得的雙鍵功能化的透明質(zhì)酸的核磁共振氫譜；圖2為實(shí)施例2所得的雙鍵功能化的聚乙二醇的核磁共振氫譜；圖3為實(shí)施例1所得的多孔凍凝膠中的MSC的活-死細(xì)胞雙重染色；圖4為實(shí)施例5所得的多孔凍凝膠中的MSC的活-死細(xì)胞雙重染色。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0016]實(shí)施例1:0.5 g透明質(zhì)酸鈉(HA)完全溶解到100 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入50 mL的N，N-二甲基甲酰胺，然后依次加入2.52 g三乙胺和3.54 g甲基丙烯酸縮水甘油酯，室溫攪拌5天，透析，凍干，得到雙鍵功能化透明質(zhì)酸(HAGMA)j_1.0 mL二甲基亞砜和4.0 mL胎牛血清溶解到5.0 mL磷酸緩沖溶液中制得細(xì)胞凍存液。將0.04 g的HAGMA溶解在1.0 mL細(xì)胞凍存液(含10%二甲基亞砜和20%血清的磷酸緩沖溶液)中，并加入光引發(fā)劑，然后將小鼠骨髓間充值干細(xì)胞(MSC)均勻分散到混合溶液中，將MSC懸液加入模具中，緩慢低溫冷凍4小時，紫外光照5分鐘，然后將反應(yīng)體系放置到37 °C的培養(yǎng)基中，得到負(fù)載細(xì)胞的多孔凍凝膠。體外培養(yǎng)24小時后對其進(jìn)行活-死細(xì)胞雙重染色。
[0017]實(shí)施例2:2.0 g數(shù)均分子量為6000 g/mol的聚乙二醇(PEG)溶解到裝有50毫升甲苯的100毫升圓底燒瓶中，135攝氏度下回流2小時，共沸蒸餾除去微量的水分。待甲苯溶液冷卻到室溫后，加入0.13克干燥的碳酸鈉，再將溶解在10毫升四氫呋喃中的0.1 mL的丙烯酰氯慢慢滴入燒瓶中，冰浴反應(yīng)30分鐘后，于45攝氏度反應(yīng)過夜，抽濾、濃縮并重沉淀于過量乙醚中，進(jìn)一步抽濾、干燥，再溶解到20 mL純水中，透析，凍干，得到PEGDA。將0.1 g的PEGDA溶解在1.0 mL細(xì)胞凍存液(含10%二甲基亞砜和30%血清的磷酸緩沖溶液)中，并加入過硫酸胺/四甲基二乙胺，然后將小鼠骨髓間充值干細(xì)胞(MSC)均勻分散到混合溶液中，再將MSC懸液加入模具中，緩慢低溫冷凍，反應(yīng)過夜，然后將反應(yīng)體系放置到37 °(:的培養(yǎng)基中，得到負(fù)載細(xì)胞的多孔凍凝膠。
[0018]實(shí)施例3:0.5 g硫酸軟骨素鈉(CS)溶解在50 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入20 mL的N，N-二甲基甲酰胺，然后依次加入2.52 g三乙胺和3.54 g甲基丙烯酸縮水甘油酯，室溫攪拌5天。濃縮，透析，凍干，得到雙鍵功能化的硫酸軟骨素鈉(CSGMA)；將0.08 g的CSGMA溶解在1.0 mL細(xì)胞凍存液(含10%二甲基亞砜和20%血清的磷酸緩沖溶液)中，并加入光引發(fā)劑，然后將MSC均勻分散到混合溶液中，將細(xì)胞懸液加入模具中，緩慢低溫冷凍4小時，紫外光照5分鐘，然后將反應(yīng)體系放置到37 °C的培養(yǎng)基中，得到負(fù)載細(xì)胞的多孔凍凝膠。
[0019]實(shí)施例4:0.5克殼聚糖(Chitosa)溶解在50 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入20 mL的N，N-二甲基甲酰胺，然后加入3.54 g甲基丙烯酸縮水甘油酯，室溫攪拌3天。濃縮，透析，凍干，得到雙鍵功能化的殼聚糖(Chitosa-GMA);將0.1 g的Chitosa-GMA溶解在
1.0mL細(xì)胞凍存液(含10%二甲基亞砜和40%血清的磷酸緩沖溶液)中，并加入過硫酸胺/四甲基二乙胺，然后將MSC均勻分散到混合溶液中，再將細(xì)胞懸液加入模具中，緩慢低溫冷凍，反應(yīng)24小時，然后將反應(yīng)體系放置到37 °C的培養(yǎng)基中，得到負(fù)載細(xì)胞的多孔凍凝膠。
