gM的免疫球蛋白Fc區(qū)。最優(yōu)選地，其是衍生自已知增加配體 結(jié)合蛋白質(zhì)的半衰期的IgG的免疫球蛋白Fc。免疫球蛋白Fc可通過(guò)用具體蛋白酶處理天 然IgG來(lái)制備，或由利用重組技術(shù)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞來(lái)制備。優(yōu)選地，其是在大腸桿菌（E. coli) 中制備的重組人免疫球蛋白Fc0
[0154] 同時(shí)，IgG還可被細(xì)分為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4,并且在本發(fā)明中，這些子類(lèi)的 組合或雜合也是可以的。優(yōu)選地，IgG是IgG2和IgG4子類(lèi)，最優(yōu)選地，其是基本上不具有 效應(yīng)功能如補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性（CDC)的IgG4的Fc區(qū)。換句話(huà)說(shuō)，在本發(fā)明中用作藥物 載體的最優(yōu)選免疫球蛋白Fc區(qū)是衍生自人IgG4的非糖基化Fc區(qū)。人衍生的Fc區(qū)比非人 衍生的Fc區(qū)更優(yōu)選，非人衍生的Fc區(qū)可在人體內(nèi)充當(dāng)抗原并引起不期望的免疫應(yīng)答，如針 對(duì)該抗原生成新的抗體。
[0155] 在本發(fā)明中，可通過(guò)利用非肽基聚合物或通過(guò)基因重組技術(shù)制備胃泌酸調(diào)節(jié)素綴 合物。優(yōu)選地，可通過(guò)經(jīng)由非肽基聚合物將胃泌酸調(diào)節(jié)素連接至免疫球蛋白Fc區(qū)來(lái)制備綴 合物。
[0156] 非肽基聚合物可連接至胃泌酸調(diào)節(jié)素和免疫球蛋白Fc中的每一個(gè)。非肽基聚合 物的各個(gè)端可分別連接至免疫球蛋白Fc區(qū)和胃泌酸調(diào)節(jié)素衍生物的氨基或巰基。
[0157] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"胃泌酸調(diào)節(jié)素綴合物"指與天然胃泌酸調(diào)節(jié)素相比具有增加長(zhǎng) 期效果的胃泌酸調(diào)節(jié)素綴合物。長(zhǎng)期綴合物的實(shí)例包括但不限于，其中由天然胃泌酸調(diào)節(jié) 素的氨基酸序列中的氨基酸修飾、置換、添加或缺失產(chǎn)生的胃泌酸調(diào)節(jié)素衍生物連接至可 生物降解的聚合物如聚乙二醇（PEG)的綴合物、其中具有良好長(zhǎng)期性的蛋白質(zhì)如白蛋白或 免疫球蛋白連接至胃泌酸調(diào)節(jié)素的綴合物、其中具有在體內(nèi)結(jié)合于白蛋白的能力的脂肪酸 連接至胃泌酸調(diào)節(jié)素的綴合物、或其中胃泌酸調(diào)節(jié)素封裝在可生物降解的納米顆粒中的綴 合物。
[0158] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"非肽基聚合物"指包括通過(guò)任意共價(jià)鍵（代替肽鍵）相互連接 的兩個(gè)或更多個(gè)重復(fù)單元的生物相容性聚合物。在本發(fā)明中，非肽基聚合物可與非肽基連 接體互換地使用。
[0159] 用于通過(guò)常規(guī)框內(nèi)融合方法獲得的融合蛋白的肽連接體具有缺點(diǎn)：其容易被體內(nèi) 蛋白酶酶切，因此無(wú)法獲得通過(guò)載體增加活性藥物血清半衰期的期望效果。然而，在本發(fā)明 中，類(lèi)似于載體，可利用具有蛋白酶耐受性的聚合物來(lái)保持肽的血清半衰期。因此，任何非 肽基聚合物可無(wú)限制地用于本發(fā)明，只要其是具有上述功能的聚合物，即，具有體內(nèi)蛋白酶 耐受性的聚合物。非肽基聚合物具有如下范圍內(nèi)的分子量：1至l〇〇kDa，優(yōu)選1至20kDa。 本發(fā)明的連接至免疫球蛋白Fe區(qū)的非肽基聚合物可一種聚合物或不同聚合物的組合。
