ghal T et al. (2011)Pancreatic beta cell mass PET imaging and quantification with[llC]DTBZ and[18F]FP-(+)-DTBZ in rodent models of diabetes. Mol Imaging Biol 13:973 - 984.
[0106] 29. Park S-YjBell GI (2009) Noninvasive monitoring of changes in pancreatic beta-cell mass by bioluminescent imaging in MIP-Iuc transgenic mice. Horm Metab Res 41:1 - 4.
[0107] 30. Virostko J et al. (2011)Multimodal image coregistration and inducible selective cell ablation to evaluate imaging ligands. Proceedings ofthe National Academy of Sciences 108:20719 - 20724.
[0108] 31. Ellett J，Evans Z，Zhang G，Chavin K，Spyropoulos D (2009) A rapid PCR-based method for the identification of ob mutant mice. Obesity(Silver Spring) 17:402 - 404.
[0109] 材料和方法
[0110] 小鼠模型
[0111] 用于我們試驗(yàn)中的ob/ob小鼠來源于Umd，Sweden，并在the Karolinska Hospital，在我們的動物核心設(shè)備中繁殖。通過表現(xiàn)型和基因型分析與對照的痩的同窩幼 崽區(qū)分（31) ^所有的試驗(yàn)都根據(jù)Karolinska Institutet的試驗(yàn)動物護(hù)理和使用的指導(dǎo)原 則來實(shí)施，并被Karolinska Institutet的當(dāng)?shù)貏游飩惱砦瘑T會批準(zhǔn)D
[0112] 生理測量和瘦蛋白處理
[0113] 最少測量7只小鼠的體重和血糖水平。使用Accu-Chek?Aviva監(jiān)測系統(tǒng)（Roche) 得到葡萄糖濃度。在禁食16小時(shí)的小鼠中，通過腹膜內(nèi)注射2mg葡萄糖/克體重來進(jìn)行 葡萄糖耐量測試（η彡5)。使用小鼠胰島素ELISA板（Mercodia)每種條件下最少測量3 只小鼠的血漿胰島素濃度。通過每天腹膜內(nèi)注射1.5 μ g/g體重的重組人瘦蛋白（Amylin Pharmaceuticals)進(jìn)行瘦蛋白處理，并通過腹膜內(nèi)注射水來替代瘦蛋白，而實(shí)施假處理。
[0114] 將胰腺小島移植到眼前房中
[0115] 使用之前所述的技術(shù)，由雌性供者小鼠分離小島，并移植到雄性受者的眼前房中 (2)。我們使用異氟醚（Baxter)麻醉小鼠，并將大約10-20個(gè)小島移植到小鼠的眼前房中。 每個(gè)試驗(yàn)都選擇具有相似尺寸的用于移植的小島，而無需考慮小鼠的基因型。對小鼠皮下 注射 Temgesic (Schering-Plough)用于術(shù)后鎮(zhèn)痛。
[0116] 眼內(nèi)小島移植物的體內(nèi)成像
[0117] 按照之前所述，在移植后，在特定的時(shí)間點(diǎn)對小鼠中的小島移植物進(jìn)行體內(nèi)成 像⑵。我們使用基于TCS-SP2-A0BS(Leica)的具有長距水浸物鏡（Leica HXC-APO 10X/0. 30NA)的立式激光掃描共聚焦顯微鏡，以及定制立體式頭部保持器，從而使包含移植 小島的小鼠的眼睛定向于物鏡。Viscotears?(Novartis)用作眼睛和物鏡之間的浸漬液， 并在體內(nèi)成像過程中使用異氟醚來麻醉小鼠。在633nm下通過激光照明來對小島的形態(tài) 學(xué)成像，并在相同的波長下收集反向散射的光。就血管的可視化而言，我們將100 μ 1包含 2. 5mg/ml 500kDa的FITC標(biāo)記的右旋糖苷（Invitrogen)溶液注射到鼠尾靜脈中，并使用 496nm的激發(fā)波長將熒光成像。調(diào)節(jié)掃描速度和激光強(qiáng)度，以避免對小鼠眼睛或小島移植物 產(chǎn)生任何細(xì)胞損傷。
[0118] 組織切片和免疫組織化學(xué)
