一種光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠及其制備方法和應(yīng)用，將甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白配制成溶液，然后與光引發(fā)劑（Irgacure 2959）溶液混合，通過紫外光照射得到所述絲膠蛋白水凝膠。所得的絲膠蛋白水凝膠具有良好的生物降解性能、自發(fā)熒光特性及可注射性能，可有效減少生物材料植入或取出所造成的創(chuàng)傷。更重要的是，該絲膠蛋白水凝膠在體內(nèi)及體外均具有良好生物相容性，可有效的促進(jìn)所載細(xì)胞的粘附。作為2D及3D細(xì)胞支架，該絲膠蛋白水凝膠可在無血清支持的條件下有效促進(jìn)所搭載細(xì)胞的增殖及促進(jìn)其形成有功能化的組織，作為傷口輔料可以促進(jìn)皮膚傷口修復(fù)，可作為組織工程及再生醫(yī)學(xué)生物材料。
【專利說明】
[0001] 一種光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)用復(fù)合材料領(lǐng)域，尤其涉及一種光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠及其制 備方法和應(yīng)用。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004] 水凝膠是一種具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的高分子材料。因其含水量高、柔軟、粘彈性以及 良好的生物相容性，已被應(yīng)用于醫(yī)用移植、生物傳感、以及藥物控制釋放等領(lǐng)域。在組織工 程領(lǐng)域，水凝膠可作為支持細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的2D或3D生物支架。
[0005] 水凝膠的交聯(lián)方式通常有化學(xué)交聯(lián)、高能輻射交聯(lián)、紫外光照射交聯(lián)等。本發(fā)明中 主要使用的是紫外光照射交聯(lián)法制備水凝膠。該方法制備所得的水凝膠具有良好的生物學(xué) 性能，不僅可以避免交聯(lián)劑及高能輻射對(duì)生物活性物質(zhì)的破壞，且反應(yīng)能夠在生理?xiàng)l件下 進(jìn)行，有效保護(hù)所包埋物質(zhì)的生物及理化性質(zhì)，使其在治療過程中發(fā)揮更大的功效。
[0006] 絲膠蛋白（Silk Sericin)是包裹在絲素纖維表層的一種天然大分子蛋白。長(zhǎng)期以 來由于人們對(duì)絲膠蛋白認(rèn)識(shí)的不足和研究的局限性，導(dǎo)致每年約有50,000噸絲膠在繅絲工 業(yè)中被當(dāng)作廢物處理，浪費(fèi)了大量寶貴的天然資源，并造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。如果將廢棄 的絲膠蛋白回收作為綠色材料應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，將可能會(huì)帶來巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益， 并且可減少?gòu)U棄物的排放保護(hù)生態(tài)環(huán)境。
[0007] 近年來，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，絲膠蛋白因具有良好的生物性能如生物可降解性、低免 疫原性、抗氧化性、細(xì)胞粘附性而受到廣泛的關(guān)注。目前，已有報(bào)道將絲膠蛋白制備成水凝 膠應(yīng)用于藥物載體或組織工程領(lǐng)域。但是，目前已報(bào)道的絲膠蛋白水凝膠也存在一些相應(yīng) 的缺陷，例如使用低溫溴化鋰提取的絲膠蛋白水凝膠其原材料為特定的絲素缺陷型突變蠶 繭，來源有限，提取的絲膠蛋白只能以溶液狀態(tài)低溫短期保存，而且常規(guī)滅菌會(huì)導(dǎo)致其降 解或變性；而通過高溫堿水法提取的絲膠蛋白雖然可以通過簡(jiǎn)單過濾的方式進(jìn)行滅菌保 存，但是在提取的過程中大分子蛋白質(zhì)被嚴(yán)重降解而難以制備成純絲膠蛋白水凝膠，只能 與其他高分子聚合物混合制備水凝膠。目前，并沒有以高溫堿水法提取絲膠蛋白制備純絲 膠蛋白水凝膠的報(bào)道。
[0008] 為了解決絲膠蛋白水凝膠制備過程中所存在的問題，我們使用高溫堿水法提取了 絲膠蛋白，并使用甲基丙烯酸酐對(duì)其進(jìn)行了相應(yīng)的改性。改性后所得甲基丙烯基修飾的絲 膠蛋白可通過凍干，以固態(tài)粉末的形式進(jìn)行長(zhǎng)期保存，且可通過簡(jiǎn)單過濾的方式進(jìn)行滅菌， 十分有利于其后續(xù)的開發(fā)應(yīng)用。并且甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白能夠在紫外光照射下交聯(lián) 制備形成水凝膠。該絲膠蛋白水凝膠具有良好的生物降解性能及可注射性能，可有效減少 生物材料植入體內(nèi)或取出所造成的創(chuàng)傷。更重要的是，該絲膠蛋白水凝膠在體內(nèi)及體外均 具有良好生物相容性，可有效的促進(jìn)搭載細(xì)胞的粘附。作為2D及3D細(xì)胞支架，該絲膠蛋白水 凝膠可在無血清支持的條件下有效促進(jìn)所搭載細(xì)胞的增殖，并且能夠促進(jìn)搭載細(xì)胞形成有 功能化的組織，具有后續(xù)開發(fā)為臨床組織工程材料的潛力。此外該絲膠蛋白水凝膠能夠促 進(jìn)皮膚全皮層損傷的修復(fù)，促進(jìn)其恢復(fù)正常功能。綜上所述，我們認(rèn)為發(fā)開此類絲膠蛋白水 凝膠作為組織工程及再生醫(yī)學(xué)生物材料是一項(xiàng)十分具有研究及開發(fā)前景的工作。
[0009]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠的制備 方法，該方法主要是使用甲基丙烯酸酐修飾絲膠蛋白，然后使用紫外光激發(fā)交聯(lián)制備了具 有良好的生物學(xué)性能的絲膠蛋白水凝膠，操作簡(jiǎn)便易行。
[0011]本發(fā)明提供了一種可作為2D或3D細(xì)胞支架的光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠，該絲膠蛋白 水凝膠具有良好的生物降解性和生物相容性，可搭載多種細(xì)胞。
[0012] 本發(fā)明所述的光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠，具有良好的藥物控制釋放性能，并可通過 控制甲基丙烯基的接枝度調(diào)控所搭載藥物的釋放速度。
[0013] 本發(fā)明提供了所述光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠作為熒光探針在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明提供了光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠凍干支架制備方法。由所述光交聯(lián)絲膠蛋白 水凝膠冷凍24小時(shí)后取出，再置于冷凍真空干燥機(jī)中干燥得到的絲膠蛋白水凝膠凍干支 架。
[0015] 本發(fā)明提供了所述光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠凍干支架在組織工程中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明提供了所述光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠在軟骨組織再生中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明提供了所述光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠在皮膚損傷修復(fù)中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明絲膠蛋白水凝膠以任何形態(tài)或形式存在并應(yīng)用于制備生物醫(yī)藥材料。
