，并與抑制胰島素表達的脂肪組織-胰島反饋環(huán)有關，并且在食 物攝取后被釋放（8, 9)。在ob/ob小鼠中缺乏瘦蛋白，由此導致體重快速增加，為了盡力補 償對胰島素的增加的需求，β細胞增生（10)。結果，〇b/ob小鼠的小島細胞群發(fā)生變化，與 其他內分泌細胞相比，β細胞的百分率特別高，占總的小島細胞的超過90% (11)。在ob/ 〇b小鼠中，瘦蛋白驅動的反饋環(huán)的缺乏解釋了由β細胞觀察到的胰島素的強烈釋放（導致 表觀的脫粒（10))以及胰島素抗性的發(fā)展。
[0052] 通過使用ob/ob小鼠作為模型系統(tǒng)，我們證明了光學可行的"報告小島"在眼前房 中的多樣且有趣的應用。這些報告小島成功地監(jiān)測了原位內分泌胰腺中的β細胞的可塑 性，并且還能夠進一步采取特定的治療方案。結果
[0053] ob/ob小鼠展現(xiàn)出異常的生理性質
[0054] 在4周齡時，ob/ob小鼠已經可以與其對照同窩幼崽顯示出形態(tài)學分化的，并且隨 著年齡的增加，其增加的肌體質量變得越來越明顯（圖1A，B)。生理研宄表明禁食血糖和胰 島素水平比對照的同窩幼崽升高（圖1C)。這符合早期的報告（5)，并且表示過量的食物攝 取和胰島素抗性。使用蘇木精和伊紅染色ob/ob小鼠和對照小鼠胰腺的石蠟包埋的切片， 從而觀察小島形態(tài)學的差異。ob/ob小鼠中，小島維度增加，從而提供了大的潛在的胰島素 分泌能力，以努力補償增加的食物攝?。▓D1D，E)。盡管評判胰腺切片提供了關于小島形態(tài) 學狀態(tài)在特定時間點時的信息，但是不能領會動力學改變。
[0055] 眼內小島移植物反映了原位內源小島的適應性形態(tài)學可塑性
[0056] 為了研宄這些小島在一段時間后的形態(tài)學可塑性，我們因此將一些"報告小島"移 植到小鼠的眼前房中，這對于體內縱向成像可以是光學可行的。在4周齡時，由供者小鼠分 離胰腺小島，并移植到年齡相稱的受者的眼前房中。這種體內環(huán)境包含了豐富的毛細管以 及神經網絡，它們將與移植的小島連接，并由此可以進行眼內旁分泌以及內分泌和神經輸 入（2, 12)。快速移植到虹膜上的移植小島和單一的小島移植體在移植后的不同時間點時重 復性地被識別（圖2A)。在ob/ob受者中，除了增加的生長，這些小島還展現(xiàn)出小島內血管 直徑增加（圖2B)，這事先可由切除的體外胰腺組織證明（13, 14)。小島內血管直徑的增加 可能與意圖增加高血糖條件下的血液灌注的補償機制有關（15)。此外，還可以有一種方法 來優(yōu)化內分泌的信號傳遞，從而確保在這種強烈的增殖條件下每個β細胞都將與血流直 接交流。在同源移植的小鼠中，通過共聚焦顯微鏡在不同的時間點對單一的小島進行體內 成像，并通過熒光成像證明〇b/ob小島移植物中大的且扭曲的血管（圖2C)。反向散射體 成像表明小島的形態(tài)學，以及〇b/ob小鼠小島中貌似的脫粒和不平坦的圖案。缺乏光反射 表明胰島素分泌快速，這可以通過在瘦蛋白缺乏條件下脂肪組織-胰島反饋環(huán)的破壞來解 釋（9)。通過對石蠟包埋的切片實施免疫組織化學來分析原位小島顯示在ob/ob和對照小 鼠中，胰腺中的小島具有相似的獨特的性質，即，CD31染色顯示在ob/ob小島中具有大的血 管，并且胰島素染色是不規(guī)則的。
[0057] 通過共聚焦顯微鏡將移植的小島體內成像提供了 3維形態(tài)學信息，這首次允許在 移植后的任意給定的時間點時精確地定量小島的體積。在一段時間后定量小島的平均體積 顯示在移植后的1個月開始，ob/ob與對照小鼠之間具有顯著的差異，說明在ob/ob小鼠中 小島急劇生長（圖2D，E)。有趣的是，這種生長證明與小鼠供者的基因型無關，即，當將對照 小鼠的小島移植到ob/ob小鼠中時我們觀察到相似的生長，證明在這種特定的情況下：i) 來源于受者小鼠的信號傳遞因子指導了移植小島的形態(tài)學改變；以及ii)移植的小島反映 了受者的原位胰腺小島的形態(tài)學行為。