[0020]實(shí)施例5:0.5 g透明質(zhì)酸鈉(HA)溶解在100 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入50 mL的N，N-二甲基甲酰胺，然后依次加入2.52 g三乙胺和3.54 g甲基丙烯酸縮水甘油酯，室溫攪拌5天。濃縮，透析，凍干，得到HAGMA; 6 g明膠(GeIatin)溶解在150 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入50 mL的N，N_二甲基甲酰胺，然后依次加入10 g三乙胺和20 g甲基丙烯酸縮水甘油酯，40 °C攪拌5天。濃縮，透析，凍干，得到雙鍵功能化的明膠(Gelatin-GMA);將0.03 g的HAGMA和0.01 g的Gelatin-GMA共同溶解在1.0 mL細(xì)胞凍存液(含10%二甲基亞砜和20%血清的磷酸緩沖溶液)中，并加入光引發(fā)劑，然后將MSC均勻分散到混合溶液中，將細(xì)胞懸液加入模具中，緩慢低溫冷凍4小時，紫外光照5分鐘，然后將反應(yīng)體系放置到37 °C的培養(yǎng)基中，得到負(fù)載細(xì)胞的多孔凍凝膠。體外培養(yǎng)24小時后對其進(jìn)行活-死細(xì)胞雙重染色。
[0021]實(shí)施例6:0.5克殼聚糖(Chitosa)溶解在50 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入20 mL的N，N-二甲基甲酰胺，然后加入3.54 g甲基丙烯酸縮水甘油酯，室溫攪拌3天。濃縮，透析，凍干，得到雙鍵功能化的殼聚糖(Chitosa-GMA);將0.1 g的Chitosa-GMA溶解在
1.0mL細(xì)胞凍存液(含10%二甲基亞砜和30%血清的磷酸緩沖溶液)中，并加入光引發(fā)劑，然后將MSC均勻分散到混合溶液中，將細(xì)胞懸液加入模具中，緩慢低溫冷凍4小時，紫外光照5分鐘，然后將反應(yīng)體系放置到37 °C的培養(yǎng)基中，得到負(fù)載細(xì)胞的多孔凍凝膠。
[0022]實(shí)施例7:2.0 g數(shù)均分子量為6000 g/mol的聚乙二醇(PEG)溶解到裝有50毫升甲苯的100毫升圓底燒瓶中，135攝氏度下回流2小時，共沸蒸餾除去微量的水分。待甲苯溶液冷卻到室溫后，加入0.13克干燥的碳酸鈉，再將溶解在10毫升四氫呋喃中的0.1 mL的丙烯酰氯慢慢滴入燒瓶中，冰浴反應(yīng)30分鐘后，于45攝氏度反應(yīng)過夜，抽濾、濃縮并重沉淀于過量乙醚中，進(jìn)一步抽濾、干燥，再溶解到20 mL純水中，透析，凍干，得到PEGDA。將0.1 g的PEGDA溶解在1.0 mL細(xì)胞凍存液(含10%二甲基亞砜和50%血清的磷酸緩沖溶液)中，并加入光引發(fā)劑，然后將MSC均勻分散到混合溶液中，將細(xì)胞懸液加入模具中，緩慢低溫冷凍4小時，紫外光照5分鐘，然后將反應(yīng)體系放置到37 °C的培養(yǎng)基中，得到負(fù)載細(xì)胞的多孔凍凝膠。
[0023]實(shí)施例8:1.0 g數(shù)均分子量為6000 g/mol的聚乙二醇(PEG)溶解到裝有50毫升甲苯的100毫升圓底燒瓶中，135攝氏度下回流2小時，共沸蒸餾除去微量的水分。待甲苯溶液冷卻到室溫后，加入0.13克干燥的碳酸鈉，再將溶解在10毫升四氫呋喃中的0.1 mL的丙烯酰氯慢慢滴入燒瓶中，冰浴反應(yīng)30分鐘后，于45攝氏度反應(yīng)過夜，抽濾、濃縮并重沉淀于過量乙醚中，進(jìn)一步抽濾、干燥，再溶解到10 mL純水中，透析，凍干，得到PEGDA;5 g明膠(Gelatin)溶解在150 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入50 mL的N，N_二甲基甲酰胺，然后依次加入10 g三乙胺和15 g甲基丙烯酸縮水甘油酯，40 °C攪拌5天。