[0019] 具體的絲膠蛋白水凝膠的制備方法，包括以下步驟： 1)絲膠蛋白的提?。?稱取蠶繭(絲素缺陷型蠶繭（140 Nds，185 Nds)，家蠶蠶繭（白玉、皓月等），棹蠶蠶繭 (A. myIitta)或蓖麻蠶繭等），并將其剪成碎片，用水清洗，去除水分； 按每克蠶繭加入10-50 mL的0.01- 0.2 mol/L Na2CO3水溶液，在70-100°C條件下攪拌 0.5-3小時(shí)，使絲膠蛋白溶解，得到絲膠蛋白溶液； 離心去除所述絲膠蛋白溶液中的不溶性物質(zhì)，透析12~72小時(shí)，獲得澄清絲膠蛋白溶 液，凍干，得到絲膠蛋白粉末。
[0020] 2)甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白的制備： 將步驟1)中得到的絲膠蛋白或商品化的絲膠蛋白粉末以0.02-1 g/mL的比例溶解于 10-100 mL的磷酸緩沖液（pH 7.4~9.0)中，再按照每克絲膠蛋白加入0.1-1 g的比例滴 加甲基丙烯酸酐，置于20~45°C下反應(yīng)0.5~36小時(shí)。反應(yīng)完成后在去離子水中透析(截留分 子量為3.5 kDa) 12~72小時(shí)，凍干得到甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白粉末。
[0021] 3)甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液的配制 將步驟2)獲得的甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白粉末溶于去離子水或PBS或培養(yǎng)基中，制 成濃度為1%_40% (W/V，g/mL)甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液。
[0022] 4)光引發(fā)劑Irgacure 2959溶液的配制 稱取I g Irgacure 2959分散于10-1000 mL去離子水中，加熱至80-100 °C，制成濃度 為0.1%-10% (W/V，g/mL) Irgacure 2959溶液； 2)絲膠蛋白水凝膠的制備 按體積比1000/1~100/1將甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液與Irgacure 2959溶液混 合，通過紫外光照射得到所述絲膠蛋白水凝膠。
[0023] 進(jìn)一步的，在本申請(qǐng)的方案中，所述甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液(絲素缺陷型 蠶苗（140 Nds、185 Nds)，家蠶蠶苗（白玉、暗月），棹蠶蠶苗(A. mylitta)，商品化絲膠蛋 白）的濃度為100~400 g/L。
[0024] 更進(jìn)一步的，所述Irgacure 2959溶液的濃度為1-10 g/L。
[0025] 更進(jìn)一步的，在本申請(qǐng)的方案中，使用的紫外光照射強(qiáng)度為3-10 mV/cm2 更進(jìn)一步的，在本申請(qǐng)的方案中，使用的紫外光照射時(shí)間為10-300秒。
[0026] 本發(fā)明的方案具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1)本發(fā)明以絲素缺陷型蠶繭、家蠶蠶繭（白玉、皓月）、棹蠶蠶繭(A. mylitta)或商業(yè) 化的絲膠粉末作為原料，采用高溫堿液法提取并通過甲基丙烯基修飾獲得了具有良好生物 學(xué)特性的絲膠蛋白，該絲膠蛋白可通過簡(jiǎn)單過濾的方式進(jìn)行滅菌，并可制備成粉末狀長(zhǎng)期 保存。
[0027] 2)本發(fā)明首次通過紫外光照射交聯(lián)的方式制備了絲膠蛋白水凝膠，該絲膠蛋白 水凝膠具有良好的生物降解性和生物相容性，可作為細(xì)胞及藥物載體。
[0028] 3)本發(fā)明制備的絲膠蛋白水凝膠可通過調(diào)整甲基丙基的取代度、絲膠蛋白濃度、 光引發(fā)劑濃度及凝膠溫度調(diào)控凝膠時(shí)間及降解速度。
[0029] 4)本發(fā)明制備的絲膠蛋白水凝膠可作為3D生物支架搭載及培養(yǎng)各種細(xì)胞； 5) 本發(fā)明制備的絲膠蛋白水凝膠保持了絲膠蛋白良好的自發(fā)熒光特性； 6) 本發(fā)明制備的絲膠蛋白水凝膠可作為良好的細(xì)胞及藥物載體，通過皮下注射或者 肌肉注射的方式注入體內(nèi)，并可通過絲膠蛋白的自發(fā)熒光特性監(jiān)測(cè)細(xì)胞及藥物在體內(nèi)的情 況。
[0030] 7)本發(fā)明制備的絲膠水凝膠可作為組織工程材料應(yīng)用于骨損傷修復(fù)、皮膚損傷 修復(fù)、肌肉損傷修復(fù)等。
[0031] 8)本發(fā)明制備的絲膠水凝膠可經(jīng)冷凍干燥得到不同孔徑的絲膠蛋白水凝膠凍干 支架，該凍干支架可應(yīng)用于多種組織損傷的修復(fù)。
[0032]
【附圖說明】
[0033]圖1為絲膠蛋白（2)、甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白（3,4,5)的SDS-PAGE電泳圖譜。 [0034]圖2A為甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白核磁共振圖譜。
[0035]圖2B為絲膠蛋白及甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白紅外光譜。
[0036]圖2C為甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白水凝膠紅外光譜。
[0037]圖2D為甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白水凝膠實(shí)物圖。
[0038]圖3A為甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白水凝膠壓縮模量。
[0039] 圖3B為絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)的吸水膨脹率(37°C)。
[0040] 圖3C為絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)凍干產(chǎn)物內(nèi)部結(jié)構(gòu)SEM掃描。
[0041] 圖30為絲膠蛋白水凝膠(31〇-1、31〇-2、31〇-3)的降解曲線（37°〇。
[0042] 圖3E為絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)體外HRP釋放曲線。
[0043]圖4A為絲膠蛋白熒光光譜。
[0044]圖4B為甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白熒光光譜。
[0045]圖4C、4D、4E為絲膠蛋白水凝膠熒光光譜。
[0046]圖4F為激光共聚焦顯微鏡下觀察到的絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)凍干 產(chǎn)物熒光情況. 圖4G為絲膠蛋白水凝膠體內(nèi)小動(dòng)物熒光成像。
[0047]圖5A為Raw264.7細(xì)胞經(jīng)絲膠蛋白水凝膠刺激后的細(xì)胞形態(tài)。
[0048]圖5B為Raw264.7細(xì)胞經(jīng)絲膠蛋白水凝膠刺激后紅色熒光統(tǒng)計(jì)。
[0049] 圖5C為Raw264.7細(xì)胞經(jīng)絲膠蛋白水凝膠刺激后mRNA水平TNF-α表達(dá)量統(tǒng)計(jì)。
[0050] 圖ro為Raw264.7細(xì)胞經(jīng)絲膠蛋白水凝膠刺激后mRNA水平IL-Ιβ表達(dá)量統(tǒng)計(jì)。 圖5E為Raw264.7細(xì)胞經(jīng)絲膠蛋白溶液刺激后mRNA水平TNF-α表達(dá)量統(tǒng)計(jì)。 圖5F為Raw264.7細(xì)胞經(jīng)絲膠蛋白溶液刺激后mRNA水平IL-Ιβ表達(dá)量統(tǒng)計(jì)。
[0051] 圖6A為絲膠蛋白水凝膠注入小鼠體內(nèi)后，14天切出后H&E染色。
[0052]圖6B為絲膠蛋白水凝膠注入小鼠體內(nèi)后，14天切出后⑶68染色。
[0053]圖6C為絲膠蛋白水凝膠注入小鼠體內(nèi)后，14天切出后⑶68染色，陽性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)。 [0054]圖7A為小鼠肌細(xì)胞(C2C12)種植于絲膠蛋白水凝膠表面形態(tài)。