[0160] 用于本發(fā)明的非肽基聚合物可具有能夠結(jié)合于免疫球蛋白Fe區(qū)和蛋白質(zhì)藥物的 反應(yīng)基團(tuán)。處于非肽基聚合物兩端的反應(yīng)基團(tuán)優(yōu)選選自反應(yīng)性醛基、丙醛基、丁醛基、馬來(lái) 酰亞胺基和琥珀酰亞胺衍生物。
[0161] 琥珀酰亞胺衍生物可以是琥珀酰亞胺丙酸基、羥基琥珀酰亞胺基、琥珀酰亞胺基 羧基甲基、或琥珀酰亞胺基碳酸基。具體地，當(dāng)非肽基聚合物其兩端具有反應(yīng)性醛基時(shí)，非 具體反應(yīng)可被最小化，并且生理活性多肽和免疫球蛋白可分別有效結(jié)合于非肽基聚合物兩 端。通過(guò)利用醛鍵的還原性烷基化生成的最終產(chǎn)物遠(yuǎn)比通過(guò)酰胺鍵連接的更穩(wěn)定的。醛反 應(yīng)基團(tuán)在低pH下選擇性地結(jié)合于N端，并可在高pH如pH 9. 0下與賴(lài)氨酸殘基形成共價(jià)鍵。
[0162] 非肽基聚合物兩端的反應(yīng)基團(tuán)可以相同或不同。例如，非肽基聚合物可在一端具 有馬來(lái)酰亞胺基，并且另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。當(dāng)兩端具有反應(yīng)性羥基的聚乙二 醇用作非肽基聚合物時(shí)，可通過(guò)已知的化學(xué)反應(yīng)將羥基激活成多種反應(yīng)基團(tuán)，或可利用具 有市售的修飾過(guò)的反應(yīng)基團(tuán)的聚乙二醇制備本發(fā)明的長(zhǎng)效綴合物。
[0163] 本發(fā)明的綴合物可以是其中非肽基聚合物的各端分別連接至免疫球蛋白Fe區(qū)和 胃泌酸調(diào)節(jié)素衍生物的胺基或巰基的綴合物。
[0164] 同時(shí)，在本發(fā)明中，非肽基聚合物的兩端包括免疫球蛋白Fe區(qū)和蛋白質(zhì)藥物可結(jié) 合的反應(yīng)基團(tuán)。反應(yīng)基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于，醛基、丙醛基或丁醛基、馬來(lái)酰亞胺基、琥珀 酰亞胺衍生物（琥珀酰亞胺丙酸基、羥基琥珀酰亞胺基、琥珀酰亞胺基羧基甲基或琥珀酰 亞胺基碳酸基）及類(lèi)似物。
[0165] 處于作為非肽基聚合物的連接體的兩端的反應(yīng)基團(tuán)可以相同或不同。例如，非肽 基聚合物可在一端具有馬來(lái)酰亞胺基，并且在另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。例如，當(dāng) 非肽基聚合物在一端具有反應(yīng)性醛基并且在另一端具有反應(yīng)性馬來(lái)酰亞胺基時(shí)，非具體反 應(yīng)可被最小化，并且生理活性多肽和免疫球蛋白可有效結(jié)合于非肽基聚合物的兩端。可 用于本發(fā)明的非肽基聚合物可選自聚乙二醇、丙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、聚氧乙烯多 元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、可生物降解的聚合物如PLA(聚（乳酸））和 PLGA(聚乳酸-乙醇酸）、脂質(zhì)聚合物、幾丁質(zhì)、透明質(zhì)酸及其組合。優(yōu)選地，非肽基聚合物 是聚乙二醇。另外，本領(lǐng)域已知的其衍生物和可容易通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法制備的衍生物 被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0166] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，利用包括丙醛基一者或馬來(lái)酰亞胺基和醛基兩者的非 肽基聚合物PEG，通過(guò)將胃泌酸調(diào)節(jié)素或其衍生物經(jīng)由共價(jià)鍵連接至免疫球蛋白Fc區(qū)，合 成綴合物。
