專利名稱：一種用于減肥降脂的轉(zhuǎn)化體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及以胃泌酸調(diào)節(jié)素基因?yàn)橥庠椿虻霓D(zhuǎn)化體。
背景技術(shù)：
肥胖是當(dāng)今世界倍受關(guān)注的一個(gè)健康問題。歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，超過半數(shù)的人體重超標(biāo)，其
中20 30%的人是肥胖患者。肥胖不僅影響行動(dòng)和生活質(zhì)量，并且可引發(fā)心血管疾病、2型 糠尿病和腎臟疾病等一系列疾病，對(duì)人體健康危害極大。有統(tǒng)計(jì)表明，體重指數(shù)(body mass index, BMI)每增加1個(gè)單位，高血壓病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)就增加10%。
雖然肥胖的發(fā)病原因有多種，遺傳、內(nèi)分泌失調(diào)、飲食結(jié)構(gòu)和生活方式等因素都可以誘 發(fā)肥胖。但是絕大多數(shù)肥胖患者都是由于不良的飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣所致的單純性肥胖。目 前，肥胖癥的治療方法主要有飲食行為療法、藥物治療和手術(shù)治療等。節(jié)食和增加運(yùn)動(dòng)量等 飲食行為療法減肥效果不好，容易反復(fù)， 一般人難于長(zhǎng)期堅(jiān)持。手術(shù)治療創(chuàng)傷大，風(fēng)險(xiǎn)高， 不易為人接受。因此，多數(shù)肥胖患者傾向于接受藥物治療。
目前的減肥藥物有化學(xué)藥物和中草藥。其中化學(xué)藥物一般是通過作用于神經(jīng)中樞抑制食 欲來達(dá)到減肥的目的，如芬特明(Phentermine)、芬氟拉明(Dexfenfluramine)和鹽酸西布曲 明(Sibntramine)等，但是這些藥物有導(dǎo)致5-羥色胺綜合征，出現(xiàn)精神狀態(tài)改變(如焦慮不 安、躁狂等)副作用，甚至?xí)l(fā)高血壓和心絞痛。胰脂肪酶抑制劑奧利司他(orlistat，商 品名xenical，賽尼可)也是一種化學(xué)減肥藥物，可阻斷脂肪酶對(duì)三酰甘油的水解，抑制脂肪 吸收，但有引起脂肪腹瀉和導(dǎo)致脂溶性維生素缺乏的副作用。減肥中草藥多以植物提取物和 膳食纖維為主，主要通過潤(rùn)腸通便、限食促排來達(dá)到減肥目的，長(zhǎng)期服用會(huì)引起營(yíng)養(yǎng)失衡、 水電解質(zhì)紊亂和乏力等癥狀。
胃泌酸調(diào)節(jié)素(OXM )是腸上皮L一細(xì)胞分泌的一種短肽腸激素。它由胰高血糖素原 (proglucagon)基因編碼，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過多種不同的剪接，可以形成腸高血糖素(licentin)、 0XM、胰高血糖素樣肽一1 (glucagon-like p印tide 1, GLP-1)和GLP-2等多種活性腸肽激素。 人0XM含37個(gè)氨基酸殘基，具有抑制食物吸收和食欲、動(dòng)員脂肪的作用。OXM的表達(dá)與肥胖發(fā) 病有密切的關(guān)系。肥胖患者OXM分泌下降，而厭食癥(如熱帶腹瀉，空腸切除術(shù)后)0XM的分 泌則增加。OXM可以通過三條途徑調(diào)節(jié)食欲和能量攝取.. 一是直接作用于胃腸道粘膜上皮細(xì)胞 GLP-1受體，抑制糖和脂肪的吸收；二是作用于迷走神經(jīng)，下調(diào)胃生長(zhǎng)素的分泌，抑制食欲；
研究顯示，皮下注射OXM可使嚙齒動(dòng)物血液中的胃生長(zhǎng)素下降20X，而人類可下降到44%;三是通過甲狀腺途徑刺激甲狀腺素的合成分泌，增加能量消耗，動(dòng)員脂肪。嚙齒動(dòng)物腦室注射 或皮下注射OXM可降低食物吸收和體重，減少脂肪。在英國(guó)對(duì)26名肥胖患者進(jìn)行雙盲試驗(yàn)，受 試者餐前30分鐘皮下注射OXM，為期4周。結(jié)果顯示，治療組體重減輕了2.3kg，而對(duì)照組只減 輕了0.5kg，對(duì)受試者食性和味覺沒有影響。英國(guó)的菲亞克斯(Thiakis)公司化學(xué)合成了OXM 類似肽TKS1225，已進(jìn)入到臨床III期研究階段，美國(guó)的惠氏(Wyeth)醫(yī)藥公司出資購(gòu)買了 TKS1225的獨(dú)占使用權(quán)，有望近年內(nèi)將TKS1225開發(fā)成減肥新藥。目前，TKS1225等0XM類似肽 一般通過化學(xué)合成或生物工程生產(chǎn)，產(chǎn)品多為粉針劑，通過注射途徑給藥。這種生產(chǎn)和給藥 方式存在生產(chǎn)成本高、體內(nèi)半衰期短和用藥不便的缺點(diǎn)，不易被肥胖患者接受。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種胃泌酸調(diào)節(jié)素基因轉(zhuǎn)化體。 本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案是
一種用于減肥降脂的轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體由人胃泌酸調(diào)節(jié)素基因的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化益生 菌獲得，其中，
所述的人胃泌酸調(diào)節(jié)素基因的重組表達(dá)質(zhì)粒是將編碼人胃泌酸調(diào)節(jié)素的基因片段克隆到 以阿拉伯糖操縱子為啟動(dòng)子的原核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)區(qū)得到；
所述的益生菌是指能改善人或動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡，有利于健康的非致病菌，如雙歧桿 菌(包括長(zhǎng)型、短型、兩歧型、嬰兒型、青春型等各種亞型雙歧桿菌)或乳酸菌(包括各種 亞型乳桿菌、嗜熱乳酸鏈球菌、糞腸球菌和屎腸球菌等)，其中優(yōu)選雙歧桿菌。