[0055]圖7B為小鼠肌細(xì)胞(C2C12)種植于絲膠蛋白水凝膠細(xì)胞骨架染色。
[0056]圖7C為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、小鼠肌細(xì)胞(C2C12)與絲膠蛋白水凝膠共培養(yǎng) 后，細(xì)胞活力值統(tǒng)計(jì)。
[0057]圖8為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)種植于絲膠蛋白水凝膠表面形態(tài)。
[0058]圖9A為絲膠蛋白促進(jìn)小鼠成肌細(xì)胞(C2C12 )增殖統(tǒng)計(jì)。
[0059]圖9B為絲膠蛋白水凝膠促進(jìn)小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)增殖統(tǒng)計(jì)。
[0060] 圖9C為絲膠蛋白水凝膠與小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)共孵育后，細(xì)胞周期。
[0061] 圖IOA為絲膠蛋白促進(jìn)原代軟骨細(xì)胞增殖統(tǒng)計(jì)。
[0062] 圖IOB為絲膠蛋白水凝膠促進(jìn)原代軟骨細(xì)胞增殖統(tǒng)計(jì)。
[0063] 圖IOC為絲膠蛋白水凝膠與原代軟骨細(xì)胞共孵育后，細(xì)胞周期。
[0064]圖IIA為絲膠蛋白水凝膠3D培養(yǎng)流程圖。
[0065]圖IIB為絲膠蛋白水凝膠3D培養(yǎng)小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)活死細(xì)胞染色。
[0066]圖11C為絲膠蛋白水凝膠3D培養(yǎng)小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)活細(xì)胞統(tǒng)計(jì)。
[0067]圖IlD為絲膠蛋白水凝膠3D培養(yǎng)小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)細(xì)胞活力統(tǒng)計(jì)。
[0068]圖12A為絲膠蛋白水凝膠3D體內(nèi)培養(yǎng)流程圖。
[0069]圖12B為絲膠蛋白水凝膠體內(nèi)3D培養(yǎng)原代軟骨細(xì)胞實(shí)物圖。
[0070]圖12C為絲膠蛋白水凝膠體內(nèi)3D培養(yǎng)原代軟骨細(xì)胞，各時(shí)間點(diǎn)H&E染色。
[0071]圖13A為絲膠蛋白水凝膠作為全皮層損傷修復(fù)材料應(yīng)用于皮膚損傷修復(fù)不同時(shí) 間點(diǎn)傷口恢復(fù)觀察圖。
[0072]圖13B為傷口恢復(fù)程度統(tǒng)計(jì)。
[0073]圖13C為絲膠蛋白水凝膠修復(fù)后不同時(shí)間點(diǎn)H&E染色圖及Masson染色圖， Tegaderm及皮耐克為商業(yè)化傷口敷料，作為對(duì)照。
[0074]圖14A為絲膠蛋白水凝膠修復(fù)后，不同時(shí)間點(diǎn)小鼠皮膚CD68、ΜΡ0染色。
[0075] 圖14B為CD68陽性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)。
[0076] 圖14C為MPO陽性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)。
[0077]圖15A為絲膠蛋白水凝膠修復(fù)后，不同時(shí)間點(diǎn)小鼠皮膚VEGFR、CD31染色。
[0078] 圖15B為VEGFR陽性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)。
[0079] 圖15C為⑶31陽性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)。
[0080] 圖16為絲膠蛋白水凝膠修復(fù)后，不同時(shí)間點(diǎn)小鼠皮膚α-SM染色及α-SM陽性細(xì)胞 統(tǒng)計(jì)。
[0081] 圖17A為修復(fù)后第14天傷口觀察圖。
[0082]圖17B為修復(fù)后第14天傷口組織H&E染色。
[0083]圖17C為修復(fù)后第14天傷口組織毛囊密度統(tǒng)計(jì)。
[0084]圖17D為修復(fù)后第14天傷口組織皮膚厚度統(tǒng)計(jì)。
[0085]
【具體實(shí)施方式】
[0086] 實(shí)施例1本發(fā)明提供的絲膠蛋白水凝膠的制備 蠶苗的選擇： 選用絲素缺陷型蠶繭（140 Nds、185 Nds)、家蠶蠶繭（白玉、皓月）、棹蠶蠶繭（A. mylitta)、商業(yè)購(gòu)買的絲膠粉末(湖州新天絲生物技術(shù)有限公司購(gòu)買），主要的化學(xué)成分為： 絲膠蛋白。
[0087]步驟1).絲膠蛋白的提取 1. 稱取絲素缺陷型蠶繭（140 Nds、185 Nds)或家蠶蠶繭（白玉、皓月）或棹蠶蠶繭(A. mylitta)100 g剪成碎片，后置于潔凈的燒杯中，用超純水清洗3次，3500 rpm離心5分鐘去 除水分； 2. 向步驟1的蠶繭碎片中加入3~4 L的摩爾濃度為0.02 mol/L的Na2CO3溶液或3~4 L 的去離子水，將其置于恒溫水浴鍋內(nèi)l〇〇°C水浴1小時(shí)，使絲膠蛋白溶解，得到絲膠蛋白溶 液； 3. 將步驟2得到溶液轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)3500 rpm離心5分鐘，去除不溶性物質(zhì)，得到澄清的 溶液； 4. 將步驟3中的澄清溶液轉(zhuǎn)移至到預(yù)處理的透析袋(截留分子量:3.5 kDa)中，將透析 袋兩端用透析袋夾夾緊，置于有ddH20的燒杯中，慢速攪拌透析，每隔3小時(shí)換一次水，共透 析72小時(shí)，獲得絲膠蛋白溶液； 5. 可選的，將步驟4中絲膠蛋白溶液轉(zhuǎn)到離心管中，3500 rpm離心5分鐘，去除沉淀； 6. 將步驟5中得到的絲膠蛋白溶液凍干成絲膠蛋白粉末，置于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?[0088]步驟2).甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白的制備 1.稱取步驟1)中絲膠蛋白粉末或商品化絲膠蛋白粉末6 g在35 °C條件下溶解于30 mL磷酸緩沖液中； 2. 將3.6 g甲基丙烯酸酐加入到步驟1中，反應(yīng)12-72小時(shí)，得到甲基丙烯基修飾的絲 月父蛋白洛液； 3. 將甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液轉(zhuǎn)入到預(yù)處理的透析袋(截留分子量:3.5 kDa) 中，用透析袋夾夾緊，置于含有CldH2O的燒杯中，慢速攪拌透析，每隔3小時(shí)換一次水，共透析 48小時(shí)； 4. 將步驟3中的甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液凍干，置于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0089] 步驟3). Irgacure 2959溶液的配制 1. 稱取I g Irgacure 2959分散于 100 mL ddH2〇中； 2. 將步驟1中的溶液加熱至80-100 °C。
[0090] 步驟4).甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液的配制 將甲基丙烯基修飾的絲蛋白粉末溶解于ddH20中，濃度調(diào)整到100 g/L左右，得到的甲 基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液； 步驟5).絲膠蛋白水凝膠的制備 將甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液與Irgacure 2959溶液按體積比1000/1-100/1充分 混勻，置于紫外光照射（6 mV/cm2，l min)得到絲膠蛋白水凝膠SMH-1。