濃縮，透析，凍干，得到雙鍵功能化的明膠(Gelatin-GMA);將0.1 g的PEGDA和0.01 g的Gelatin-GMA共同溶解在1.0 mL細(xì)胞凍存液(含10%二甲基亞砜和20%血清的磷酸緩沖溶液)中，并加入光引發(fā)劑，然后將MSC均勻分散到混合溶液中，將細(xì)胞懸液加入模具中，緩慢低溫冷凍4小時，紫外光照5分鐘，然后將反應(yīng)體系放置到37 °C的培養(yǎng)基中，得到負(fù)載細(xì)胞的多孔凍凝膠。
[0024]實(shí)施例9:0.5克殼聚糖(Chitosa)溶解在50 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入20 mL的N，N-二甲基甲酰胺，然后加入3.54 g甲基丙烯酸縮水甘油酯，室溫攪拌3天。濃縮，透析，凍干，得到雙鍵功能化的殼聚糖(Chitosa-GMA) ;5 g明膠(Gelatin)溶解在150 mL磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，加入50 mL的N，N_二甲基甲酰胺，然后依次加入10 g三乙胺和15 g甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)，40 °C攪拌5天。濃縮，透析，凍干，得到雙鍵功能化的明膠(Gelatin-GMA);將0.1 8的01^083-6嫩和0.01 g的Gelatin-GMA共同溶解在I.0 mL細(xì)胞凍存液(含10%二甲基亞砜和20%血清的磷酸緩沖溶液)中，并加入光引發(fā)劑，然后將MSC均勻分散到混合溶液中，將細(xì)胞懸液加入模具中，緩慢低溫冷凍4小時，紫外光照5分鐘，然后將反應(yīng)體系放置到37 °C的培養(yǎng)基中，得到負(fù)載細(xì)胞的多孔凍凝膠。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種可細(xì)胞原位包覆的多孔凍凝膠的制備，其特征是:雙鍵功能化的高分子(例如:聚乙二醇，殼聚糖，透明質(zhì)酸，硫酸軟骨素，明膠等)溶液在冷凍狀態(tài)下交聯(lián)，形成具有多孔結(jié)構(gòu)的凍凝膠，具體為: 將細(xì)胞均勻分散到雙鍵功能化高分子的細(xì)胞凍存液溶液中，然后與氧化還原聚合引發(fā)劑混合均勻，緩慢低溫冷凍，冷凍反應(yīng)2?24小時;或者和光聚合引發(fā)劑，緩慢低溫冷凍，紫外光照5分鐘，得到多孔凍凝膠。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍凝膠的制備方法，其特征在于:所述的自由基聚合引發(fā)劑為過硫酸胺/四甲基二乙胺;光聚合引發(fā)劑為2-羥基-4’-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍凝膠的制備方法，其特征在于:所述的細(xì)胞凍存液為甘油或者二甲基亞砜和血清的磷酸緩沖溶液，其中甘油或二甲基亞砜的體積濃度為5%?15%，血清的體積濃度為10%~40%。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍凝膠的制備方法，其特征在于:雙鍵功能化的高分子溶液的濃度為2%?20% (g/mL)。5.權(quán)利要求1所述的制備方法制得的凍凝膠。6.權(quán)利要求5所述的凍凝膠在細(xì)胞載體以及組織工程支架材料上的應(yīng)用。
【文檔編號】C08J3/075GK106075599SQ201610523925
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月6日
【發(fā)明人】范長江
【申請人】青島大學(xué)