用于監(jiān)測肌體器官的生理狀態(tài)的方法
【專利說明】用于監(jiān)測肌體器官的生理狀態(tài)的方法
[0001] 交叉引用
[0002] 本申請要求2012年7月27日提交的美國臨時專利申請系列No. 61/676578的優(yōu) 先權(quán)，該申請的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。
【背景技術(shù)】
[0003] 大量的不同的試驗方法允許對β細胞團塊定量以及最終顯示小島重建。體外技 術(shù)包含在切開的胰腺組織中通過點計數(shù)形態(tài)測量學(xué)以及定向測量小島維度來分析胰腺的 組織切片。體外成像技術(shù)包含通過共聚焦顯微鏡或光學(xué)相干顯微鏡使由腹中取出的胰腺成 像。最終，多種非侵入性的體內(nèi)成像技術(shù)針對于總β細胞團塊的縱向定量，即，磁共振成像 (MRI)、正電子成像術(shù)（PET)、生物發(fā)光成像或結(jié)合的多模式成像。但是，這些技術(shù)僅提供了 小島可塑性的間接證據(jù)，因為這些不同的技術(shù)不能提供跟蹤個體小島在一段時間后形態(tài)學(xué) 改變的可能性。
[0004] 發(fā)明概述
[0005] 本發(fā)明提供了用于監(jiān)測受試對象中器官的生理狀態(tài)的方法，其包含監(jiān)測移植的組 織在受試對象的眼睛上在一段時間后的形態(tài)學(xué)改變，其中所述的組織得自所關(guān)注的器官， 并且其中移植的組織在受試對象的眼睛上在一段時間后的形態(tài)學(xué)改變表示受試對象中所 關(guān)注的器官的生理狀態(tài)。在一個實施方案中，所述的方法用于監(jiān)測處理過程對受試對象的 紊亂的效力。在該實施方案中，處理過程可以包含向受試對象給予治療，并且其中所述的方 法監(jiān)測了所述的治療對個體的效力。在另一個實施方案中，處理過程可以包含飲食和/或 運動方案，并且所述的方法監(jiān)測了飲食和/或運動方案在個體中的效力。
[0006] 在另一個實施方案中，移植的組織可以得自受試對象。在另一個實施方案中，所關(guān) 注的器官可以選自胰腺、肺、心臟、腦、腎臟、肝臟、小腸、大腸、結(jié)腸、胃、膽囊、食管、輸尿管、 尿道、卵巢、子宮、乳房、脊髓、前列腺、下丘腦、腎上腺、腦下垂體、甲狀腺、副甲狀腺、松果 體、脾、胸腺、直腸、乳腺、貯精囊、腎小球、脂肪組織、腫瘤和睪丸。
[0007] 在另一個實施方案中，所關(guān)注的器官可以包含外分泌腺，包含但不限于汗腺、唾液 腺、乳腺、胃、肝臟和胰腺。在另一個實施方案中，所關(guān)注的器官可以包含內(nèi)分泌腺，包含但 不限于腦下垂體、胰腺、卵巢、睪丸、甲狀腺和腎上腺。在一個實施方案中，所關(guān)注的器官為 胰腺。在該實施方案中，所述的組織可以包含分離的胰腺的胰島。
[0008] 在不同的實施方案中，形態(tài)學(xué)改變可以選自組織中細胞的尺寸、組織中細胞的體 積、組織中細胞的面積、組織中細胞的形狀、組織中細胞的死亡、組織中細胞的增殖、組織中 的細胞團塊、組織中的血液灌注、組織中細胞的光學(xué)反射率以及組織中細胞的顆?；?。在另 一個實施方案中，可以通過顯微鏡來監(jiān)測形態(tài)學(xué)改變。在其他的實施方案中，所述的受試對 象為非人的哺乳動物。在一個實施方案中，非人的哺乳動物具有人的疾病的動物模型。在 另一個實施方案中，所述的受試對象為人，其中所述的人患有與所關(guān)注的器官有關(guān)的疾病。 在多個實施方案中，所述的疾病可以包含糖尿病，所關(guān)注的器官可以為胰腺，或者所述的疾 病可以包含癌癥，因此所關(guān)注的器官包含腫瘤。在另一個實施方案中，所述的方法可以進一 步包含向受試對象給予治療或測試化合物，并監(jiān)測這種給藥所產(chǎn)生的形態(tài)學(xué)改變。