[0091] 實(shí)施例2本發(fā)明提供的絲膠蛋白水凝膠的制備 本實(shí)施例中絲膠蛋白溶液制備方法與實(shí)施例1的制備方法相同，不同之處在于，步驟2) 按照以下進(jìn)行： 1. 稱取步驟1)中絲膠蛋白粉末或商品化絲膠蛋白粉末6 g在35 °C條件下溶解于30 mL磷酸緩沖液中； 2. 將0.024 g甲基丙烯酸酐加入到1)中，反應(yīng)12-72小時(shí)，得到甲基丙烯基修飾的絲 月父蛋白洛液； 3. 將甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液轉(zhuǎn)入到預(yù)處理的透析袋(截留分子量:3.5 kDa) 中，用透析袋夾夾緊，置于含有CldH2O的燒杯中，慢速攪拌透析，每隔3小時(shí)換一次水，共透析 48小時(shí)； 4. 將3中的甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液凍干，置于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0092] 5.將甲基丙烯基修飾的絲蛋白粉末溶解于ddH20中，濃度調(diào)整到100 g/L左右，得 到的甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液； 6. 將Irgacure 2959粉末溶解于ddH2〇中，濃度調(diào)整到10 g/L左右，得到Irgacure 2959溶液； 7. 將甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液與Irgacure 2959溶液按體積比1000/1-100/1 充分混勻，置于紫外光照射（6 mV/cm2，l min)得到絲膠蛋白水凝膠SMH-2。
[0093] 實(shí)施例3本發(fā)明提供的絲膠蛋白水凝膠的制備 本實(shí)施例中絲膠液制備方法與實(shí)施例1的制備方法相同，不同之處在于，步驟2)按照以 下進(jìn)行： 1.稱取步驟1)中絲膠蛋白粉末或商品化絲膠蛋白粉末6 g在35 °C條件下溶解于30 mL磷酸緩沖液中； 2. 將0.024 g甲基丙烯酸酐加入到1)中，反應(yīng)12-72小時(shí)，得到甲基丙烯基修飾的絲 月父蛋白洛液； 3. 將甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液轉(zhuǎn)入到預(yù)處理的透析袋(截留分子量:3.5 kDa) 中，用透析袋夾夾緊，置于含有CldH2O的燒杯中，慢速攪拌透析，每隔3小時(shí)換一次水，共透析 48小時(shí)； 4. 將3中的甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液凍干，置于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0094] 5.將甲基丙烯基修飾的絲蛋白粉末溶解于ddH20中，濃度調(diào)整到100 g/L左右，得 到的甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液； 6. 將Irgacure 2959粉末溶解于ddH2〇中，濃度調(diào)整到10 g/L左右，得到Irgacure 2959溶液； 7. 將甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液與Irgacure 2959溶液按體積比1000/1-100/1 充分混勻，置于紫外光照射（6 mV/cm2, I min)得到絲膠蛋白水凝膠SMH-3。
[0095] 實(shí)施例4絲膠蛋白水凝膠凍干支架的制備 將獲得的絲膠蛋白水凝膠SMH-I，SMH-2，SMH-3置于-80°C，冷凍24小時(shí)后取出；將樣品 置于冷凍真空干燥機(jī)中干燥，得到三種不同孔徑絲膠凍干支架。
[0096] 實(shí)施例5絲膠蛋白、甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白、絲膠蛋白水凝膠、以及所述絲膠蛋白 水凝膠凍干支架的表征檢測(cè)。
[0097] 圖1為本申請(qǐng)實(shí)施例1步驟1)制成的絲膠蛋白、實(shí)施例1步驟2)制成的甲基丙烯基 修飾的絲膠蛋白SDS-PAGE電泳圖譜。
[0098]使用SDS-PAGE電泳對(duì)實(shí)施例1中步驟1)、2)制成的絲膠蛋白，甲基丙烯基修飾的絲 膠蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。其中1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白（marker)，2為絲膠蛋白，3、4、5為甲基丙烯 基修飾的絲膠蛋白。絲膠蛋白、甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白均主要為彌散型，說明甲基丙烯 基的修飾并不會(huì)改變絲膠蛋白的天然構(gòu)象，有利于保持絲膠蛋白良好的生物學(xué)特性。
[0099]圖2A為實(shí)施例1中步驟2)制成的甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白的核磁共振圖譜。 [0100]由圖2A可以看出，在位移為5.5-6.0之間出現(xiàn)的峰為雙鍵峰，證明甲基丙烯基修飾 的絲膠蛋白已經(jīng)成功制備。
[0101]圖2B、2C分別為實(shí)施例1步驟2)制成的甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白（Sericin-MA)， 步驟1)制成的絲膠蛋白（Sericin)、以及實(shí)施例2步驟5)、實(shí)施例3步驟5)、實(shí)施例4步驟5)制 成的絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)的紅外光譜。
[0102] 利用傅里葉變換紅外光譜儀(Nexus, Thermal Nicolet, USA)檢測(cè)絲膠蛋白、甲 基丙烯基修飾的絲膠蛋白及絲膠蛋白水凝膠在4000-650 Cnf1的紅外光譜。
[0103] 檢測(cè)結(jié)果如圖2B、2C所示：絲膠蛋白（Sericin)、甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白 (Sericin-ΜΑ)，絲膠蛋白水凝膠（SMH-I、SMH-2、SMH-3)的特征峰酰胺I、酰胺Π 、酰胺ΙΠ 譜 帶基本相同，表明絲膠蛋白水凝膠（SMH-I、SMH-2、SMH-3)中的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)基本沒有改 變，絲膠蛋白水凝膠（SMH-I、SMH-2、SMH-3)能很好的維持絲膠蛋白的天然構(gòu)象。
[0104] 圖2D為實(shí)施例4步驟5 )制成的絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)的實(shí)物圖。
[0105] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白經(jīng)紫外光照射后可成功制備成絲膠蛋 白水凝膠。
[0106] 圖3A為實(shí)施例1-3制成的絲膠蛋白水凝膠SMH-I、SMH-2、SMH-3壓縮模量圖。
[0107] 如圖3A所示，本發(fā)明制備的絲膠蛋白水凝膠有較好的機(jī)械性能，其機(jī)械性能的大 小可甲基丙烯基取代度調(diào)控。
[0108] 圖3B為實(shí)施例1-3制成的絲膠蛋白水凝膠SMH-I、SMH-2、SMH-3吸水膨脹（37°C)。
[0109] 絲膠蛋白水凝膠吸水膨脹率的測(cè)定是通過將絲膠蛋白水凝膠凍干、稱重、浸泡于 PBS溶液中，在不同時(shí)間點(diǎn)，取出按以下公式測(cè)定。（其中Ws為膨脹狀態(tài)下的重量，Wd為干
重)。
[0110] 結(jié)果如圖3B所示：絲膠蛋白水凝膠（SMH-I、SMH-2、SMH-3)最大的膨脹率可分別達(dá)到 10.31倍、9.02倍、7.51倍;表明絲膠蛋白水凝膠具有很好的吸水性能，且該水凝膠的吸水性 能可通過控制甲基丙烯基取代度調(diào)節(jié)。
[0111] 圖3C為度絲膠蛋白水凝膠凍干產(chǎn)物內(nèi)部結(jié)構(gòu)SEM掃描觀察圖。
[0112] 觀察如圖3C所示：甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白水凝膠SMH-I (左）、SMH-2(中）、 SMH-3(右）的凍干產(chǎn)物在掃描電子顯微鏡下觀察內(nèi)部存在大量孔洞結(jié)構(gòu)。絲膠蛋白水凝膠 這種獨(dú)特的多孔結(jié)構(gòu)十分適于作為細(xì)胞支架搭載支持細(xì)胞生長(zhǎng)，并且十分有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 的交換。