[0058] 為了檢測眼前房中這種觀察到的可塑性事實上是否反映了在定位于胰腺的小島 中原位形成的可塑性，我們通過免疫組織化學比較了小島移植物和內源胰腺小島的石蠟包 埋切片。我們通過染色胰島素和Ki67,觀察到在ob/ob小鼠的小島中，β細胞強烈增殖 (圖2F)。無論是由原位胰腺小島測量的，還是由移植于眼前房中的小島測量的，增殖速率 均不具有顯著的差異（η = 5只小鼠，平均值土標準誤=0. 82±0. 10% ;η = 4只小鼠， 0.95±0. 15%)。此外，通過免疫組織化學來評估β細胞中的形態(tài)學改變，并表明與對照 小鼠相比，在ob/ob小鼠的細胞區(qū)域（在定位于胰腺的原位小島和小島移植物）中，增長大 約1. 35倍（圖2G)。瘦蛋白信號傳遞的缺乏是這種體積擴張的可能輔助者。事實上已經顯 示，使用胰腺特異性瘦蛋白受體KO小鼠，破壞小島中瘦蛋白的作用會導致PI3K/AKT信號傳 遞增強，這與β細胞尺寸和小島質量增大有關（16)。盡管在體內已經證明這種補償性的小 島的生長，但是我們現(xiàn)在已經能夠通過分析單一的"報告小島"而縱向地證明在活ob/ob小 鼠中的這種圖案。重要的是，我們的數(shù)據(jù)符合之前的研宄，其中由基于分離的小島的研宄得 到（17)或者由跨越整個胰腺的組織切片的成像得到（18)，在對照和ob/ob小鼠中，在2個 月齡時，小島的平均體積顯示出4倍的差異。
[0059] 瘦蛋白處理會降低體重并糾正ob/ob小鼠中血糖的動態(tài)平衡
[0060] 在見證了單一小島響應于食物過度消耗和胰島素抗性的行為后，接下來我們質疑 這種生長是否可以通過使用瘦蛋白來處理ob/ob小鼠而被抑制或者甚至逆轉。對3至4個 月齡的小鼠每天腹膜內注射。使用不同的參數(shù)規(guī)則地監(jiān)測這種處理的生理作用。與小鼠的 可見的食欲下降相似，我們測量到在處理過程中，小鼠的體重、血糖和胰島素濃度降低（圖 3A)。但是，瘦蛋白這種有利的作用隨著處理期結束后體重的快速增加而沒有得到持續(xù)，由 此在大約1個月后，達到年齡相稱的未處理ob/ob小鼠的相似的質量（參見圖1B，用于比 較）。此外，所述的處理對胰島素的敏感性具有有利的影響。在處理期結束時，對ob/ob小鼠 的腹膜內葡萄糖耐量測試證明與年齡相配的對照小鼠所得的相似的葡萄糖偏移（圖3B)。
[0061] 體內縱向成像表明瘦蛋白可逆轉ob/ob小鼠小島的失調
[0062] 此外，瘦蛋白處理還對小島的生長產生影響。盡管假處理的小鼠展示出小島移植 物持續(xù)的適應性生長，但是與早期的報告一致（19, 20)，這種生長在瘦蛋白處理下被廢止和 部分逆轉（圖4A，B)。在處理結束時，在由瘦蛋白處理的ob/ob小鼠得到的移植小島和原位 胰腺小大中β細胞的增殖事實上被廢止（圖4C)。在瘦蛋白處理后，無論小島是移植的還 是內源存在于胰腺中的，β細胞的平均尺寸都發(fā)生恢復，并顯示與年齡相稱的未處理的對 照小鼠不具有顯著性差異（數(shù)據(jù)未示出）。小島尺寸的減小可以部分由之前所報告的單一 β細胞的尺寸的減小來解釋（21)，以及通過小島內脈管系統(tǒng)的形態(tài)學改變來解釋（圖5)。 我們測量到小島移植物中血管直徑的減小，這與較低的血糖水平相似。有趣的是，在瘦蛋白 處理后的早期階段，在小島移植物中我們觀察到血管再生術，這是一種生物學現(xiàn)象，已知其 增強了血液灌注，并通過瘦蛋白與血管生長因子FGF-2和VEGF的協(xié)同刺激而受到積極影響 (22) 〇
[0063] 由于瘦蛋白驅動的脂肪組織-胰島反饋環(huán)的恢復以及血糖水平的降低，與在由瘦 蛋白處理的ob/ob雄鼠得到的小島中所察覺的胰島素免疫染色增強（19)相一致，我們觀察 到在移植的小島中，體內小島細胞的由此再次形成顆粒（由于它們的光學反射性更強）（圖 4A)。在ob/ob小鼠中在瘦蛋白處理后，體內胰島素釋放的正?；@示出是與食物攝取有關 及無關的機制的結果（20)。
