包括胃泌酸調節(jié)素和免疫球蛋白片段的蛋白質綴合物的液體制劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及包括長期（long-lasting)胃泌酸調節(jié)素綴合物的不含白蛋白的液體 制劑，其中包括胃泌酸調節(jié)素衍生物、變體、前體或片段的胃泌酸調節(jié)素肽連接至免疫球蛋 白Fc區(qū)，其與天然胃泌酸調節(jié)素相比可增加長期胃泌酸調節(jié)素綴合物的生理活性持續(xù)時 間和長期保持其體內穩(wěn)定性。本發(fā)明還涉及制備該液體制劑的方法。
【背景技術】
[0002] 肥胖被定義為異?；蜻^度脂肪積累的情況，其可損害健康并且源于能量攝入超過 能量消耗的能量失衡。肥胖在過去不是嚴重的健康問題，但隨著經(jīng)濟增長，肥胖人群隨經(jīng) 濟富裕增加而增加，并且各種肥胖相關疾病的數(shù)量也逐漸增加。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO)的報告，世界上超過15億成年人超重，其中超過5億肥胖，并 且肥胖人群在1980和2008之間增加約兩倍（世界衛(wèi)生組織，F(xiàn)act sheet on obesity and overweight，2011)。不僅在高收入國家，而且在低收入國家中肥胖人群的百分比目前也在 增加。超重和肥胖導致血壓和膽固醇水平增加，并且引起或惡化各種疾病。另外，肥胖問題 在兒童或青少年中更加嚴重，增加了糖尿病、心臟病、高血壓或高脂血的發(fā)病率，并且還可 導致死亡或殘疾。
[0003] 如上所述，肥胖是全球性疾病和社會問題，但在過去認為肥胖可通過個人努力被 克服，因此沒有特別重視肥胖治療。然而，肥胖并不容易治療，因為其是與食欲控制和能量 代謝機制相關的復雜疾病。因此，肥胖的治療不僅需要患者自身的努力，而且還需要能夠治 療與食欲控制和能量代謝相關的異常機制的方法。因此，已嘗試研發(fā)治療肥胖的藥物。
[0004] 這樣嘗試的結果是研發(fā)了包括利莫那班（Rimonabant) (Sanofi-Aventis)、西 布曲明（Sibutramine) (Abbott)、Contrave(Takeda)、奧利司他（Orlistat) (Roche)及 類似物的藥物，但這些藥物具有缺點，即其顯示胎兒副作用或具有不足的肥胖治療效 果。據(jù)報告，利莫那班（Sanofi-Aventis)顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙，西布曲明（Abbott)和 Contrave(Takeda)顯不心血管副作用，而奧利司他（Roche)顯不給予1年時僅約4kg的減 重效果。因此，當前很少或沒有肥胖治療劑可安全地被開處方給肥胖患者。
[0005] 近來，胰高血糖素衍生物已得到眾多關注。當血糖水平由于藥物治療、疾病、激素 或酶缺陷、或類似原因開始下降時，胰腺產(chǎn)生胰高血糖素。胰高血糖素作用以刺激肝細胞將 儲存的糖原分解成葡萄糖，然后釋放到血液中，以使血糖水平升高至正常水平。除增加血糖 水平的效果外，胰高血糖素據(jù)報告還抑制食欲和激活脂肪細胞的激素敏感性脂酶（HSL)以 促進脂解，從而顯示抗肥胖效果。在胰高血糖素衍生物中，胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)正在 作為降低糖尿病患者的高血糖的治療劑被研發(fā)，并且作用于刺激胰島素合成和分泌、抑制 胰高血糖素分泌、抑制胃排空、增加葡萄糖利用度和抑制食物攝入。已知從蜥蜴的毒液分離 的艾塞那肽-4 (exendin-4)與GLP-I具有約50%的氨基酸同源性，并且激活GLP-I受體以 降低糖尿病患者的高血糖。然而，肥胖治療性藥物，包括GLP-I，據(jù)報告會引起副作用，如嘔 吐和惡心。