[0113] 圖3D為絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)的降解曲線(37°C)。
[0114] 將絲膠蛋白水凝膠浸泡于PBS(pH 7.4)溶液中，在不同時(shí)間點(diǎn)，取出凍干稱重，結(jié) 果見圖3D。
[0115] 如圖3D所示，絲膠蛋白水凝膠在第1天內(nèi)迅速降解，在5天后該水凝膠逐漸開始緩 慢降解。在第45天時(shí)分別降解72.80% (SMH-I) ,46.62% (SMH-2)，36.67% (SMH-3)。該絲膠 蛋白水凝膠的降解速度可通過控制甲基丙烯基的接枝度來調(diào)控。
[0116] 實(shí)施例6絲膠蛋白水凝膠作為大分子藥物HRP控釋載體 一、實(shí)驗(yàn)過程 1. 取4 yL辣根過氧化物酶(HRP)溶液（2 yg/yL)與150 yL甲基丙烯基修飾的絲膠蛋 白液(100 g/L)混合； 2. 向1中加入體積比15 yL的Irgacure 2959(1%，W/V)，紫外光照射（6 mV/cm2， lmin)，交聯(lián)后放入4°C冰箱放置24小時(shí)； 3. 在樣品中加入PBS (pH 7.4) 2 mL置于37°C; 4. 在第0·5、1、2、3、4、5、7、12、18天，小心取出清液，并重新加入I mL PBS (pH 7.4); 5. 采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)量上清液中HRP的含量，通過計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上清液中 累計(jì)的HRP含量與實(shí)際載藥量的比值即得到累計(jì)釋放率。
[0117]二、實(shí)驗(yàn)分析 如圖3E所示:絲膠蛋白水凝膠對(duì)大分子蛋白質(zhì)藥物(HRP)有良好的控釋作用，可通過調(diào) 節(jié)甲基丙烯基取代度調(diào)控釋藥速度，是良好的藥物載體材料。
[0118] 實(shí)施例7絲膠蛋白水凝膠體外熒光特性 一、絲膠蛋白熒光特性測(cè)試 1. 分別稱取凍干的絲膠蛋白粉末及甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白粉末各100 yg用水配 制成濃度為100 yg/mL的絲膠蛋白溶液； 2. 利用熒光光譜測(cè)試儀測(cè)試1中絲膠蛋白溶液從320 nm~600 nm的熒光光譜。
[0119] 二、絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)熒光特性的測(cè)試 1. 分別取絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)各IOOyL，制備成絲膠蛋白水凝膠膜； 2. 利用熒光光譜測(cè)試儀測(cè)試1中絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)從320 nm~600 nm的熒光光譜。
[0120] 三、絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)凍干產(chǎn)物激光共聚焦測(cè)試 1. 制備絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)凍干產(chǎn)物； 2. 利用激光共聚焦顯微鏡觀察絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)的凍干產(chǎn)物。
[0121] 四、實(shí)驗(yàn)分析 1. 如圖4A、4B所示，甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白與絲膠蛋白相比，熒光光譜并沒有發(fā) 生明顯的變化，說明甲基丙烯基修飾并不會(huì)影響絲膠蛋白的熒光特性； 2. 如圖4C、4D、4E所示，絲膠蛋白交聯(lián)形成水凝膠后熒光光譜并沒有發(fā)生明顯的變化， 說明絲膠蛋白水凝膠仍然保持了絲膠蛋白的熒光特性； 3. 如圖4F所示，激光共聚焦結(jié)果表明絲膠蛋白水凝膠凍干產(chǎn)物仍然保持了絲膠的熒 光特性。
[0122] 實(shí)施例8絲膠蛋白水凝膠體內(nèi)熒光特性 一、絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)小鼠體內(nèi)熒光成像檢測(cè) 1. 將絲膠蛋白水凝膠(31^-1、31!1-2、30!1-3) 200以1^通過注射的方式注射到841^/(3小 鼠的背部； 2. 利用小動(dòng)物體內(nèi)熒光成像儀觀察其在激發(fā)光為420 nm，發(fā)射光為520 nm的熒光情 況。
[0123] 二、實(shí)驗(yàn)分析 1.如圖4G所示，小動(dòng)物體內(nèi)熒光成像結(jié)果表明絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3) 在體內(nèi)仍舊保持了其熒光的特性，可利用其熒光的特性進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞及藥物控釋的示蹤。
[0124] 實(shí)施例9絲膠蛋白水凝膠體外生物相容性測(cè)試 一、實(shí)驗(yàn)過程 1. 首先使用DMEM高糖培養(yǎng)基，在37°C，在5%的⑶2,100%濕度情況下培養(yǎng)Raw 264.7細(xì) 胞24小時(shí) 2. 接著將絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)鋪于6孔板中，每種絲膠蛋白水凝膠 各種三孔平行樣； 3. 將細(xì)胞培養(yǎng)瓶收集的Raw 264.7細(xì)胞使用培養(yǎng)基重新懸浮、吹散后，種植于絲膠水 凝膠表面，每孔細(xì)胞數(shù)目約為IO5; 4.在第2天對(duì)其進(jìn)行鬼筆環(huán)肽/DAPI染色； 二、實(shí)驗(yàn)分析 1. 如圖5A、B所示，絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)與對(duì)照組(LPS)相比，并不 會(huì)刺激Raw264.7細(xì)胞分化； 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，絲膠蛋白水凝膠有較好的細(xì)胞相容性。
[0125] 實(shí)施例10絲膠蛋白水凝膠體外生物相容性測(cè)試 一、 實(shí)驗(yàn)過程 1. 首先使用DMEM高糖培養(yǎng)基，在37°C，在5%的⑶2,100%濕度情況下培養(yǎng)Raw 264.7細(xì) 胞24小時(shí)； 2. 接著將絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)鋪于6孔板中，每種絲膠蛋白水凝膠 各種三孔平行樣； 3. 將細(xì)胞培養(yǎng)瓶收集的Raw 264.7細(xì)胞使用培養(yǎng)基重新懸浮、吹散后，種植于絲膠水 凝膠表面，每孔細(xì)胞數(shù)目約為IO5; 4. 在第2天提取細(xì)胞RNA，對(duì)其進(jìn)行TNF-a、IL-Ιβ的mRNA水平檢測(cè)； 二、 實(shí)驗(yàn)分析 1 ·如圖5C、D所示，絲膠蛋白水凝膠（3]\^-1、3]\^-2、3]\^-3)組了陬-(1、幾-16的1111?嫩水平 明顯低于陽性對(duì)照組(LPS )，接近于空白對(duì)照組； 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，絲膠蛋白水凝膠有較好的細(xì)胞相容性。
[0126] 實(shí)施例11絲膠蛋白水凝膠體內(nèi)生物相容性 一、 實(shí)驗(yàn)過程 1. 將絲膠蛋白溶液（100 g/L) 200 yL與20 yL Irgacure 2959(1%，W/V)混合通過注射 的方式注射到BALB/c小鼠的背部； 2. 利用紫外光照射(6 mV/cm2, Imin)交聯(lián)形成水凝膠； 3. 在第14天將水凝膠及附近組織取出進(jìn)行H&E與⑶68染色 二、 實(shí)驗(yàn)分析 1.如圖6A所示，H&E染色結(jié)果表明絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)在小鼠體內(nèi) 并沒有明顯炎性反應(yīng)發(fā)生。