本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化體，其中所述的人胃泌酸調(diào)節(jié)素基因的核酸序列可在不改變其編碼的氨 基酸序列的前提下，根據(jù)所選宿主的偏好密碼子對(duì)其核酸序列進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，使人胃泌酸調(diào) 節(jié)素基因在本發(fā)明轉(zhuǎn)化體中更好地表達(dá)人胃泌酸調(diào)節(jié)素，這是本領(lǐng)域的慣用手段。
本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化體可由以下方法制備得到
(1) 將編碼人胃泌酸調(diào)節(jié)素的基因片段插入到以阿拉伯糖操縱子為啟動(dòng)子的原核表達(dá)質(zhì) 粒的表達(dá)區(qū)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒；
(2) 將所得重組表達(dá)質(zhì)粒用電穿孔方法或PEG、氯化鈣等化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到雙歧桿菌、 乳酸菌等益生菌中，再用含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子，挑選出具有氨芐青霉素抗 性的菌落即可。
上述方法中，所述的重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法為本領(lǐng)域常用的分子克隆技術(shù)，所用的原 核表達(dá)質(zhì)?？梢允窃竞邪⒗遣倏v子啟動(dòng)子的質(zhì)粒(如pBAD/glIIA、 B、 C系列質(zhì)粒、pBAD系列質(zhì)粒)，也可以是其他原核表達(dá)質(zhì)粒(如pET系列質(zhì)粒、pQE系列質(zhì)粒、pUC系列質(zhì) 粒、pGEM系列質(zhì)粒和pTrc系列質(zhì)粒等)，但需要將其原有啟動(dòng)子序列用阿拉伯糖操縱子序列 替換。
在眾多原核表達(dá)質(zhì)粒中，優(yōu)選pBAD/glII質(zhì)粒，用其構(gòu)建本發(fā)明重組表達(dá)質(zhì)?？蓞⒖家韵?方法(構(gòu)建流程見圖1):用SEQ NO. 1所示核酸片段置換gIII信號(hào)肽核酸序列，在SEQ NO. 1 所示核酸片段的下游表達(dá)區(qū)插入SEQ NO. 3所示核酸片段，在非編碼區(qū)插入SEQ NO. 2所示核 酸片段，即得重組質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)如圖2所示)，其中，
SEQN0.1是胞外外切木聚糖分泌性信號(hào)肽的DNA片段Xs的核酸序列，其3'端為5p// (反向)和Afco/內(nèi)切酶位點(diǎn)，5'端為與pBAD/glII質(zhì)粒阿拉伯糖pBDA啟動(dòng)子3'端互補(bǔ)的 一段序列；SEQ N0.2是作為質(zhì)粒復(fù)制元件的雙歧桿菌質(zhì)粒復(fù)制子及復(fù)制啟動(dòng)蛋白R(shí)印B核酸 序列BRP; SEQ NO. 3是編碼人胃泌酸調(diào)節(jié)素基因(簡(jiǎn)寫為OXM)的核酸序列，其5，端設(shè)有 勘//內(nèi)切酶位點(diǎn)，3'端設(shè)有J6a/內(nèi)切酶位點(diǎn)；通過在信號(hào)肽Xs核酸序列3'端和OXM序 列5，端設(shè)計(jì)獨(dú)特的內(nèi)切酶勘/ / (酶切方式GAAGACNN I NNNN t )，使得Xs信號(hào)肽序列與OXM 序列通過處i /酶切連接后形成的融合基因Xs-OXM不帶有其他多余的核酸序列。
本發(fā)明轉(zhuǎn)化體中的表達(dá)載體是以阿拉伯糖操縱子pBDA為啟動(dòng)子，在誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖 或低聚木糖的誘導(dǎo)下能在腸道內(nèi)、外表達(dá)并分泌胃泌酸調(diào)節(jié)素，起到調(diào)節(jié)食欲和能量吸收、 減肥降脂的生物學(xué)作用，因此可以制成各種用于減肥的制劑。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化體制成制劑可 參考以下兩種方式
(1) 體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)型
本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化體在大量培養(yǎng)增殖過程中不加誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)，直接離心干燥后，加入 終濃度為2% (w/v)的L-阿拉伯糖或終濃度為20% (w/v)的低聚木糖作為誘導(dǎo)劑，按常規(guī)方 法添加藥用級(jí)或食品級(jí)輔料制備成口服液、活菌粉劑、片劑或膠囊直接服用，服用方法如下 每天服用1 2次，每次服用量為108 10'2cfu， 一個(gè)月為一個(gè)療程，可以連續(xù)服用3 6個(gè)療 程。
或者將離心干燥后的菌體直接添加到固體食品或飲料中，同時(shí)加入終濃度為2% (w/v) 的L-阿拉伯糖或終濃度為20% (w/v)的低聚木糖作為誘導(dǎo)劑即可。食用方法為每天服用1 2次，每次食用量為108 1012 cfu, —個(gè)月為一個(gè)療程，可以連續(xù)服用3 6個(gè)療程。
(2) 體外誘導(dǎo)表達(dá)型本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化體在大量培養(yǎng)增殖到菌液0D695吸光度值達(dá)0.6， 加入誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖至終濃度為0.2% (w/v)或低聚木糖至終濃度2. 0% (w/ v)誘導(dǎo)OXM表達(dá)分泌，然后按常規(guī)方法制備成口服液、活菌粉劑、片劑或膠囊。服用方法每天服用l 2次，每次服用量為108 1012 cfu， 一個(gè)月為一個(gè)療程，可以連續(xù)服用3 6個(gè)療程。
或者將胃泌酸調(diào)節(jié)素轉(zhuǎn)化體誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液添加到固體食品或飲料中，每天食用1~2 次，每次食用量為108 1012 cfu， 一個(gè)月為一個(gè)療程，可以連續(xù)服用3 6個(gè)療程。
