專利名稱：泌酸調(diào)節(jié)肽類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在治療糖尿病和/或肥胖中使用的泌酸調(diào)節(jié)肽(Oxyntomodulinpeptide)類似物及其聚乙二醇化衍生物。
背景技術(shù)：
泌酸調(diào)節(jié)肽(OXM)是一種37個氨基酸的肽激素，其與胰高血糖素樣肽I (GLP-I)一起，與營養(yǎng)攝入成比例地自小腸的L細(xì)胞釋放。它由胰高血糖素(Gcg)的29殘基全長序列加上C末端上的8肽延伸所組成，是前胰高血糖素原的組織特異性可變剪接的結(jié)果。內(nèi)源OXM在體內(nèi)通過二肽基肽酶IV和其他肽酶快速降解。OXM的確切受體仍未得到鑒定。OXM在體外結(jié)合且充分活化GLP-I受體(GLP-IR)和胰高血糖素受體(GcgR)，在2種受體上具有相似效力。OXM涉及食物攝入和體重的調(diào)節(jié)。OXM急性施用于正常體重的人受試者降低饑餓且使進(jìn)餐量減少19%。在對超重和肥胖受試者的4周研究中，OXM的每天3次餐前皮下施用產(chǎn)生了 2. 3kg的重量減輕，相對地，安慰劑組中的重量減輕為O. 5kg。在這個試驗中，與基于GLP-I的治療(例如依澤那太(exenatide)和利拉魯肽(Iiraglutide))相關(guān)的最常見副作用一一惡心一顯著地不太普遍。OXM通過在超重和肥胖人中促進(jìn)增加的體力活動而增加了能量使用，盡管該效應(yīng)的機(jī)制并不明了。對于開發(fā)成為商業(yè)上可行的治療劑，OXM存在幾個挑戰(zhàn)。如上所述，它在體內(nèi)快速降解并且由于其小尺寸而發(fā)生快速地腎清除。因此，希望鑒定具有改善的代謝穩(wěn)定性和降低的清除率的OXM肽類似物。此外，OXM固有的GcgR激動劑活性是負(fù)面影響血糖控制(glycemic control)的一個危險因素。因此，還希望優(yōu)化設(shè)計用于治療用途的OXM肽類似物的效力，而在GLP-IR和GcgR的活性之間維持合適的平衡。GLP-IR的活化負(fù)責(zé)促胰島素效應(yīng)，而GLP-IR和GcgR兩者的活化可以在減重效應(yīng)中起作用。因此，希望產(chǎn)生具有有力的促胰島素活性且促進(jìn)重量減輕的OXM肽類似物，從而使得它可以用于治療非胰島素依賴性 糖尿病和/或肥胖。具有氨基酸置換以促進(jìn)穩(wěn)定性和具有另外修飾(例如聚乙二醇化或脂質(zhì)化)以減慢清除的 OXM 肽，公開于 WO 2008101017、W02006134340、W02007100535 和 Pocai 等人Diabetes 58:2258-2266，2009中。雖然這些OXM衍生的肽可能是超過野生型肽的潛在改善，但是在飲食誘導(dǎo)的肥胖(DIO)小鼠模型中達(dá)到相當(dāng)大的重量減少所需的劑量典型地高于對于藥物的商品化而言可以視為可行的劑量。例如，Pocai等人(2009)報道了在用1900nmol/kg ( 8mg/kg)每隔一天(QOD)給藥13天后平均Ilg (^25% )的重量減輕。盡管有多種OXM肽及其類似物可得，但仍需要更有力、穩(wěn)定、長效和充分耐受的OXM肽類似物,其具有已優(yōu)化的GcgR/GLP-lR活性比,從而使得肽的效力和促胰島素活性可以提供對糖尿病，優(yōu)選2型糖尿病，和相關(guān)病癥的有效治療。也期望提供其OXM肽類似物，所述類似物提供有效治療以減輕體重。因此，本發(fā)明尋求提供用于糖尿病和/或肥胖的有效療法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明包括具有氨基酸置換的OXM肽類似物，所述氨基酸置換被引入以優(yōu)化代謝活性和調(diào)節(jié)相對的GcgR/GLP-lR活性，同時優(yōu)化總體效力。此外，本發(fā)明的OXM肽類似物是在所選位置上聚乙二醇化的，以增強(qiáng)作用時間，從而允許頻率較低的給藥。本發(fā)明提供了包含如下氨基酸序列的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物I510 His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-(I-Nal)-Ser-Lys-Tyr-、
152025Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-3035(Aib)-Ala-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Xaa38-Xaa39 (SEQ ID NO 5)其中Xaa38 是 Cys、Cys-PEG 或不存在，Xaa39 是 Cys、Cys-PEG 或不存在，并且其中C末端氨基酸是任選酰胺化的。本發(fā)明提供了包含氨基酸序列的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物I510His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-(I-Nal)-Ser-Lys-Tyr-152025Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-3035(Aib)-Ala-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala (SEQ ID NO 1).此外，本發(fā)明提供了包含氨基酸序列的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物I510His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-(I-Nal)-Ser-Lys-Tyr-152025Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-3035(Aib)-Ala-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys-Cys(SEQ ID NO 2)其中在位置38上的Cys是任選聚乙二醇化的，并且其中在位置39上的Cys是任選聚乙二醇化的，且在位置39上的Cys的羧基基團(tuán)是任選酰胺化的。