[0127] 2.如圖6B、7C所示，⑶68染色及⑶68陽性細(xì)胞（巨噬細(xì)胞)結(jié)果顯示絲膠蛋白水凝 膠（SMH-I、SMH-2、SMH-3)在小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)目與Alginate水凝膠組相比沒有明顯差 異，表明絲膠蛋白水凝膠有較好的體內(nèi)生物相容性。
[0128] 實(shí)施例12絲膠蛋白水凝膠細(xì)胞毒性測(cè)試 一、實(shí)驗(yàn)過程 1. 首先使用DMEM高糖培養(yǎng)基，在37°C，在5%的CO2，100%濕度情況下培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮 細(xì)胞HUVEC、小鼠成肌細(xì)胞C2C12 24小時(shí)； 2. 接著將絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)鋪于96孔板中，每種絲膠蛋白水凝膠 各種三孔平行樣； 3. 使用培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶收集的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC、小鼠成肌細(xì)胞C2C12重 新懸浮、吹散，種植于絲膠水凝膠表面，每孔細(xì)胞數(shù)目約為8000; 4. 孵育48、96小時(shí)； 5. 48、96小時(shí)后向3中每孔加入10 yL CCK-8孵育1小時(shí)； 6. 利用酶標(biāo)儀測(cè)量其在490 nm和630 nm的吸光度值。
[0129] 二、實(shí)驗(yàn)分析 1. 如圖7C所示，絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)對(duì)HUVEC、C2C12細(xì)胞基本沒有 毒性，細(xì)胞存活率(即細(xì)胞活力)基本都保持在90%左右； 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，絲膠蛋白水凝膠有較好的細(xì)胞相容性。
[0130] 實(shí)施例13絲膠蛋白水凝膠細(xì)胞粘附測(cè)試 一、 實(shí)驗(yàn)過程 1. 首先使用DMEM高糖培養(yǎng)基，在37°C，在5%的CO2，100%濕度情況下培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮 細(xì)胞HUVEC、小鼠成肌細(xì)胞C2C12 24小時(shí)； 2. 接著將絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)鋪于96孔板中，每種絲膠蛋白水凝膠 各種三孔平行樣； 3. 使用培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶收集的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC、小鼠成肌細(xì)胞C2C12重 新懸浮、吹散，種植于絲膠水凝膠表面，每孔細(xì)胞數(shù)目約為8000; 4. 在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞形態(tài)； 5. 可選擇的，在第2天對(duì)C2C12細(xì)胞進(jìn)行鬼筆環(huán)肽/DAPI染色； 二、 實(shí)驗(yàn)分析 1. 如圖7A、8所示，絲膠蛋白水凝膠(SMH-1、SMH-2、SMH-3 )可支持C2C12和HUVEC細(xì)胞 粘附、伸展，并可長(zhǎng)期支持細(xì)胞生長(zhǎng)； 2. 如圖7B所示，絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)可支持C2C12細(xì)胞粘附、伸展； 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，絲膠蛋白水凝膠有較好的細(xì)胞粘附性。
[0131] 實(shí)施例14絲膠蛋白促進(jìn)細(xì)胞增殖測(cè)試 一、實(shí)驗(yàn)過程 1. 首先使用DMEM高糖培養(yǎng)基，在37°C，在5%的CO2，100%濕度情況下培養(yǎng)小鼠成肌細(xì)胞 C2C12 24小時(shí)； 2. 吸出1中含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，將其分為7組，每組分別加入DMEM+10%FBS、 DMEM+0%FBS、DMEM+0.2% SMA、DMEM+0.4% SMA、DMEM+0.8% SMA、DMEM+1.0% SMA、DMEM+2.0% SMA； 3. 孵育24、48小時(shí)； 4. 48、96小時(shí)后向3中每孔加入10 yL CCK-8共孵育I小時(shí)； 5. 利用酶標(biāo)儀測(cè)量其在490 nm和630 nm的吸光度值。
[0132] 二、實(shí)驗(yàn)分析 1.如圖9B所示，絲膠蛋白（SMA-l、SMA-2、SMA-3)可部分代替血清的作用，促進(jìn)細(xì)胞增 殖； 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，絲膠蛋白有較好的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，有應(yīng)用于肌肉損傷修復(fù)的潛 力。
[0133] 實(shí)施例15絲膠蛋白促進(jìn)細(xì)胞增殖測(cè)試 一、實(shí)驗(yàn)過程 1. 首先使用DMEM/F12培養(yǎng)基，在37°C，在5%的CO2，100%濕度情況下培養(yǎng)原代軟骨細(xì)胞 24小時(shí)； 2. 吸出1中含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，將其分為7組，每組分別加入DMEM+10%FBS、 DMEM+0%FBS、DMEM+0.2% SMA、DMEM+0.4% SMA、DMEM+0.8% SMA、DMEM+1.0% SMA、DMEM+2.0% SMA； 3. 孵育24、48小時(shí)； 4. 48、96小時(shí)后向3中每孔加入10 yL CCK-8共孵育I小時(shí)； 5. 利用酶標(biāo)儀測(cè)量其在490 nm和630 nm的吸光度值。
[0134] 二、實(shí)驗(yàn)分析 1. 如圖IOB所示，絲膠蛋白（SMA-l、SMA-2、SMA-3)可部分代替血清的作用，促進(jìn)軟骨 細(xì)胞增殖； 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，絲膠蛋白有較好的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，有應(yīng)用于軟骨損傷修復(fù)的潛 力。
[0135] 實(shí)施例16絲膠蛋白水凝膠促進(jìn)細(xì)胞增殖測(cè)試 一、實(shí)驗(yàn)過程 1. 首先使用DMEM高糖培養(yǎng)基，在37°C，在5%的CO2，100%濕度情況下培養(yǎng)小鼠成肌細(xì)胞 C2C12 24小時(shí)； 2. 吸出1中含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，將其分為7組，每組分別加入DMEM+10%FBS、 DMEM+0%FBS、DMEM+0·2% (SMH-1、SMH-2、SMH-3)、DMEM+0·4% (SMH-1、SMH-2、SMH-3)、DMEM+ 0·8% (SMH-I、SMH-2、SMH-3)、DMEM+1·0% (SMH-I、SMH-2、SMH-3)、DMEM+2·0%(SMH-I、SMH-2、 SMH-3)； 3. 孵育24、48小時(shí)； 4. 48、96小時(shí)后向3中每孔加入10 yL CCK-8共孵育I小時(shí)； 5. 利用酶標(biāo)儀測(cè)量其在490 nm和630 nm的吸光度值。
[0136] 二、實(shí)驗(yàn)分析 1. 如圖9A所示，絲膠蛋白水凝膠(SMH-l、SMH-2、SMH-3)可部分代替血清的作用，促進(jìn) 細(xì)胞增殖； 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，絲膠蛋白水凝膠有較好的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，有應(yīng)用于肌肉損傷修 復(fù)的潛力。