本發(fā)明轉(zhuǎn)化體可以按常規(guī)的活菌制劑工藝制成活菌口服液、粉劑及膠囊等多種形式的劑 型。由于本發(fā)明轉(zhuǎn)化體活菌制劑的制備和保存都需在低溫環(huán)境中進(jìn)行，因此在制成各種制劑 時(shí)需要添加甘油、碳水化合物、奶粉和淀粉等防凍保護(hù)劑保護(hù)菌體。^發(fā)明轉(zhuǎn)化體活菌制劑 可以單獨(dú)形成產(chǎn)品，也可以作為食品添加劑或發(fā)酵劑、飼料添加劑等加入其他食品或藥品中 用于減肥、降脂。
本發(fā)明的突出特點(diǎn)是利用雙歧桿菌和乳酸菌等益生菌能在腸道內(nèi)長(zhǎng)期生長(zhǎng)、定植的特性， 通過構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒，篩選獲得胃泌酸調(diào)節(jié)素基因轉(zhuǎn)化雙歧桿菌或乳酸菌，使胃泌酸調(diào)節(jié) 素在腸道內(nèi)、外表達(dá)和分泌，發(fā)揮胃泌酸調(diào)節(jié)素調(diào)節(jié)食欲和能量吸收、減肥降脂的生物學(xué)作 用。此法不需要進(jìn)行胃泌酸調(diào)節(jié)素多肽的分離和純化，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低，可以口服， 用藥方便，克服了化學(xué)合成或基因工程生產(chǎn)胃泌酸調(diào)節(jié)素類似肽生產(chǎn)成本高、用藥不便的缺 點(diǎn)。此外，本發(fā)明轉(zhuǎn)化體采用誘導(dǎo)表達(dá)的方式，其誘導(dǎo)劑阿拉伯糖或低聚木糖是可以促進(jìn)雙 歧桿菌/乳酸菌增殖的益生元，只能被雙歧桿菌/乳酸菌分解利用，不能被人體及其他細(xì)菌消 化分解；且阿拉伯糖或低聚木糖與雙歧桿菌/乳酸菌都具有減肥降脂的作用，與胃泌酸調(diào)節(jié)素 有協(xié)同作用，有利于提高減肥降脂的療效。


圖1是本發(fā)明重組質(zhì)粒構(gòu)建流程示意圖。 圖2是本發(fā)明重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3是0XM轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌體外誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物免疫印跡檢測(cè)結(jié)果，其中，l為誘導(dǎo)前的培養(yǎng) 上清，2為經(jīng)0.2X阿拉伯糖誘導(dǎo)48hr后的培養(yǎng)上清；3 5分別為經(jīng)0. 2X低聚糖誘導(dǎo)12hr、 24hr、 48hr后的菌體。
圖4是0XM轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌喂食治療肥胖小鼠l月后體重的變化。 圖5是0XM轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌喂食治療肥胖小鼠1月后血清甘油三酯含量的變化。 圖6是0XM轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌喂食正常小鼠1周后血清饑餓素(Ghrelin)含量的變化。
具體實(shí)施例方式
例l OXM基因轉(zhuǎn)化雙歧桿菌的制備1. OXM雙歧桿菌-大腸桿菌重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法
1.1化學(xué)合成胞外外切木聚糖酶(extracellular exo-xylanase)分泌性信號(hào)肽核酸序 列Xs (SEQ NO. 1);以pBAD/glII質(zhì)粒腿為模板用引物1 (SEQ NO. 4)和2 (SEQ NO. 5)擴(kuò) 增pBDA啟動(dòng)子DNA片段，擴(kuò)增條件為94'C變性45秒，54t:退火45秒，72'C延伸1分鐘， 重復(fù)30個(gè)循環(huán)，72'C再延伸5分鐘。將所得pBDA DNA片段與分泌性信號(hào)肽核酸序列Xs混合， 加高保真DNA聚合酶和dNTP， 94'C 1分鐘變性，60°C 2分鐘退火補(bǔ)平，重復(fù)8-10個(gè)循環(huán)， 再用引物1和引物3 (SEQ NO. 6) PCR法擴(kuò)增pBDA/Xs融合基因全長(zhǎng)核酸片段，擴(kuò)增條件為 94'C變性45秒，54'C退火45秒，72'C延伸1分鐘，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，72'C再延伸5分鐘。將 所得擴(kuò)增產(chǎn)物插入到pBAD/gffl質(zhì)粒的J/p力/7氾/和Afco/酶切位點(diǎn)之間，替換該質(zhì)粒原有的 pBAD/glII核酸序列，構(gòu)建成質(zhì)粒pBAD/Xs。
1.2參照人OXM氨基酸及核酸序列，根據(jù)雙歧桿菌密碼子使用頻率優(yōu)化OXM核酸序列， 工化學(xué)合成OXM核酸片段(SEQN0.3)，并在5'端引入&//內(nèi)切酶序列，3'端引入屈a/ 內(nèi)切酶序列，插入到構(gòu)建好的pBDA/Xs質(zhì)粒的處Z/和J6a/酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建成0XM廣泛 宿主表達(dá)質(zhì)粒載體pBDA/Xs-0XM。
1.3以引物4 (SEQ N0. 7)和引物5 (SEQ NO. 8)從克隆好的pBluscriptSK-BRP質(zhì)粒中 PCR法擴(kuò)增雙歧桿菌質(zhì)粒復(fù)制子及復(fù)制啟動(dòng)蛋白(BRP) DNA片段(SEQ NO. 2)，擴(kuò)增條件為 94。C變性45秒，56'C退火45秒，、72'C延伸2分鐘，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，72'C再延伸5分鐘。擴(kuò) 增的BRP片段平端插入到原核表達(dá)載體pBAD/glII的5"7"7/位點(diǎn)，DNA測(cè)序鑒定OXM雙歧 桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體。