[0006] 因此，作為GLP-I的替代品，能夠與兩種肽（GLP-1和胰高血糖素）的受體結合的 胃泌酸調節(jié)素正在受到關注。胃泌酸調節(jié)素是由前胰高血糖素（胰高血糖素的前體）制成 的肽，并且是有效的抗肥胖劑，因為其抑制食物攝入，如同GLP-1，促進飽腹感，并且顯示脂 解活性，如同胰高血糖素。
[0007] 基于胃泌酸調節(jié)素肽的雙重功能，關于肥胖治療藥物研發(fā)的研宄已積極進行。例 如，韓國專利登記號925017公開了用于治療人肥胖的口服、胃腸外、粘膜、直腸、皮下或透 皮藥物組合物，其包括胃泌酸調節(jié)素作為活性成分。然而，據(jù)報告，包括胃泌酸調節(jié)素的肥 胖治療劑具有短的體內半衰期，并且顯示低的肥胖治療效果，即使在一日三次以高劑量給 予這些治療劑時。因此，已嘗試通過修飾胃泌酸調節(jié)素增加胃泌酸調節(jié)素的體內半衰期或 肥胖治療效果。
[0008] 例如，雙重激動劑胃泌酸調節(jié)素（Merck)通過如下獲得：用D-絲氨酸置換胃泌酸 調節(jié)素的氨基酸2位處的L-絲氨酸以增加二肽基肽酶-IV (DPP-IV)耐受性，和附接膽固醇 部分至C端以增加血液半衰期。ZP2929 (Zealand)通過如下獲得：用D-絲氨酸置換胃泌酸 調節(jié)素的氨基酸2位處的L-絲氨酸以增加 DPP-IV耐受性，用丙氨酸置換氨基酸17位處的 精氨酸以增加蛋白酶耐受性，用賴氨酸置換氨基酸27位處的甲硫氨酸以增加氧化穩(wěn)定性， 和分別用天冬氨酸、丙氨酸和絲氨酸置換氨基酸20和24位處的谷氨酰胺以及氨基酸28位 處的天冬酰胺，以增加脫酰胺穩(wěn)定性。雙重激動劑胃泌酸調節(jié)素（Merck)具有1.7小時的 增加的體內半衰期，長于天然胃泌酸調節(jié)素的半衰期（8-12分鐘），但其仍具有很短的體內 半衰期，并且以數(shù)mg/kg的極高劑量被給予。因此，胃泌酸調節(jié)素或其衍生物具有兩個大劣 勢，即，半衰期短和醫(yī)療效果低。由于這些劣勢，其應每日以高劑量給予。為克服這些劣勢， 研宄增加胃泌酸調節(jié)素的血液半衰期同時保持其體內活性的方法，從而研發(fā)胃泌酸調節(jié)素 衍生物。另外，利用這種技術，通過結合載體至胃泌酸調節(jié)素衍生物制備非肽基聚合物，并 且發(fā)現(xiàn)蛋白質綴合物由于增加了其血液半衰期同時保持體內活性可顯示較好抗肥胖效果 (韓國專利申請?zhí)?0-2012-0064110)。
[0009] 通常，蛋白質和肽具有很短的半衰期，并且在暴露于各種因素如不適的溫度、 水-空氣界面、高壓、物理/機械應力、有機溶劑和微生物污染后由于單體聚集和血管表面 吸附發(fā)生變性如沉淀。這種變性是不可逆的，因此變性的蛋白質和肽喪失了內在的物理化 學性質和生理活性效果。另外，蛋白質和肽是不穩(wěn)定的，并且易受外在因素如溫度、濕度、 氧、UV射線或類似物影響，從而發(fā)生物理或化學變化，包括聯(lián)合、聚合或氧化，導致活性顯著 損失（韓國專利登記號10-0389726)。