[0167] 本發(fā)明的綴合物與天然胃泌酸調(diào)節(jié)素相比具有良好的GLP-I受體和胰高血糖素 受體活性。而且，其上結(jié)合了 Fc區(qū)，該Fc區(qū)增加其體內(nèi)血液半衰期以長(zhǎng)期保持其體內(nèi)活性。
[0168] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"防腐劑"指用于防止由微生物污染引起異常反應(yīng)或分解的物 質(zhì)。本發(fā)明的液體制劑可進(jìn)一步包括防腐劑。防腐劑通常用于最有可能被微生物污染的多 劑量制劑，但并不限于此，并且也可用于低壓凍干的制劑或單劑量制劑以預(yù)防微生物污染。 本發(fā)明的液體制劑可包括選自間甲酚、苯酚和芐醇的一種或多種防腐劑。液體制劑中的防 腐劑濃度可以為0.001-1% (w/v)。具體地，本發(fā)明的液體制劑包括的防腐劑優(yōu)選是間甲 酚。本發(fā)明的液體制劑可以是多劑量制劑。
[0169] 另一方面，本發(fā)明提供制備長(zhǎng)期胃泌酸調(diào)節(jié)素綴合物的液體制劑的方法。
[0170] 具體地，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，制備液體制劑的方法可包括步驟：a)制備 長(zhǎng)期胃泌酸調(diào)節(jié)素綴合物；和b)將制備的長(zhǎng)期胃泌酸調(diào)節(jié)素綴合物與包含緩沖劑、糖醇和 非離子表面活性劑的穩(wěn)定劑混合。
[0171] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，制備液體制劑的方法可包括步驟：a)制備長(zhǎng)期胃泌 酸調(diào)節(jié)素綴合物；和b)將制備的長(zhǎng)期胃泌酸調(diào)節(jié)素綴合物與包含緩沖劑、糖醇和非離子表 面活性劑的穩(wěn)定劑和防腐劑混合。
[0172] 優(yōu)選地，步驟b)中的穩(wěn)定劑可進(jìn)一步包括選自等滲劑、糖、多元醇和氨基酸的一 種或多種。
[0173] 再一方面，本發(fā)明提供預(yù)防或治療肥胖或糖尿病的藥物組合物，其包括上述液體 制劑。
[0174] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"預(yù)防"指抑制或延遲目標(biāo)疾病發(fā)展的一切行為。如本文所用， 術(shù)語(yǔ)"預(yù)防"意為給予本發(fā)明的綴合物以抑制或延遲糖尿病狀況，如異常血糖水平或異常隔 離分泌或肥胖狀況如體重或身體脂肪增加的發(fā)展。
[0175] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"治療"指緩解、改善或減輕已患疾病的癥狀的一切行為。如本 文所用，術(shù)語(yǔ)"治療"意為給予本發(fā)明的綴合物以緩解、改善或減輕上述糖尿病狀況或肥胖 狀況，以正?；撬胶鸵葝u素分泌和減少體重或身體脂肪。
[0176] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"肥胖"指身體脂肪過(guò)量。25或更高的身體質(zhì)量指數(shù)（=體重 (kg)除以身高（m))被定義為肥胖。肥胖通常源自能量攝入超過(guò)能量消耗的能量失衡。肥 胖是影響整個(gè)身體并且很有可能導(dǎo)致糖尿病和高脂血的代謝疾病。另外，肥胖與性功能障 礙、關(guān)節(jié)炎、和心血管疾病發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，并且在一些情況下也與癌癥的發(fā)展相關(guān)。