上述的OXM雙歧桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體構(gòu)建過程中所用的技術(shù)方法皆為分子生物學(xué) 通用的分子克隆技術(shù)方法，有一定分子生物學(xué)基礎(chǔ)的技術(shù)人員都可按照上述方法構(gòu)建成功。 所用的pBAD/glII載體由美國(guó)Invitrogen公司提供，處/ /內(nèi)切酶由立陶宛MBI Fermentas公 司提供，其他的內(nèi)切酶、連接酶等工具酶國(guó)內(nèi)外的多個(gè)生化、生物公司皆可提供。
2. OXM轉(zhuǎn)化雙歧桿菌的制備和篩選 2.1雙歧桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
2.1.1選雙歧桿菌單菌落接種到5ml改良MRS液體培養(yǎng)基(每升含胰蛋白胨10g,大豆 蛋白胨2g，牛肉浸出粉10g，酵母浸出粉5g，葡萄糖20g，檸檬酸銨2g，K2HP04 2g, MgS03 *7H20 2g，醋酸鈉3g，吐溫80 1ml，高壓滅菌后加無菌半胱氨酸至終濃度0.05%,調(diào)節(jié)PH至6.8) 中，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，37'C恒溫厭氧培養(yǎng)48小時(shí)；2. 1. 2待菌液變混濁，測(cè)定0D哪吸光度值達(dá)0. 6時(shí)，吸取菌液50 ii 1加入5ml改良MRSS 培養(yǎng)基中，置于厭氧盒中37r過夜培養(yǎng)24小時(shí)
2. 1. 3取上述菌液以1: 25稀釋在新鮮的改良MRS培養(yǎng)基中，37'C厭氧培養(yǎng)至0D695 值為0. 6;
2.1.4將菌液置冰上預(yù)冷，轉(zhuǎn)移至高壓滅菌的離心管中，于4'C 4500轉(zhuǎn)/分鐘離心5 分鐘收獲細(xì)菌，棄去上清液，保留沉淀；
2.1. 5用0. 5M濃度的無菌蔗糖溶液重懸細(xì)菌，混勻后4°C 4500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘， 棄去上清液，用0.5M蔗糖溶液重復(fù)洗滌1次；
2.1. 6用1/250原始菌液體積的預(yù)冷電擊緩沖液(0.1M醋酸銨，0. 5M蔗糖，PH 6. 0) 重懸細(xì)菌，加入甘油至15%配成感受態(tài)細(xì)菌，置-7(TC冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 3. OXM基因轉(zhuǎn)化雙歧桿菌的篩選
3.1取0. 5 1. 5 U g的pBDA/Xs-OXM質(zhì)粒，加入到80 n 1解凍雙歧桿菌感受態(tài)細(xì)菌懸 液中混勻，置冰上5分鐘，然后轉(zhuǎn)移到2mm電擊杯中；
3.2將電擊杯置電穿孔儀的電擊盒中，啟動(dòng)電源進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電擊條件電壓2.5kV， 電容25uF，電阻200Q，電擊時(shí)間約3-4.5毫秒。
3. 3電擊完成后，迅速取出菌液，涂布在改良MRS選擇瓊脂培養(yǎng)基平板(含1. 5%瓊脂， 0.05%半胱氨酸，100ng/ml氨芐青霉素(AMP)上，置于厭氧盒內(nèi)，37。C厭氧培養(yǎng)48-72 小時(shí)。
挑選6-8個(gè)單菌落于5ral AMP+的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-48小時(shí)，即得OXM基因轉(zhuǎn)化 雙歧桿菌。
4. OXM基因轉(zhuǎn)化雙歧桿菌的鑒定
4. 1革蘭氏染色鑒定取一滴菌液涂布在載玻片上，空氣晾干后，依次用結(jié)晶紫染液、 革蘭氏碘染液各染色1分鐘，脫色液脫色約半分鐘，沙黃復(fù)染液染色l分鐘，細(xì)水沖洗，晾 干或用吸水紙吸干鏡下觀察。
4.2 OXM基因聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)
4. 2. 1 OXM基因轉(zhuǎn)化雙歧桿菌質(zhì)粒DNA的提取取lml菌液，6000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘， 棄上清液；加入100ul酶裂解液(含40mg/ml的溶菌酶，20u/L變?nèi)芫氐?5%蔗糖溶液)， 重懸菌體，37'C孵育15min:加入200ul堿性SDS裂解液(3% SDS, 0. 2N NaOH),充分混勻， 室溫孵育7分鐘；加入150ul預(yù)冷的3M乙酸鈉(pH 5. 2)中和液，立即振蕩混勻，4°C 12000r/分鐘，離心10分鐘；上清轉(zhuǎn)移至新的EP管，加入lml無水乙醇，4°C 12000r/分鐘離心10 分鐘，棄去上清；用70%的乙醇洗滌沉淀，離心棄上清，空氣干燥后，加50ul TER液(10mM Tris, lmM EDTA, 20 u g/ral Rnase A)溶解，-20。C保存?zhèn)溆谩?br> 4. 2. 2 OXM基因PCR檢測(cè)以0XMF2 (堿基序列為SEQ NO. 9)和0XMR2 (堿基序列為SEQ NO. 10)為上下游引物，以上述提取的轉(zhuǎn)化雙歧桿菌質(zhì)粒為模板DNA, PCR法檢測(cè)OXM核酸序 列。反應(yīng)條件是94'C 2分鐘預(yù)變性，94'C 30秒變性，55°C 40秒退火，72'C 45秒延伸， 共30個(gè)循環(huán)，72'C延伸5分鐘。將上述PCR產(chǎn)物加入到1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。能擴(kuò)增出 150bp目的OXM核酸條帶的菌液可認(rèn)為OXM基因轉(zhuǎn)化雙歧桿菌，繼續(xù)進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和誘導(dǎo) 表達(dá)分析。
結(jié)果OXM基因轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌經(jīng)革蘭氏染色觀察顯示，轉(zhuǎn)化雙歧桿菌在外觀形態(tài)方面 與野生型雙歧桿菌無明顯區(qū)別。以其基因組DNA為模板，以0XMF2和0XMR2為上下游引物擴(kuò) 增可得大小為150bp的DNA片段。
5. 質(zhì)粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