[0010] 此外，被吸附的蛋白質和肽容易通過變性過程而聚集，并且變性的蛋白質和肽在 被給予人體時充當人體中抗體形成的誘因，因此，應給予足夠穩(wěn)定形式的蛋白質和肽。因 此，已研宄了防止溶液中的蛋白質和肽變性的不同方法（John Geigert, J. Parenteral Sci.Tech.，43, No5, 220-224，1989 ;David Wong，Pharm. Tech. October，34-48，1997 ; Wei Wang. , Int. J. Pharm. , 185, 129-188, 1999 ；Willem Nordej Adv. Colloid Interface Sci.，25, 267-340, 1986 ;Michelle et al.，Int. J. Pharm. 120, 179-188, 1995)。
[0011] 低壓凍干被應用于一些蛋白質和肽藥物以實現(xiàn)穩(wěn)定性目的。然而，低壓凍干的產(chǎn) 物的不便在于其必須被重新溶解在注射水中以使用。另外，在低壓凍干的情況下，需要對大 容量冷凍干燥機或類似物大量投資，因為低壓凍干過程被包括在生產(chǎn)過程中。進一步，利用 噴霧干燥器生產(chǎn)粉末狀蛋白質和肽的方法也在被應用，但在這種情況下，經(jīng)濟效益由于低 產(chǎn)率而減少，并且高溫暴露可不利地影響蛋白質的穩(wěn)定性。
[0012] 為克服這些限制，已進行這樣的研宄：其中穩(wěn)定劑被添加至溶液中的蛋白質和 肽，以抑制蛋白質和肽的物理化學變化，同時保持其體內效率一一即使在長期儲存后。人 血清白蛋白，一種蛋白質，已被廣泛用作各種蛋白質藥物的穩(wěn)定劑，并且其性能已被證實 (Edward Tarelli 等，Biologicals(1998)26,331-346) 〇
[0013] 純化人血清白蛋白的方法包括滅活生物污染物如支原體、朊病毒、細菌和病毒，和 篩選或檢查一種或多種生物污染物或病原體。然而，始終存在患者暴露于未完全去除或滅 活的生物污染物的風險。例如，篩選過程包括檢查來自供體的人血液是否包含某種病毒，但 這個過程不一定是可靠的。具體地，不能檢測到在極少數(shù)供體中存在的特定病毒。
[0014] 不同蛋白質由于其化學差異可在儲存過程中在不同條件下以不同速率被逐步滅 活。也就是說，通過穩(wěn)定劑對儲存期的延長對于不同蛋白質而言不是相同的。因此，用于提 供儲存穩(wěn)定性的穩(wěn)定劑的適當比例、濃度和種類根據(jù)目標蛋白質的物理化學性質而不同。 當穩(wěn)定劑組合使用時，由于其之間的競爭和相互作用，其可導致不同于期望效果的不利效 果。進一步，由于蛋白質的屬性或濃度可在儲存期間發(fā)生變化，所用的穩(wěn)定劑可顯示不同于 意圖的效果。因此，需要大量努力和措施來穩(wěn)定溶液中的蛋白質。
[0015] 具體地，胃泌酸調節(jié)素和免疫球蛋白Fc的綴合物是其中作為生理活性肽的胃泌 酸調節(jié)素連接于免疫球蛋白Fc區(qū)的綴合物。因此，由于綴合物的分子重量和體積肯定不同 于天然胃泌酸調節(jié)素，需要穩(wěn)定化蛋白質的特殊組合物。
[0016] 進一步，由于胃泌酸調節(jié)素（其是生理活性肽）和免疫球蛋白Fc區(qū)是具有不同物 理化學性質的肽或蛋白質，其應被同時穩(wěn)定化。然而，如上所述，不同蛋白質或蛋白質由于 其化學差異可在儲存期間在不同條件下以不同速率被逐步滅活，并且在適于蛋白質或肽的 穩(wěn)定劑組合使用時，由于其之間的競爭和相互作用，其可導致不同于期望效果的不利效果。 因此，在長期胃泌酸調節(jié)素綴合物的情況下，找到同時穩(wěn)定化作為生理活性肽的胃泌酸調 節(jié)素和免疫球蛋白Fc區(qū)的的組合物有很大的困難。