[0119] 將切下的組織用PBS簡單地漂洗，使用福爾馬林在室溫下固定48h，脫水并包埋 于石蠟中。通過二甲苯將固定在預(yù)涂敷的顯微鏡載片上的5微米厚切片脫蠟，并在處理 前逐步再水合。使用小雞抗胰島素（1:200稀釋，Abeam)、然后使用山羊抗小雞Alexa? 488 (1:1000稀釋，Invitrogen)抗體將胰島素染色；使用大鼠抗小鼠CD31 (1:50稀釋，BD Pharmingen)將血管染色，然后與生物素化的山羊抗大鼠（5 μ g/ml, Vector Labs)溫 育，并使用HRP鏈霉親和素/Alexa? 647酪酰胺（Invitrogen)放大；通過使用小鼠抗人 Ki67(l:50稀釋，Novocastra)以及Μ.0.Μ·生物素化的抗小鼠IgG(Vector Labs)來評 估增殖，并使用HRP鏈霉親和素/AlexaTM647酪酰胺放大。將核染色，并使用包含DAPI的 ProLong? GoldAntifade Reagent(Invitrogen)通過安裝防護(hù)玻璃罩來保護(hù)玻片。使用BD Pathway 855 系統(tǒng)（BD Biosciences)將玻片成像。使用 20X/0.75NAUApo/34001ympus 物鏡 將胰島素、CD31、Ki67和DAPI染色成像，并使用4X/0. 16NAUPlan SApo Olympus物鏡，通過 蒙太奇拍攝模式獲得蘇木精/伊紅染色的胰腺切片的概觀。
[0120] 圖像處理和分析
[0121] 在圖像分析前，將AutoQuant X2 (Media Cybernetics)用于所有體內(nèi)共聚焦圖像 的盲解卷積。使用Matlab?和Image Processing Toolbox(Mathworks)，基于反向散射體 信號通道來分析小島的體積。使用小島的"赤道體積"（即，小島的頂部下至計(jì)算赤道的體 積）來表示體積，并計(jì)算小島的生長。每只動物，我們最少分析3個(gè)小島移植物來測定小島 的生長，并且每個(gè)種類最少3只小鼠。在不同的成像時(shí)間點(diǎn)識別單一的血管節(jié)段，并使用 Volocity?(Perkin Elmer)測量它們的直徑。我們在Volocity?中建立了圖像分析方案， 用于自動化地分析組織切片。通過胰島素染色面積除以該面積中所包圍的DAPI染色核的 總數(shù)，得到β細(xì)胞的平均切片面積（每個(gè)組織最少1000個(gè)細(xì)胞）。通過計(jì)數(shù)Ki67陽性核 并除以胰島素陽性細(xì)胞中DAPI染色核的總數(shù)，得到B細(xì)胞增殖速率（每個(gè)移植的眼睛或胰 腺最少10000個(gè)細(xì)胞）。將Volocity?用于圖像展不，并將Photoshop CS5(Adobe)用于圖 像組合。
[0122] 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0123] 所有結(jié)果以平均值土SEM表示。Student' s t檢驗(yàn)用于測定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且p 值〈〇. 05被認(rèn)為是有意義的。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于監(jiān)測受試對象中器官的生理狀態(tài)的方法，其包含監(jiān)測移植的組織在受試對 象的眼睛上在一段時(shí)間后的形態(tài)學(xué)改變，其中所述的組織得自所關(guān)注的器官，并且其中所 述的移植的組織在所述的受試對象的眼睛上在一段時(shí)間后的形態(tài)學(xué)改變表示在所述的受 試對象中所關(guān)注的器官的生理狀態(tài)。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的方法用于監(jiān)測處理過程對所述的受試對象中的 紊亂的效力。
3. 權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的處理過程包含向所述的受試對象給予治療，并 且其中所述的方法監(jiān)測該治療在所述的受試對象中的效力。
4. 權(quán)利要求2或3所述的方法，其中所述的處理過程包含飲食和/或運(yùn)動方案，并且其 中所述的方法監(jiān)測所述的飲食和/或運(yùn)動方案在所述的受試對象中的效力。
5. 權(quán)利要求1-3的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的移植組織得自所述的受試對象。
6. 權(quán)利要求1-5的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的所關(guān)注的器官選自胰腺，肺，心 臟，腦，腎臟，肝臟，小腸，大腸，結(jié)腸，胃，膽囊，食管，輸尿管，尿道，卵巢，子宮， 乳房，脊髓，前列腺，下丘腦，腎上腺，腦下垂體，甲狀腺，副甲狀腺，松果體，脾，胸 腺，直腸，乳腺，貯精囊，腎小球，脂肪組織，腫瘤和睪丸。