5.1細(xì)菌增殖傳代取PCR鑒定正確的OXM基因轉(zhuǎn)化雙歧桿菌液按h IOO接種到MRS 培養(yǎng)基中，37'C厭氧培養(yǎng)24小時(shí)。接著再l: IOO接種到新MRS培養(yǎng)基中，37'C厭氧培養(yǎng)24 小時(shí)。如此反復(fù)傳代接種15次。
5.2 OXM基因PCR檢測(cè)按步驟4方法提取轉(zhuǎn)化雙歧桿菌質(zhì)粒，以0XMF2(堿基序列為 SEQN0.9)和0XMR2 (堿基序列為SEQ NO. 10)為上、下游引物，PCR檢測(cè)OXM核酸序列，實(shí) 驗(yàn)陽(yáng)性者可認(rèn)為OXM基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化雙歧桿菌。可用于OXM誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果0XM基因轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌經(jīng)連續(xù)傳代接種15次后，PCR法仍然可以在提取的菌液 質(zhì)粒DNA中檢測(cè)到OXM基因序列。
6. OXM誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定實(shí)驗(yàn)-
6.1誘導(dǎo)表達(dá)取OXM基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化雙歧桿菌菌液，按l: 100接種于3nil改良MRS培 養(yǎng)基(含0.05%半胱氨酸，100ug/ml氨芐青霉素)中，37。C厭氧培養(yǎng)；待細(xì)菌懸液OD艦吸 光度值達(dá)0.6時(shí)，轉(zhuǎn)接種到5ml新的改良MRS培養(yǎng)基(含0.05%半胱氨酸，100ug/ml氨芐青 霉素)中，37。C厭氧培養(yǎng)至OD艦吸光度值達(dá)0. 6;加入誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖至終濃度為0. 2%, 設(shè)置不加誘導(dǎo)劑的菌液為陰性對(duì)照，37'C厭氧培養(yǎng)24-48小時(shí)；6000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘收 獲細(xì)菌，培養(yǎng)上清液和沉淀細(xì)菌分別凍存?zhèn)溆谩?br> 6.2免疫印跡(Western bloting)檢測(cè)6.2.1樣品處理-
6.2.1.1細(xì)菌沉淀樣品處理用500ul預(yù)冷的去離子水重懸細(xì)菌沉淀，12000轉(zhuǎn)/分鐘 離心10分鐘，棄上清；加入75ul裂解液(含1/100細(xì)菌蛋白酶抑制劑，40mg/ral的溶菌酶， 20u/L變?nèi)芫?0u/L變?nèi)芫?重懸沉淀，超聲粉碎儀超聲破碎細(xì)菌10min，加入25ul 4 XSDS凝膠加樣緩沖液并混勻；
6. 2.1. 2上清樣品處理上清樣品中加入1/3體積的100三氯醋酸(TCA)混勻，冰上 靜置20-30分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘沉淀蛋白，棄上清；加原樣品三倍體積的丙酮， 室溫靜置10分鐘溶解TCA， 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘沉淀蛋白，棄上清；加入100ul IX SDS上樣緩沖液溶解蛋白。
6.2.1.3所有樣品于100。C煮5分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10min,冰上靜置備用。 6.2.2聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳用小電泳槽配制1. 2% PAGE;取20ui樣品上清 上樣電泳。電泳條件積層膠80V恒壓，分離膠100V恒壓電泳，指示劑溴酚藍(lán)泳動(dòng)至膠底結(jié) 束電泳。
6.2.3電轉(zhuǎn)移電泳結(jié)束后，取下凝膠，切去未加樣多余凝膠，并切一小角作標(biāo)記， 移至0. 2um孔徑PVDF膜上。
6.2.4封閉電轉(zhuǎn)結(jié)束后，取出PVDF膜，放在封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST)中， 室溫振搖封閉1小時(shí)；
6.2.5抗體孵育封閉結(jié)束后，TBST液簡(jiǎn)單洗膜，取兔抗人OXM抗體，按1: 2000比 例加入到封閉液中，室溫孵育2小時(shí)；TBST洗膜3次；取羊抗兔二抗，按l: 2500比例加入 到封閉液中，室溫孵育30分鐘；TBST洗膜5次。
6.2.6曝光將膜置化學(xué)發(fā)光顯色液中充分浸潤(rùn)lmin，在濾紙上吸干，用保鮮膜包好， 放暗盒中曝光。根據(jù)條帶發(fā)光強(qiáng)度，曝光30秒至10分鐘不等；
6.2.7顯影暗室中取出底片，放入顯影液顯影2分鐘，定影液中定影2-5min取出， 水洗后觀察。目的成熟OXM多肽大小應(yīng)為4-5 KDa。
6.3酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定培養(yǎng)上清、腸道內(nèi)容物和血清中OXM含量
6.3.1樣品處理培養(yǎng)上清和血清凍存液解凍后，4'C 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，冰 上靜置備用；回盲腸道內(nèi)容物解凍后，按每克濕重加100ul樣品稀釋液(OXM ELISA試劑盒 提供)懸浮混勻，4'C 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，冰上靜置備用。
6.3.2 ELISA檢測(cè)在微孔板上每孔加入80-90ul樣品稀釋液，10-20ul樣品，總體積100ul，再加入50ul酶標(biāo)二抗，37'C溫育1小時(shí)；甩去孔內(nèi)液體，每孔加250ul磷酸緩沖 液(PBS)洗滌液洗滌5次，每次2-3分鐘甩去液體，在吸水紙上拍干；每孔加入顯色底物 100ul， 4'C溫育10分鐘，加入2M硫酸終止反應(yīng)。在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值(OD)。