[0137] 實(shí)施例17絲膠蛋白水凝膠促進(jìn)細(xì)胞增殖測(cè)試 一、實(shí)驗(yàn)過程 1.首先使用DMEM/F12培養(yǎng)基，在37°C，在5%的C〇2，100%濕度情況下培養(yǎng)原代軟骨細(xì)胞 24小時(shí)； 2. 吸出1中含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，將其分為7組，每組分別加入DMEM+10%FBS、 DMEM+0%FBS、DMEM+0·2% (SMH-1、SMH-2、SMH-3)、DMEM+0·4% (SMH-1、SMH-2、SMH-3)、DMEM+ 0·8% (SMH-I、SMH-2、SMH-3)、DMEM+1·0% (SMH-I、SMH-2、SMH-3)、DMEM+2·0%(SMH-I、SMH-2、 SMH-3)； 3. 孵育24、48小時(shí)； 4. 48、96小時(shí)后向3中每孔加入10 yL CCK-8共孵育I小時(shí)； 5. 利用酶標(biāo)儀測(cè)量其在490 nm和630 nm的吸光度值。
[0138] 二、實(shí)驗(yàn)分析 1. 如圖IOB所示，絲膠蛋白水凝膠(SMH-l、SMH-2、SMH-3)可部分代替血清的作用，促 進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖； 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，絲膠蛋白水凝膠有較好的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，有應(yīng)用于軟骨損傷修 復(fù)的潛力。
[0139] 實(shí)施例18流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化 一、 實(shí)驗(yàn)過程 1. 首先使用DMEM高糖培養(yǎng)基，在37°C，在5%的CO2，100%濕度情況下培養(yǎng)小鼠成肌細(xì)胞 C2C12 24小時(shí)； 2. 向 1)中加入SMA-l、SMA-2、SMA-3 (IOOyL, 10 g/L); 3. 孵育24小時(shí)； 4. 24小時(shí)后，對(duì)3中細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期測(cè)試； 二、 實(shí)驗(yàn)分析 1. 如圖9C所示，絲膠蛋白（SMA-l、SMA-2、SMA-3)促使細(xì)胞周期發(fā)生改變，促進(jìn)C2C12 細(xì)胞分裂、增殖； 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，絲膠蛋白水凝膠有較好的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。
[0140] 實(shí)施例19流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化 一、 實(shí)驗(yàn)過程 1. 首先使用DMEM/F12培養(yǎng)基，在37°C，在5%的C〇2，100%濕度情況下培養(yǎng)原代軟骨細(xì)胞 24小時(shí)； 2. 向 1)中加入SMA-l、SMA-2、SMA-3 (IOOyL, 10 g/L); 3. 孵育24小時(shí)； 4. 24小時(shí)后，對(duì)3中細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期測(cè)試； 二、 實(shí)驗(yàn)分析 1. 如圖IOC所示，絲膠蛋白（SMA-l、SMA-2、SMA-3)促使細(xì)胞周期發(fā)生改變，促進(jìn)C2C12 細(xì)胞分裂、增殖； 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，絲膠蛋白水凝膠有較好的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。
[0141] 實(shí)施例20絲膠蛋白水凝膠3D細(xì)胞培養(yǎng) 一、實(shí)驗(yàn)過程 1. 首先使用DMEM高糖培養(yǎng)基，在37°C，在5%的CO2，100%濕度情況下培養(yǎng)小鼠成肌細(xì)胞 C2C12 24小時(shí)； 2. 接著將100 yL絲膠蛋白溶液（100 g/L)與1中細(xì)胞混合并加入10 uL Irgacure 2959(1%,W/V)； 3. 利用紫外光照射(6 mV/cm2，I min)交聯(lián)形成凝膠； 4. 在第1、2、3、6天對(duì)水凝膠進(jìn)行活死細(xì)胞染色； 5. 對(duì)4中染色細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
[0142] 二、實(shí)驗(yàn)分析 1.如圖11A、B、C所示，絲膠蛋白水凝膠(SMH-l、SMH-2、SMH-3)可支持細(xì)胞3D培養(yǎng)，并 且細(xì)胞在絲膠蛋白水凝膠內(nèi)可正常增殖。
[0143] 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，絲膠蛋白水凝膠可作為3D生物支架支持細(xì)胞生長(zhǎng)。
[0144] 實(shí)施例21絲膠蛋白水凝膠3D細(xì)胞培養(yǎng) 一、實(shí)驗(yàn)過程 1. 首先使用DMEM高糖培養(yǎng)基，在37°C，在5%的CO2，100%濕度情況下培養(yǎng)小鼠成肌細(xì)胞 C2C12 24小時(shí)； 2. 接著將100 yL絲膠蛋白溶液（100 g/L)與1中細(xì)胞混合并加入10 uL Irgacure 2959 (1%,W/V)； 3. 利用紫外光照射(6 mV/cm2, I min)交聯(lián)形成凝膠； 4. 在第1、2、3天在該水凝膠中加入10 nL CCK-8; 5. 利用酶標(biāo)儀測(cè)量其在490 nm和630 nm的吸光度值。
[0145] 二、實(shí)驗(yàn)分析 1.如圖IID所示，絲膠蛋白水凝膠(SMH-I、SMH-2、SMH-3)3D培養(yǎng)細(xì)胞與空白對(duì)照組相 比細(xì)胞存活率達(dá)到90%。
[0146] 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，絲膠蛋白水凝膠可作為3D生物支架支持細(xì)胞生長(zhǎng)。
[0147] 實(shí)施例22絲膠蛋白水凝膠3D體內(nèi)培養(yǎng)原代軟骨細(xì)胞 一、實(shí)驗(yàn)過程 1. 首先使用DMEM/F12培養(yǎng)基，在37°C，在5%的C〇2，100%濕度情況下培養(yǎng)原代軟骨細(xì)胞 24小時(shí)； 2. 接著將100 yL絲膠蛋白溶液（100 g/L)與1中細(xì)胞混合并加入10 yL Irgacure 2959 (1%,W/V)； 3. 通過注射的放射注入至小鼠皮下； 4. 利用紫外光照射(6 mV/cm2, I min)交聯(lián)形成凝膠； 5. 在第8、10、12周將其取出，進(jìn)行H&E染色。
[0148] 二、實(shí)驗(yàn)分析 I. H&E、Safranin 0、Collagen II染色結(jié)果如圖12C所示，絲膠蛋白水凝膠中的軟骨細(xì) 胞已經(jīng)形成了成熟的軟骨組織； 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，絲膠蛋白水凝膠是良好的3D生物支架，可以支持細(xì)胞在體內(nèi)正常生 長(zhǎng)，有應(yīng)用于骨組織損傷修復(fù)的潛力。
[0149] 實(shí)施例23絲膠蛋白水凝膠應(yīng)用于全皮層損傷的修復(fù) 一、實(shí)驗(yàn)過程 1.剪去BALB/c小鼠背部直徑為1.2 cm全層皮膚； 2 ·將1中BALB/c小鼠隨機(jī)分為三組：Tegaderm組，Tegaderm+皮耐克組，Tegaderm+ SMH-2 組； 3. 于治療后第7、14、21天觀察傷口恢復(fù)情況； 4. 將3中傷口處皮膚切除進(jìn)行H&E、Mass〇n染色。