[0177] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"糖尿病"是一種代謝疾病，其中胰島素分泌不足或不發(fā)揮正常 功能。糖尿病的特征在于血糖水平增加，并且引發(fā)多種健康問(wèn)題。在糖尿病的情況下，葡萄 糖隨尿液排出。
[0178] 本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體，賦形劑或稀釋劑。如本 文所用，術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的"意為足以呈現(xiàn)治療性效果并且不產(chǎn)生副作用的量。本發(fā)明 的藥物組合物的活性成分劑量可根據(jù)疾病類(lèi)型、患者年齡、體重、健康狀況、性別、和藥物敏 感性、給藥途徑、給藥模式、給藥頻率、治療持續(xù)時(shí)間、與本發(fā)明的組合物組合或同時(shí)使用的 藥物、和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已知的其他因素由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定。
[0179] 再一方面，本發(fā)明提供預(yù)防或治療肥胖或糖尿病的方法，包括給予對(duì)象液體制劑。
[0180] 在此，液體制劑、肥胖和糖尿病如上所述。
[0181] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"對(duì)象"指疑患肥胖或糖尿病的對(duì)象。具體地，該術(shù)語(yǔ)意為患有 上述疾病或具有上述疾病的發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)的哺乳動(dòng)物，包括人、大鼠和家養(yǎng)動(dòng)物。另外，對(duì)象可 以是任何可通過(guò)本發(fā)明的液體制劑衍生物治療的對(duì)象。
[0182] 本發(fā)明的治療方法可包括給予藥學(xué)有效量的包括液體制劑的藥物組合物。該組合 物的每日總劑量可通過(guò)醫(yī)師的適當(dāng)醫(yī)學(xué)判斷來(lái)確定，并且該組合物可被給予一次或數(shù)次。 然而，基于本發(fā)明的目的，對(duì)于任何具體患者而言，組合物的具體治療有效劑量可根據(jù)醫(yī)學(xué) 領(lǐng)域公知的各種因素而不同，該因素包括待實(shí)現(xiàn)的響應(yīng)的種類(lèi)和程度、具體組合物一一根 據(jù)是否有其他試劑一起使用、患者年齡、體重、健康狀況、性別和飲食、給藥時(shí)間和途徑、組 合物分泌速率、治療持續(xù)時(shí)間、與本發(fā)明的組合物組合或同時(shí)使用的其他藥物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域 已知的其他因素。
[0183] 發(fā)明有利效果
[0184] 包括長(zhǎng)期胃泌酸調(diào)節(jié)素綴合物的本發(fā)明液體制劑包括緩沖劑、糖醇和非離子型表 面活性劑，并且不包含人血清白蛋白和可能對(duì)人體有害的因子，因此不易受病毒感染。另 外，本發(fā)明的胃泌酸調(diào)節(jié)素綴合物包括連接至免疫球蛋白Fc區(qū)的胃泌酸調(diào)節(jié)素，因此與天 然胃泌酸調(diào)節(jié)素相比具有大的分子量、延長(zhǎng)的生理活性、和良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