結(jié)果OXM基因轉(zhuǎn)化雙歧桿菌經(jīng)誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖誘導(dǎo)后的6-72小時(shí)內(nèi)，免疫印跡法 可以檢測(cè)到培養(yǎng)上清液和沉淀細(xì)菌中有特異性O(shè)XM多肽表達(dá)(圖3); ELISA法定量檢測(cè)OXM 表達(dá)水平顯示，OXM在培養(yǎng)上清的表達(dá)水平可達(dá)到1-5ng/ml，培養(yǎng)上清OXM含量高于沉淀細(xì) 菌含量1-3倍。說明OXM在轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌中主要以分泌型方式表達(dá)。
例2本發(fā)明轉(zhuǎn)化體口服液的制備
l.種子菌的制備
1.1擴(kuò)增培養(yǎng)取經(jīng)過PCR檢測(cè)、革蘭氏染色及誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)鑒定的OXM基因穩(wěn)定轉(zhuǎn) 化雙歧桿菌菌液，按l: IOO接種于10ml改良MRS培養(yǎng)基(含0.05%半胱氨酸，100ug/ml氨 芐青霉素)中，37。C厭氧培養(yǎng)；待細(xì)菌懸液0D695吸光度值達(dá)0.6時(shí)，4500轉(zhuǎn)/分鐘離心5 分鐘收獲細(xì)菌；
1.2凍存
1. 2.1凍存方法1:加入適量的含15-50%甘油或10-20%二甲亞砜(DMSO)防凍劑的MRS 培養(yǎng)液，分裝后于-20至-8(TC凍存作為種子菌。
1. 2. 2凍存方法2:加入終濃度為15% (w/v)的甘油、10% (w/v)的脫脂奶粉、3% (w/v) 的乳糖和3% (w/v)的海藻糖等常用冷凍干燥保護(hù)劑成分的防凍保護(hù)劑冷凍干燥，分裝后于4 'C或-2(TC凍存作為種子菌。
2. OXM基因轉(zhuǎn)化雙歧桿菌口服液的制備
2.1取OXM轉(zhuǎn)化雙歧桿菌種子菌，接種于適合于厭氧菌生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基(含100ug/ml 氨芐青霉素)中，37'C厭氧培養(yǎng)48-72小時(shí)，4500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘收獲細(xì)菌，用生理鹽 水洗滌2次，離心收集菌體沉淀。
2.2 口服液
取2.1方法收獲的細(xì)菌沉淀，加終濃度為2% (w/v)的L-阿拉伯糖溶液重懸細(xì)菌，配制 成每毫升不低于108活菌的新鮮菌液，分裝后于4至l(TC冰箱冷藏。
例3凍干粉劑
取例2中2.1方法收獲的細(xì)菌沉淀，加終濃度為20% (w/v)的低聚木糖溶液重懸細(xì)菌，再加入終濃度為15% (w/v)的甘油、10% (w/v)的脫脂奶粉、3% (w/v)的乳糖和3% (w/v) 的海藻糖，配制成每克不低于108活菌的混合液，分裝后置冷凍干燥儀上凍千，封口后于4-8 'C或-2(TC保存。
例4干燥粉劑
取例2中2. 1方法收獲的細(xì)菌沉淀，加終濃度為20% (w/v)的低聚木糖溶液重懸細(xì)菌， 再加入終濃度為10% (w/v)的脫脂奶粉、3% (w/v)的乳糖和3% (w/v)的海藻糖，配制成每 克不低于108活菌的混合液，分裝后置真空干燥儀上烘干，最高溫度不超過42'C,封口后于 4-8'C或-20'C保存。
例5 OXM轉(zhuǎn)化雙歧桿菌減肥降脂藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)
1. 準(zhǔn)備成年高脂、高糖飲食肥胖小鼠(或大鼠)，將動(dòng)物分成4組，每組不少于10只， 繼續(xù)高脂、高糖飲食喂飼在潔凈場(chǎng)所。
2. 實(shí)驗(yàn)組用OXM轉(zhuǎn)化雙歧桿菌口服液喂飼肥胖動(dòng)物，每只喂飼0. 1-0. 2tnl，每2天1 次。陰性對(duì)照組喂飼報(bào)告基因綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)化雙歧桿菌；空白對(duì)照組喂飼無菌低聚 糖、單糖溶液；陽(yáng)性對(duì)照組按lg/kg體重喂飼脂肪酶抑制劑賽尼可。連續(xù)喂飼l個(gè)月。跟蹤 觀測(cè)受試動(dòng)物食量、體重及其他生命體征。
3. 處死小鼠前測(cè)試受試動(dòng)物食量、體重，眼球采血，處死后采取腸道回盲部?jī)?nèi)容物， 肝、腎、血管等組織固定并切片，測(cè)定血脂等生化指標(biāo)，測(cè)定血清OXM、腸道內(nèi)容物OXM含 量，血清饑餓素(ghrelin)含量。
4. 比較實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組之間食量、體重和血液、腸道生化、免疫指標(biāo)。
結(jié)果藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，OXM轉(zhuǎn)化雙歧桿菌口服液喂飼肥胖小鼠1個(gè)月后，實(shí)驗(yàn)組食量
和體重接近正常小鼠，顯著低于陰性對(duì)照組(P<0.001)，與正常組無顯著差異(P>0.05), 效果與減肥新藥塞可尼(一種脂肪酶抑制劑)相當(dāng)(結(jié)果見圖4);實(shí)驗(yàn)組甘油三酯含量顯著 低于陰性對(duì)照組(P〈0.001)，甚至低于正常組小鼠(P〈0.05),效果與減肥新藥塞可尼相當(dāng)， 二者無顯著差異(P>0.05)(結(jié)果見圖5);實(shí)驗(yàn)組腸道回盲部?jī)?nèi)容物OXM含量顯著高于陰性 對(duì)照組和空白對(duì)照組；受試小鼠血清OXM含量略高于對(duì)照組，但與陰性對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué) 差異實(shí)驗(yàn)組血清饑餓素(ghrelin)含量顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.001)(結(jié) 果見圖6)。上述結(jié)果表明，OXM轉(zhuǎn)化雙歧桿菌可在小鼠腸道內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)分泌OXM，表達(dá)的OXM 可通過作用于腸道內(nèi)膜相應(yīng)的受體，下調(diào)血清饑餓素(ghrelin)含量，抑制食欲和能量吸收。說明OXM轉(zhuǎn)化雙歧桿菌有顯著的減肥、降脂生物學(xué)作用。 例6 OXM基因轉(zhuǎn)化乳桿菌