[0064] 討論
[0065] 為了測試我們的"報告小島"（其報告了原位內分泌胰腺的狀態(tài)）的新概念，我們 利用了以下事實：在瘦蛋白缺陷型ob/ob小鼠中，具有內分泌胰腺的顯著的重建能力。將由 ob/ob小鼠模型得到的"報告小島"由此移植到與用于調查小島細胞質量調節(jié)（其在內分泌 胰腺中正在進行）的相似類型的小鼠的眼前房中。"報告小島"展現(xiàn)出肥胖誘導的生長以及 與胰腺中原位觀察的那些一致的血管化圖案。這些肥胖誘導的生長和血管化圖案可由眼前 房和原位胰腺中的瘦蛋白處理而逆轉，從而顯示出通過胰島素分泌潛力的擴張或降低而高 度有效地重建小島的證據(jù)。到目前為止，此類重建能力僅通過橫向研宄或通過在體外在相 對低的分辨率下分析胰腺小島群而間接地表明。因此，"報告小島"可以成功地表明在體內 調節(jié)內分泌胰腺的適應性可塑性的分子機制。
[0066] 多種不同的試驗方法允許定量β細胞團塊，并最終顯示小島的重建。體外技術包 含在切開的胰腺組織中通過點計數(shù)形態(tài)測量學（18)以及定向測量小島維度來分析胰腺的 組織切片（23, 24)。體外成像技術包含通過共聚焦顯微鏡（25)或光學相干顯微鏡（26)使 由腹中取出的胰腺成像。最終，多種非侵入性的體內成像技術針對于總β細胞團塊的縱向 定量，即，磁共振成像（MRI (27))、正電子成像術（ΡΕΤ(28))、生物發(fā)光成像（29)或結合的多 模式成像（30)。這些技術都不能提供跟蹤個體小島在一段時間后形態(tài)學改變的可能性。
[0067] 我們現(xiàn)在顯示一些"報告小島"可以以代表性的方式表明原位胰腺小島群的重建 (擴張或降低它們的胰島素分泌潛力）。因此，該技術允許將單一小島的研宄與小島群的研 宄融合，并具有使用縱向研宄來替代多個橫向試驗的潛力。因此，我們提出將移植到眼前房 中的"報告小島"作為多用途工具而進行體內成像，從而在β細胞功能和生存的調節(jié)中闡 明分子機制以及識別藥物化合物。重要的是，在人中，同源使用"報告小島"以診斷小島功 能障礙并監(jiān)測基于特定個體的治療方案的效果可以被設想為新的個人醫(yī)藥方法。我們的 "報告小島"的概念可以通過將多種高時間性細胞生物標志物用于功能和增殖而進一步發(fā) 展，并且還可以擴展至其他的器官中，并渴望對于生理和病理而言，在細胞和器官水平下詳 細地識別和了解分子相互作用和適應性機制。
[0068] 方法概述
[0069] 轉基因小鼠模型
[0070] 用于我們試驗中的ob/ob小鼠來源于Umd，Sweden，并在the Karolinska Hospital，在我們的動物核心設備中繁殖。所有的試驗都根據(jù)Karolinska Institutet的 試驗動物護理和使用的指導原則來實施，并被Karolinska Institutet的當?shù)貏游飩惱砦?員會批準。
[0071] 將胰腺小島移植到眼前房中
[0072] 由雌性供者小鼠分離小島，并移植到雄性受者的眼前房中。我們使用異氟 醚（Baxter)麻醉小鼠，并將大約10-20個小島移植到小鼠的眼前房中。每個試驗都 選擇具有相似尺寸的用于移植的小島，而無需考慮小鼠的基因型。對小鼠皮下注射 Temgesic (Schering-Plough)用于術后鎮(zhèn)痛。
[0073] 眼內小島移植物的體內成像
[0074] 在移植后，在特定的時間點對小鼠中的小島移植物進行體內成像。我們使用基于 TCS-SP2-A0BS (Leica)的具有長距水浸物鏡（Leica HXC-AP010X/0.30NA)的立式激光掃描 共聚焦顯微鏡，以及定制立體式頭部保持器，從而使包含移植小島的小鼠的眼睛定向于物 鏡。Viscotears (Novartis)用作眼睛和物鏡之間的浸漬液，并在體內成像過程中使用異氟 醚來麻醉小鼠。在633nm下通過激光照明來對小島的形態(tài)學