[0017] 在這種情況下，本發(fā)明人做出了大量努力以提供可長期儲存而不擔心病毒污染的 穩(wěn)定液體制劑，從而發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定劑，該穩(wěn)定劑包括緩沖劑、糖醇和非離子型表面活性劑，并 且可進一步包括添加劑如等滲劑或氨基酸和防腐劑以反復使用，可增加長期胃泌酸調節(jié)素 衍生物的穩(wěn)定性，并且可利用該穩(wěn)定劑制備成本有效且穩(wěn)定的液體制劑，從而完成本發(fā)明。
[0018] 公開內容
[0019] 技術問題
[0020] 本發(fā)明的一個目的是提供長期胃泌酸調節(jié)素綴合物的液體制劑，包括藥理學上有 效量的長期胃泌酸調節(jié)素綴合物，其中作為生理活性肽的胃泌酸調節(jié)素連接至免疫球蛋白 Fc區(qū)；和不含白蛋白的穩(wěn)定劑。
[0021] 本發(fā)明的另一目的是提供制備上述液體制劑的方法。
[0022] 本發(fā)明的再一目的是提供預防或治療肥胖或糖尿病的組合物，其包括液體胃泌酸 調節(jié)素綴合物制劑，該液體胃泌酸調節(jié)素綴合物制劑包括連接至免疫球蛋白Fc區(qū)的生理 活性肽胃泌酸調節(jié)素。
[0023] 本發(fā)明的再一目的是提供預防或治療肥胖或糖尿病的方法，包括給予對象上述液 體制劑。
[0024] 問題解決方案
[0025] 為實現(xiàn)以上目的，一方面，本發(fā)明提供長期胃泌酸調節(jié)素綴合物的液體制劑，包括 藥理學上有效量的長期胃泌酸調節(jié)素綴合物，其中作為生理活性肽的胃泌酸調節(jié)素連接至 免疫球蛋白Fc區(qū)；和不含白蛋白的穩(wěn)定劑，其中穩(wěn)定劑包含緩沖劑、糖醇和非離子型表面 活性劑。
[0026] 如本文所用，術語"液體制劑"指加工成液體形式的藥物制劑，并且意圖包括所有 液體內用制劑和外用制劑?，F(xiàn)有技術沒有報道適于藥理學上有效量的包括連接至免疫球蛋 白Fc結構域的胃泌酸調節(jié)素的胃泌酸調節(jié)素綴合物的本發(fā)明液體制劑。因此，本發(fā)明的液 體制劑可包括藥理學上有效量的胃泌酸調節(jié)素綴合物一一該胃泌酸調節(jié)素綴合物包括連 接至免疫球蛋白Fc結構域的胃泌酸調節(jié)素一一和不含白蛋白的穩(wěn)定劑，其中穩(wěn)定劑包含緩 沖劑、糖醇和非離子型表面活性劑。另外，本發(fā)明的液體制劑可進一步包括防腐劑。
[0027] 在本發(fā)明中，穩(wěn)定劑可進一步包括一種或多種組分，選自等滲劑、糖、多元醇和氨 基酸。糖醇可以是選自甘露醇、山梨醇和甘油的一種或多種，并且液體制劑中的糖醇濃度可 以為2-15% (w/v)。進一步，緩沖劑可以是選自檸檬酸鹽、乙酸鹽、組氨酸和磷酸鹽緩沖劑 的一種或多種，并且可具有4. 5至7. 0的pH范圍。等滲劑可以是氯化鈉，非離子型表面活 性劑可以是聚山梨醇酯或泊洛沙姆，并且可以0.001-0. 1% (w/v)的濃度存在。氨基酸可以 是甲硫氨酸。因此，本發(fā)明的液體制劑可包括穩(wěn)定劑，該穩(wěn)定劑包含pH范圍為4. 8至6. 0 的緩沖劑、選自甘露醇和山梨醇的一種或多種糖醇和聚山梨醇酯20。
[0028] 另外，本發(fā)明的液體制劑可進一步包括選自間甲酚、苯酚和芐醇的一種或多種防 腐劑。液體制劑中的防腐劑濃度可以為