7. 權(quán)利要求1-5的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的所關(guān)注的器官包含外分泌腺。
8. 權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的外分泌腺選自汗腺，唾液腺，乳腺，胃，肝臟 和胰腺。
9. 權(quán)利要求1-5的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的所關(guān)注的器官包含內(nèi)分泌腺。
10. 權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的內(nèi)分泌腺選自腦下垂體，胰腺，卵巢，睪丸， 甲狀腺和腎上腺。
11. 權(quán)利要求1-5的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的所關(guān)注的器官為所述的胰腺。
12. 權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的組織包含分離的胰腺的胰島。
13. 權(quán)利要求1-12的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的形態(tài)學(xué)改變選自組織中細(xì)胞的 尺寸、組織中細(xì)胞的體積、組織中細(xì)胞的面積、組織中細(xì)胞的形狀、組織中細(xì)胞的死亡、組織 中細(xì)胞的增殖、組織中的細(xì)胞團(tuán)塊、組織中的血液灌注、組織中細(xì)胞的光學(xué)反射率以及組織 中細(xì)胞的顆?；?。
14. 權(quán)利要求1-13的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的受試對象為非人哺乳動物。
15. 權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的非人哺乳動物患有人疾病的動物模式。
16. 權(quán)利要求1-13的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的受試對象為靈長動物，其中所 述的靈長動物患有與所關(guān)注的器官有關(guān)的疾病。
17. 權(quán)利要求1-13的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的受試對象為人，其中所述的人 患有與所關(guān)注的器官有關(guān)的疾病。
18. 權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的人患有糖尿病，并且所述的所關(guān)注的器官為 所述的胰腺。
19. 權(quán)利要求1-15和13-17的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的所關(guān)注的器官為腫瘤。
20. 權(quán)利要求1-19的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的方法進(jìn)一步包含向所述的受試 對象給予治療或測試化合物，以及監(jiān)測由該給予所產(chǎn)生的形態(tài)學(xué)改變。
21. 權(quán)利要求20所述的方法，其中在所述的給予后，在2個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)測定在所述 的移植組織中的形態(tài)學(xué)改變。
22. 權(quán)利要求1-21的任意一項(xiàng)所述的方法，其中通過顯微鏡監(jiān)測所述的形態(tài)學(xué)改變。
23. 權(quán)利要求1-22的任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的組織被移植到所述的受試對象 的眼前房中。
【專利摘要】本發(fā)明提供了通過監(jiān)測移植的組織在受試對象的眼睛上在一段時(shí)間后的形態(tài)學(xué)改變而監(jiān)測受試對象中器官的生理狀態(tài)的方法。
【IPC分類】A61B5-00
【公開號】CN104703531
【申請?zhí)枴緾N201380035941
【發(fā)明人】P·O·柏格瑞
【申請人】P·O·柏格瑞, 佰鷗科瑞公司
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2013年7月26日
【公告號】EP2877084A1, US20140033332, WO2014016400A1