優(yōu)選地，SEQ ID NO 2的OXM肽類似物在位置38的Cys或在位置39的Cys上或在兩者上被聚乙二醇化，其中40kDa PEG分子共價連接到這些位置上的Cys殘基的巰基基團(tuán)。更優(yōu)選地，泌酸調(diào)節(jié)肽類似物在位置38和位置39的每個Cys殘基上都發(fā)生聚乙二醇化，其中20kDa PEG分子與在這些位置上的每個Cys殘基的各巰基基團(tuán)共價連接。任選地，在位置39上的Cys殘基可以從SEQ ID NO 2中缺失，留下在位置38上的用于聚乙二醇化的單個位點。更優(yōu)選的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物包含氨基酸序列I510His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-(I-Nal)-Ser-Lys-Tyr-
152025Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-3035(Aib)-Ala-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys(20kDa PEG)-Cys(20kDa PEG)(SEQ ID NO 3)其中在位置39上聚乙二醇化的Cys的羧基是任選酰胺化的。最優(yōu)選的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列，其中在位置39上聚乙二醇化的Cys的羧基是酰胺化的。在本發(fā)明中使用的PEG分子可以是線性或分支的，并且優(yōu)選是線性PEG分子。本發(fā)明提供了包含如上定義的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物和藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。另外，本發(fā)明提供了包含如上定義的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物，連同藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑和任選地其他治療成分的藥物組合物。此外，本發(fā)明提供了用于在有需要的受試者中治療非胰島素依賴性(2型)糖尿病的方法，其包括給有需要的受試者施用有效量的如上定義的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物。另外，本發(fā)明提供了用于在有需要的受試者中治療胰島素依賴性(I型)糖尿病的方法，其包括給有需要的受試者施用有效量的如上定義的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物。本發(fā)明包括在有需要的受試者中治療肥胖的方法，其包括給有需要的受試者施用有效量的如上定義的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物。此外，本發(fā)明包括治療有需要的受試者中的非胰島素依賴性糖尿病和肥胖的方法，其包括給有需要的受試者施用有效量的如上定義的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物。本發(fā)明提供了如上定義的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物用作藥物。 另外，本發(fā)明提供了如上定義的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物用于在非胰島素依賴性糖尿病治療中使用。此外，本發(fā)明提供了如上定義的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物用于在胰島素依賴性糖尿病治療中使用。此外，本發(fā)明提供了如上定義的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物用于在肥胖治療中使用。本發(fā)明包括如上定義的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物用于在非胰島素依賴性糖尿病和肥胖治療中使用。本發(fā)明提供了如上定義的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物在制備用于治療非胰島素依賴性糖 尿病的藥物中的用途。另外，本發(fā)明包括如上定義的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物在制備用于治療胰島素依賴性糖尿病的藥物中的用途。此外，本發(fā)明提供了如上定義的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物在制備用于治療肥胖的藥物中的用途。此外，本發(fā)明提供了如上定義的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物在制備用于治療非胰島素依賴性糖尿病和肥胖的藥物中的用途。本發(fā)明的OXM肽類似物有效結(jié)合且活化GLP-I受體(GLP-IR)和胰高血糖素受體(GcgR)兩者。還已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的OXM肽類似物對肽酶，特別是二肽基肽酶IV，的降解比天然人OXM更有抵抗力。因此，本發(fā)明的OXM肽類似物具有與天然人OXM比較改善的體內(nèi)穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明的多個實施方案能夠在超重和肥胖受試者中引起食物攝入的減少。