1、 OXM基因轉(zhuǎn)化乳桿菌的制備用乳桿菌代替雙歧桿菌作為宿主，其余方法步驟與例l 相同。
2、 OXM基因轉(zhuǎn)化乳桿菌的篩選方法與例l相同。
3、 OXM基因轉(zhuǎn)化乳桿菌的鑒定方法與例l相同。
例7 OXM基因轉(zhuǎn)化嗜熱乳酸鏈球菌
1、 OXM基因轉(zhuǎn)化嗜熱乳酸鏈球菌的制備用嗜熱乳酸鏈球菌代替雙歧桿菌作為宿主，其 培養(yǎng)增殖溫度為40-45'C，其他的方法與例l相同。
2、 OXM基因轉(zhuǎn)化嗜熱乳酸鏈球菌的篩選除嗜熱乳酸鏈球菌的培養(yǎng)增殖溫度為40-45'C 夕卜，其他的方法與例l相同。
3、 OXM基因轉(zhuǎn)化嗜熱乳酸鏈球菌的鑒定方法與例l相同。 例8 OXM基因轉(zhuǎn)化糞腸球菌
1、 OXM基因轉(zhuǎn)化糞腸球菌的制備用糞腸球菌代替雙歧桿菌作為宿主，其余方法步驟與 例1相同。
2、 OXM基因轉(zhuǎn)化糞腸球菌的篩選方法與例1相同。
3、 OXM基因轉(zhuǎn)化糞腸球菌鑒定方法與例l相同。
例9 OXM基因轉(zhuǎn)化屎腸球菌
1、 OXM基因轉(zhuǎn)化屎腸球菌的制備用屎腸球菌代替雙歧桿菌作為宿主，其余方法步驟與 例1相同。
2、 OXM基因轉(zhuǎn)化屎腸球菌的篩選方法與例l相同。
3、 OXM基因轉(zhuǎn)化屎腸球菌鑒定方法與例l相同。序列表
<110>南方醫(yī)科大學(xué)
〈120〉 一種用于減肥降脂的轉(zhuǎn)化體及其制備方法 〈靜 10
〈170〉 Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 109
〈212> 腿 〈213〉雙歧桿菌
<400〉 1
atgaattatt tacgacaaaa aatttcggct agtgctatcg cggtgttgtc gacttgtggg 60 ttgattttgg cgccaatgcc ggtctttgcg gagtcttcca tggaacaac 函
〈210〉 2
<211〉 1963
〈212〉 DNA 〈213〉雙歧桿菌
<400> 2
cctgatgcag accatgtaag gagccgtttc gatggtgaag agcctggatg agcagatcaa 60gtccctgcag gagaggcagg cccagctcaa ggcccgcgag gacgacctca鄉(xiāng)cgcggcg 120
cagggaacgc gaacgcaagg cccgaaccaa gcgcctgatc gaggtcggcg cgatggccga 180
gtcggccgcc ggcttcgsgg gsggcgacg3 gagggccaag gascacatcg cccgcctcgt 240
gcagctcggc tccctggtgg aagccatgtg ctccaccgac gtgatgggca actacacgag 300
ccgcgaggac ctcagggcca ccgtcgccaa ggccctggaa cacaacgtca ggaccagcga 360
cggcatg朋c tggaacctgc acgacctggt gtacg郷cg ctgsgcgagg aatgggccag 420
gagggacggc gagatcggcg acccctgggc ggacgaacca gccagcggat accagccgcc 480
ctcatacgag cccgtcaacc ccgaacgcag gactccccaa acgccctccg acggcctgat 540
ctgacgtccg gaaaaaggcg ctttgcgccc ttttataatc ttttaaaatc tttttacatt 600
cttttagggg tcccgcagcc ctactctccc aacgagtttc ggacggaact gagtacaaaa 660
taggagcgaa ttgagtacaa aataggagcg gactgagtac aaaataggag cgaattgagt 720
acaaaatagg agcggactga gtaagtaagt aatttttata ctcagttgtg ctatgctgtg 780
gttatgtcca atgaaatcgt gaagttcagc aaccagttca acaacgtcgc cttgaagaag 840ttcg3cgcgg tgcscctgga cgtgctcatg gca3tcgcct cgagggtgag gg卿ggggc 900
acggccacgg tggagttctc gttcgaggag ctgcgcggcc tcatgcggct gaagcagaac 960
ctgaccaaca agcagctggc cgacaag3tc gtgcagacga acgcccgcct gctggcattg 1020
aactacatgt tcgaggactc gggcaagatc atccagttcg cgctgttcac ggtgttcgag 1080
accgacccgg cgaaccagac gcttgaggtg agcgtgaacg agcgattcgc gttcctgctc 1140
aacgacctga ccagccagtt cacgcgattc gagctggccg agttcgccga cctcaagagc 1200
aagtacgcca aggagttcta ccgcagggcc aagcagtacc gcagctcggg aatctggaaa 1260
gtcagccgcg acgagttctg ccgactgctc aacgtgtcca agtccacgtc tgactcggtc 1320
tcaaacctga acagagtcgt gctgaagccg attgtcgaag agtgtggccc gctccttggc 1380
ttgaagatcg agcgccagta cgcgaagcgt cggctgtcgg gcttcgtgtt cacgttcgcc 1440
cgtgaaaccc cgcctgtgat cgatgccagg ccggtgaagg ccaaggaaga gcaagattcc 1500
ggccattgga cgagtgtggc gggctatggc gaggtgttca cgaccactga gctgUcgac 1560
gtgacggcgg cgcgtgacca cttcgacggc accgtggacg cgggcgaatg ccggtactgc 1620
cggtatgacg ctcgcaaccg cgagcggcac gccaggaacg cggggacgct gttctagcgg 1680ccgtggccgc gcctctgggg cggttgtgcg ctccatgggt cgatctgccg ctgttcggct 1740