[0150]二、實(shí)驗(yàn)分析 1. 如圖13A、B所示，SMH-2組BALB/c小鼠傷口尺寸在第7、14、21天明顯小于其他兩組； 2. H&E、Masson(圖13C)結(jié)果表明SMH-2修復(fù)組恢復(fù)程度明顯較其他兩組好； 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明本申請(qǐng)制備的絲膠蛋白水凝膠有較好的傷口修復(fù)效果，可用作傷口 修復(fù)材料使用應(yīng)用于全皮層損傷的修復(fù)。
[0151] 實(shí)施例24再生組織炎性檢測(cè) 一、實(shí)驗(yàn)過程 1.剪去BALB/c小鼠背部直徑為Icm2全層皮膚； 2 ·將1中BALB/c小鼠隨機(jī)分為三組：Tegaderm組，Tegaderm+皮耐克組，Tegaderm+ SMH-2 組； 3.于治療后第14天切除傷口處皮膚，進(jìn)行⑶68染色。
[0152] 二、實(shí)驗(yàn)分析 I. CD68、ΜΡ0染色及統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖14A、B、C所示，SMH-2組小鼠皮膚傷口附近炎性較其 他兩組輕。說明本申請(qǐng)制備的絲膠蛋白水凝膠作為傷口修復(fù)材料不會(huì)使損傷組織產(chǎn)生嚴(yán)重 的炎性反應(yīng)。
[0153] 實(shí)施例25再生組織新生血管化檢測(cè) 一、實(shí)驗(yàn)過程 1.剪去BALB/c小鼠背部直徑為Icm2全層皮膚； 2 ·將1中BALB/c小鼠隨機(jī)分為三組：Tegaderm組，Tegaderm+皮耐克組，Tegaderm+ SMH-2 組； 3.于治療后第14天切除傷口處皮膚，進(jìn)行VEGFR、⑶31、a-SMA染色。
[0154] 二、實(shí)驗(yàn)分析 I. VEGFR、⑶31、a-SMA染色及統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖15A、B、C和圖16A、B所示，SMH-2組小鼠皮膚 傷口附近新生血管的再生較其他兩組多。說明本申請(qǐng)制備的絲膠蛋白水凝膠作為傷口修復(fù) 材料可促使損傷組織血管的快速再生。
[0155] 實(shí)施例26再生組織瘢痕化檢測(cè) 一、實(shí)驗(yàn)過程 1.剪去BALB/c小鼠背部直徑為Icm2全層皮膚； 2 ·將1中BALB/c小鼠隨機(jī)分為三組：Tegaderm組，Tegaderm+皮耐克組，Tegaderm+ SMH-2 組； 3. 于治療后第21天切除傷口處皮膚，進(jìn)行H&E染色并統(tǒng)計(jì)再生組織中毛囊個(gè)數(shù)及皮膚 厚度。
[0156]二、實(shí)驗(yàn)分析 1. H&E染色及實(shí)物拍照結(jié)果如圖17A、B所示，SMH-2組小鼠再生皮膚組織的形態(tài)較其他 兩組更接近于正常組織； 2. SMH-2組小鼠再生皮膚組織的毛囊個(gè)數(shù)明顯多于其他兩組； 3.SMH-2組小鼠再生皮膚組織的皮膚厚度明顯薄于其他兩組； 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明絲膠蛋白水凝膠是性能良好的全皮層損傷修復(fù)材料，可有效減少瘢痕 組織的生成及有效促進(jìn)毛囊的再生。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠的制備方法，包括以下步驟： 1) 甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白的制備： 將絲膠蛋白粉末以0.02-1 g/mL的比例溶解于10-100 mL的pH 7.4~9.0磷酸緩沖液 中，再按照每克絲膠蛋白加入0.1-1 g的比例滴加甲基丙烯酸酐，置于20~45°C下反應(yīng)0.5~ 36小時(shí);將反應(yīng)溶液透析12~72小時(shí)，凍干得到甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白粉末； 2) 甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液的配制 將步驟1)獲得的甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白粉末溶于去離子水或PBS或培養(yǎng)基中，制 成濃度為1-400 g/L甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液； 3) 光引發(fā)劑Irgacure 2959溶液的配制 取1 g Irgacure 2959分散于10-1000 mL去離子水中，加熱至80_100°C，制成濃度為 0.01~1 g/L 的 Irgacure 2959溶液； 4) 光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠的制備 按體積比1000/1~100/1將甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液與Irgacure 2959溶液混 合，通過紫外光照射得到所述光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述絲膠蛋白粉末由下法得到：將蠶繭剪 成碎片，用水清洗，去除水分;按每克蠶繭加入10-50 mL的0.01- 0.2 mol/L Na2C03水溶液， 在70-100°C條件下攪拌0.5-3小時(shí)，使絲膠蛋白溶解，得到絲膠蛋白溶液;離心去除所述絲 膠蛋白溶液中的不溶性物質(zhì)，透析12~72小時(shí)，獲得澄清絲膠蛋白溶液，凍干，得到絲膠蛋白 粉末;所述蠶繭為絲素缺陷型蠶繭、家蠶蠶繭或棹蠶蠶繭。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述絲膠蛋白粉末為提取的絲膠蛋白或 商品化絲膠蛋白；所述甲基丙烯基修飾的絲膠蛋白溶液濃度為1-400 g/L;所述Irgacure 2959溶液的濃度為1-10 g/L;使用的紫外光照射強(qiáng)度為3-10 mV/cm2,紫外光照射時(shí)間為 10-300秒。4. 由權(quán)利要求1-3所述任意方法得到的光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠。5. 權(quán)利要求4所述光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠作為熒光探針在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求4所述光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠在制備皮膚損傷，肌肉損傷，血管損傷，神經(jīng) 損傷，軟骨損傷，骨骼損傷或心肌損傷修復(fù)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求4所述光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠結(jié)合工具細(xì)胞、包裝相應(yīng)的治療因子或藥物 在制備組織修復(fù)產(chǎn)品、藥物載體中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求4所述絲膠蛋白水凝膠在制備生長(zhǎng)因子、藥物以及細(xì)胞的載體或支架中的 應(yīng)用。9. 絲膠蛋白水凝膠凍干支架，由權(quán)利要求4所述光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠冷凍24小時(shí)后 取出，再置于冷凍真空干燥機(jī)中干燥得到的絲膠蛋白水凝膠凍干支架。10. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述方法制備得到的光交聯(lián)絲膠蛋白水凝膠，其特征在于，該 絲膠蛋白水凝膠以任何形態(tài)或形式存在并應(yīng)用于制備生物醫(yī)藥材料。
【文檔編號(hào)】A61K49/00GK106075598SQ201610477682
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年9月22日
【發(fā)明人】王琳, 王征, 劉佳, 乞超, 徐魯明, 李琪琳, 劉興欣, 張劍, 常炳程
【申請(qǐng)人】華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院