本發(fā)明的一個特別優(yōu)點是，與基于GLP-I的治療，例如依澤那太和利拉魯肽，通常相關(guān)的副作用，例如惡心，的頻率被減少或消除。本發(fā)明因此具有與基于GLP-I的治療比較減少的副作用。本發(fā)明的OXM肽類似物還具有與野生型人OXM比較更好的重量減輕效應(yīng)。發(fā)明詳述泌酸調(diào)節(jié)肽(OXM)是對hGLP-lR和hGcgR具有完全功效和平衡效力的弱共激動劑，其在穩(wěn)定超表達(dá)相應(yīng)受體的HEK293細(xì)胞中分別具有約6. 7±2. 7nM和4. 1±1. 7nM的EC5tl值。天然人OXM的序列在下文給出 His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala (SEQ ID NO 4)其中在位置39上的Cys (PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO 3的OXM肽類似物是完全有效和有力的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物，其針對hGcgR和hGLP-lR分別具有60. O ±2. 97nM和
6.58±O. 87nM的EC50。其中在位置39上的Cys (PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO 3的OXM肽類似物具有平衡的體外功能活性，與hGcgR比較，其對hGLP-lR具有大、倍的選擇性。對于結(jié)合親和力Ki，觀察到相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果，其中與hGcgR比較，位置39上的Cys (PEG20k)是酰胺化的SEQ ID NO 3的OXM肽類似物對于hGLP-lR具有大3. 6倍的選擇性，Ki值分別為1540±158nM 和 5500±350nM。一個或多個PEG分子與OXM肽類似物的特定殘基的共價附著導(dǎo)致聚乙二醇化的OXM肽類似物，該聚乙二醇化的OXM肽類似物，當(dāng)與非聚乙二醇化的OXM肽類似物比較時，具有延長的半衰期和降低的清除率，并且對GLP-IR的體外效力類似于天然人OXM的?？紤]到OXM肽類似物的小尺寸以及PEG分子(一個或多個)的相對大尺寸，預(yù)期OXM肽類似物，一旦聚乙二醇化后，將由于空間位阻而喪失活性。然而，已發(fā)現(xiàn)，如果置于泌酸調(diào)節(jié)肽類似物的末端而不是中間，那么肽類似物的活性可以更大程度地保留。在序列中的幾個置換可以增強(qiáng)效力，從而抵消由于聚乙二醇化而引起的效力喪失，同時維持對GLP-IR和GcgR的合適活性比。此外，已發(fā)現(xiàn)，在OXM肽類似物的C末端上2個PEG分子的存在比單個PEG更優(yōu)選。本發(fā)明的序列含有用于20種天然存在的氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母或三字母代碼。使用的其他代碼如下定義d或D=相應(yīng)氨基酸的D同種型(非天然存在的)，例如D-Ser=D-絲氨酸，dS=D_絲
氨酸Aib=Q氨基異丁酸I-Nal=I-萘基丙氨酸PEG=聚乙二醇PEG20K=具有20，OOODa的平均分子量的PEG分子如本文使用的，術(shù)語“PEG”意指聚乙二醇分子。以其典型形式，PEG是具有末端羥基的線性聚合物且具有式HO-CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH,其中η是約8至約4000。一般地，η不是離散值，而是構(gòu)成一個在平均值周圍具有近似高斯分布的范圍。末端氫可以由封端基團(tuán)例如烷基或烷醇基團(tuán)置換。優(yōu)選地，PEG具有至少一個羥基，更優(yōu)選它是末端羥基。該羥基優(yōu)選附著至接頭部分，所述接頭部分可以與肽反應(yīng)以形成共價連接。本領(lǐng)域中存在PEG的眾多衍生物。(參見例如，美國專利號=5,445,090 ;5，900，461 ;5，932，462 ;6，436，386 ；6，448，369 ;6，437，025 ;6，448，369 ;6，495，659 ;6，515，100 和 6，514，491 和 Zalipsky,
S.Bioconjugate Chem. 6:150-165,1995)。與本發(fā)明的OXM肽共價連接的PEG分子可以是約10，000,20, 000,30, 000或40，000道爾頓平均分子量。PEG分子優(yōu)選是18，000-22，000道爾頓。更優(yōu)選地，它是19，000-21，000道爾頓。最優(yōu)選地，它是20，000-21，000道爾頓。它甚至更加優(yōu)選是約20，000道爾頓。聚乙二醇化試劑可以是線性或分支分子，并且可以單個地或串聯(lián)地存在。本發(fā)明的聚乙二醇化OXM肽類似物優(yōu)選具有附著至肽的C末端的串聯(lián)PEG分子。PEG分子優(yōu)選通過mPEG-20kDa馬來酰亞胺(圖I)或mPEG_20kDa碘乙酰胺(圖2)，附著至位于肽C末端的2個半胱氨酸殘基上。在圖I和圖2中，η是10至2500。優(yōu)選地，η是350至600。更優(yōu)選地，η是425至475。
權(quán)利要求