[0185] 附圖簡(jiǎn)述
[0186] 圖Ia是顯示通過(guò)SOURCE S純化柱純化單PEG化的胃泌酸調(diào)節(jié)素衍生物（SEQ ID NO :25)而獲得的結(jié)果的圖。
[0187] 圖Ib是顯示通過(guò)SOURCE 15Q純化柱純化單PEG化的胃泌酸調(diào)節(jié)素衍生物（SEQ ID NO :25)和免疫球蛋白Fc的綴合物而獲得的結(jié)果的圖。
[0188] 圖Ic是顯示通過(guò)SOURCE ISO純化柱純化單PEG化的胃泌酸調(diào)節(jié)素衍生物（SEQ ID NO :25)和免疫球蛋白Fc的綴合物而獲得的結(jié)果的圖。
[0189] 圖2a是顯示在25°C下儲(chǔ)存0-2周后在實(shí)施例3中通過(guò)IE-HPLC評(píng)價(jià)長(zhǎng)期胃泌酸 調(diào)節(jié)素綴合物根據(jù)PH的穩(wěn)定性而獲得的結(jié)果的圖形圖。圖2a中的各圖顯示長(zhǎng)期胃泌酸調(diào) 節(jié)素綴合物相對(duì)于起始值的保留百分比。
[0190] 圖2b是顯示在25°C下儲(chǔ)存0-2周后在實(shí)施例3中通過(guò)SE-HPLC評(píng)價(jià)長(zhǎng)期胃泌酸 調(diào)節(jié)素綴合物根據(jù)pH的穩(wěn)定性而獲得的結(jié)果的圖形圖。圖2b中的各圖顯示長(zhǎng)期胃泌酸調(diào) 節(jié)素綴合物相對(duì)于起始值的保留百分比。
[0191] 圖2c是顯示在25°C下儲(chǔ)存0-2周后在實(shí)施例3中通過(guò)RP-HPLC評(píng)價(jià)長(zhǎng)期胃泌酸 調(diào)節(jié)素綴合物根據(jù)PH的穩(wěn)定性而獲得的結(jié)果的圖形圖。圖2c中的各圖顯示長(zhǎng)期胃泌酸調(diào) 節(jié)素綴合物相對(duì)于起始值的保留百分比。
[0192] 圖3a是顯示在25°C下儲(chǔ)存0-4周后在實(shí)施例4中通過(guò)IE-HPLC評(píng)價(jià)長(zhǎng)期胃泌酸 調(diào)節(jié)素綴合物根據(jù)糖醇種類(lèi)和等滲劑存在與否的穩(wěn)定性而獲得的結(jié)果的圖形圖。圖3a中 的各圖顯示長(zhǎng)期胃泌酸調(diào)節(jié)素綴合物相對(duì)于起始值的保留百分比。
[0193] 圖3b是顯示在25°C下儲(chǔ)存0-4周后在實(shí)施例4中通過(guò)SE-HPLC評(píng)價(jià)長(zhǎng)期胃泌酸 調(diào)節(jié)素綴合物根據(jù)糖醇種類(lèi)和等滲劑存在與否的穩(wěn)定性而獲得的結(jié)果的圖形圖。圖3b中 的各圖顯示長(zhǎng)期胃泌酸調(diào)節(jié)素綴合物相對(duì)于起始值的保留百分比。
[0194] 圖3c是顯示在25°C下儲(chǔ)存0-4周后在實(shí)施例4中通過(guò)RP-HPLC評(píng)價(jià)長(zhǎng)期胃泌酸 調(diào)節(jié)素綴合物根據(jù)糖醇種類(lèi)和等滲劑存在與否的穩(wěn)定性而獲得的結(jié)果的圖形圖。圖3c中 的各圖顯示長(zhǎng)期胃泌酸調(diào)節(jié)素綴合物相對(duì)于起始值的保留百分比。
[0195] 圖4a是顯示在25°C下儲(chǔ)存0-4周后在實(shí)施例5中通過(guò)IE-HPLC評(píng)價(jià)長(zhǎng)期胃泌酸 調(diào)節(jié)素綴合物根據(jù)糖醇濃度的穩(wěn)定性而獲得的結(jié)果的圖形圖。圖4a中的各圖顯示長(zhǎng)期胃 泌酸調(diào)節(jié)素綴合物相對(duì)于起始值的保留百分比。
[0196] 圖4b是顯示在25°C下儲(chǔ)存