tcctgacggc ctgtgcgcct gtctgcgcgc tgtttgagtt ccccgagcag gtcggccttg l訓(xùn)
gtcttggggg tggcgcgctg ctcgaacggg ctggattccc cccagtcctc gggttcgctc 1860
agatccagcg gctcgtcgcc ggacggctcg ggccggttcg.ctccccgcgc ctgtccctcg 1920
gcccgttccc gctgttcggc catgcgcaat gcgaggtctt agg
〈210〉 3
<211> 141
〈212〉 DNA
<213〉 人
1963
<400> 3
ggtggtgaag actctgcgca ttcacagggc acattcacca gtgactacag caagtatctg 60
gactccaggc gtgcccaaga ttttgtgcag tggttgatga atacca卿g gaacaggaat 120
aacattgcct aatgatctag a 141
<210> 4 <211> 32 <212〉 DNA〈213〉人工序列
〈400> 4
ggtggtatgc atatgctact ccgtcaagcc gt 32
<210> 5
<211> 20
<212〉 DNA <213>人工序列
〈400〉 5
gttaattcct cctgttagcc 加
<210〉 6
<211〉 31
<212〉 DNA <213>人工序列
〈400〉 6
ggtggttcta gatcattagg caatgttatt c
<210> 7 〈211〉 20 <212> DNA<213>人工序列
〈400〉 7
cctgatgcag accatgtaag 20
<210> 8
<211〉 20
〈212〉 腿 <213〉人工序列
〈400〉 8
cctaagacct cgcattgcgc 20
〈210〉 9
〈211〉 22
<212> 鵬 <213>人工序列
<400> 9
cgcattcaca gggcacattc ac 22
〈210〉 10 <211〉 25 〈212〉 DNA<213>人工序列 <400〉 10
tctagatcat taggcaatgt tattc 2權(quán)利要求
1、一種用于減肥降脂的轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體由人胃泌酸調(diào)節(jié)素基因的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化益生菌獲得，其中，所述的人胃泌酸調(diào)節(jié)素基因的重組表達(dá)質(zhì)粒是將編碼人胃泌酸調(diào)節(jié)素的基因片段克隆到以阿拉伯糖操縱子為啟動(dòng)子的原核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)區(qū)得到；所述的益生菌為雙歧桿菌或乳酸菌。
2、 如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述的原核表達(dá)質(zhì)粒是pBAD/gin。
3、 如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述的益生菌是雙歧桿菌。
4、 權(quán)利要求1 3之一所述的轉(zhuǎn)化體的制備方法，該方法由以下步驟組成(1) 將編碼人胃泌酸調(diào)節(jié)素的基因片段克隆到以阿拉伯糖操縱子為啟動(dòng)子的原核表達(dá) 質(zhì)粒的表達(dá)區(qū)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒；(2) 將所得重組表達(dá)質(zhì)粒用電穿孔方法或PEG、氯化鈣等化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到所述益生菌 中，再用含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子，挑選出具有氨芐青霉素抗性的菌落即可。
5、 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，當(dāng)所用原核表達(dá)質(zhì)粒為pBAD/gffl時(shí)， 歩驟(1)所述構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒的方法是用SEQ NO. 1所示核酸片段置換gIII信號(hào)肽核酸 序列，在SEQ NO. 1所示核酸片段的下游表達(dá)區(qū)插入SEQ NO. 3所示核酸片段，在pBAD/glII的 非編碼區(qū)插入SEQ N0.2所示核酸片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于減肥降脂的轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體由人胃泌酸調(diào)節(jié)素基因的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化人或動(dòng)物的益生菌獲得，其中，所述的人胃泌酸調(diào)節(jié)素基因的重組表達(dá)質(zhì)粒是將編碼人胃泌酸調(diào)節(jié)素的基因片段克隆到以阿拉伯糖操縱子為啟動(dòng)子的原核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)區(qū)得到；所述的人或動(dòng)物的益生菌為雙歧桿菌或乳酸菌。本發(fā)明轉(zhuǎn)化體可通過誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖或低聚木糖在腸道內(nèi)、外誘導(dǎo)表達(dá)和分泌胃泌酸調(diào)節(jié)素，起到減肥降脂的作用，因此可制成用于減肥降脂的口服活菌制劑。
文檔編號(hào)A61P3/06GK101608172SQ20091004138
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2009年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月24日
發(fā)明者曾位森, 羅深秋, 龍若庭 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)