1.一種泌酸調(diào)節(jié)肽類似物，其包含氨基酸序列His-(D-Scr)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-(I-Nal)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asn-(Aib)-Ala-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Xaa38-Xaa39 (SEQ ID NO 5) 其中Xaa38是Cys、Cys-PEG或不存在；Xaa39是Cys、Cys-PEG或不存在； 并且其中C末端氨基酸是任選酰胺化的。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物，其包含氨基酸序列His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-(I-Nal)-Ser-Lys-Tyr-Lcu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Lcu-Leu-Asn-(Aib)-Ala-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys-Cys(SEQ ID NO 2) 其中在位置38上的Cys殘基是任選聚乙二醇化的；并且其中在位置39上的Cys殘基是任選聚乙二醇化的；并且在位置39上的Cys的羧基是任選酰胺化的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物，其中所述類似物在位置38或位置39的Cys殘基的巰基上由約40kDa PEG分子進(jìn)行聚乙二醇化。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物，其中所述類似物在位置38和39的2個Cys殘基的巰基上各自由約20kDa PEG分子進(jìn)行聚乙二醇化，并且包含氨基酸序列His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-(I-Nal)-Ser-Lys-Tyr-Lcu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Gln-Trp-Lcu-Lcu-Asn-(Aib)-Ala-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-Cys(PEG20k)-Cys(PEG20k)(SEQ ID NO 3) 其中在位置39上的Cys殘基的羧基是任選酰胺化的。
5.根據(jù)權(quán)利要求I- 4中任一項的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物，其中所述PEG分子是線性的。
6.根據(jù)權(quán)利要求I- 5中任一項的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物，其中在位置39上的Cys殘基的羧基是酰胺化的。
7.根據(jù)權(quán)利要求I的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物，其中在位置39上的Cys殘基不存在，并且在位置38上的Cys殘基由約40kDa PEG分子聚乙二醇化，并且是任選酰胺化的。
8.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求I - 7中任一項的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物，和藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
9.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求I - 7中任一項的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物，連同藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑和任選地其他治療成分。
10.一種治療有需要的受試者中的非胰島素依賴性糖尿病的方法，其包括給有需要的所述受試者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求I - 7中任一項的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物。
11.一種治療有需要的受試者中的肥胖的方法，其包括給有需要的所述受試者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求I - 7中任一項的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物。
12.—種治療有需要的受試者中的非胰島素依賴性糖尿病或肥胖的方法，其包括給有需要的所述受試者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求I - 7中任一項的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物。
13.根據(jù)權(quán)利要求I- 7中任一項的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物，用作藥物。
14.根據(jù)權(quán)利要求I- 7中任一項的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物，用于在非胰島素依賴性糖尿病治療中使用。
15.根據(jù)權(quán)利要求I- 7中任一項的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物，用于在肥胖治療中使用。
16.根據(jù)權(quán)利要求I - 7中任一項的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物，用于在非胰島素依賴性糖尿病或肥胖治療中使用。
全文摘要
本發(fā)明提供可以用于治療糖尿病和/或肥胖的泌酸調(diào)節(jié)肽類似物。
文檔編號A61K38/17GK102665752SQ201080058422
公開日2012年9月12日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者J·阿爾西納-費爾南德斯, W·D·科恩 申請人:伊萊利利公司