【附圖說明】
[0009] 圖1.在ob/ob小鼠胰腺中，小島的尺寸增大以適應(yīng)對胰島素的高需求。（A)ob/ob 小鼠（左側(cè)）的代表性形態(tài)學(xué)外觀與對照同窩幼崽（右側(cè)）相比，顯示出強烈的肥胖表現(xiàn) 型；(B)在不同年齡下，ob/ob和對照小鼠的禁食體重顯示在ob/ob小鼠中，肌體質(zhì)量快速增 加；（C)在ob/ob和對照小鼠中，禁食血糖和血漿胰島素的水平；(D) ob/ob的5 μ m厚的切 片的圖像蒙太奇；以及（E)使用蘇木精和伊紅染色的對照同窩幼崽的胰腺。注意在光照下， 小島切片染成灰色；(D，E)中的插圖顯示典型小島維度和形態(tài)學(xué)的放大圖。（A)小鼠為4月 齡，（C)小鼠為3月齡，（D，E)小鼠為8月齡。（B，C):混合的雄鼠和雌鼠的值（對于ob/ob 而言，η = 5只雄鼠 +4只雌鼠；對于對照同窩幼崽而言，η = 5只雄鼠 +5只雄鼠）。比例= 1mm，插圖維度表示Imm xlmm。值為平均值土標準誤；**p〈0. 01 ;***ρ〈0. 001。
[0010] 圖2.小島生長的體內(nèi)縱向成像。㈧將由4周齡的小鼠得到的小島移植到4周齡 對照（上面一排）和ob/ob(下面一排）小鼠的眼前房中。在不同時間點移植的眼睛的照 片顯示單一小島是可識別的，并且縱向跟蹤（參見黃色的虛線圈）；(B)小島移植物（在A 中用紅框標記）的放大圖顯示移植在ob/ob受者的虹膜上的小島中，具有清晰可見的大的 且扭曲的血管；(C)在移植后的1個月時，通過共聚焦顯微鏡對單一小島的體內(nèi)成像顯示對 照小鼠與ob/ob小鼠的小島移植物之間具有形態(tài)學(xué)差異。通過之前靜脈注射FITC標記的 右旋糖苷使血管化成像。注意反向散射體強度與血管直徑之間具有差異；(D)在移植后的 不同時間點，通過共聚焦顯微鏡使小島移植物在體內(nèi)成像；(E)通過反向散射體圖像分析 對小島體積的定量表明與對照（虛線）相比，在ob/ob(實線）中的生長顯著增加?；揖€表 示單一小鼠的平均小島體積，黑線表示每種基因型所獲得的平均值（n = 3) ;(F)免疫組織 化學(xué)分析顯示在ob/ob移植后的眼睛和胰腺中，β細胞強烈增殖，這可通過胰島素和Ki67 染色顯示；(G)由胰島素和DAPI染色來定量平均β細胞，證明由ob/ob小鼠（實線）得到 的β細胞明顯比由它們的對照同窩幼崽（虛線）得到的β細胞更大。這種過度生長是相 似的，并且與小島是否原位定位于胰腺中還是定位于移植的眼睛中（無顯著性差異）無關(guān)。 所有圖像均是代表性的。共聚焦圖像顯示為光學(xué)z-Stack的最大強度投影（MIP)。使用4 月齡的小鼠實施免疫組織化學(xué)試驗（η多3/組）。尺寸條=100 μ m。誤差條表示標準誤； *ρ〈0· 05 ;**ρ〈0· 01。
[0011] 圖3.瘦蛋白處理對ob/ob小鼠的生理作用。（A)ob/ob小鼠在3至4月齡時每天 接受瘦蛋白的腹膜內(nèi)注射。在處理前、處理過程中和處理后（通過垂直的虛線表示處理開 始和處理結(jié)束），監(jiān)測體重、血糖和血漿胰島素水平；(B)腹膜內(nèi)葡萄糖耐受測試顯示在4月 齡時，ob/ob小鼠與對照同窩幼崽相比，葡萄糖處理受損（上方跟蹤），其對瘦蛋白處理歸一 化，但未對假處理（中間跟蹤）歸一化。下方的條線圖顯示在由上述跟蹤得到的曲線下面 積（AUC)的值，證明瘦蛋白對葡萄糖處理的有利作用。值為平均值土標準誤；**p〈0. 01 ; ***ρ〈0· 001。
[0012] 圖4.瘦蛋白處理逆轉(zhuǎn)了 ob/ob小島的失調(diào)。（A)在3至4月齡的接受瘦蛋白處 理（上方）或假處理（下方）的ob/ob小鼠中，小島移植物的縱向體內(nèi)成像。通過鼠尾靜 脈注射右旋糖苷-FITC使脈管系統(tǒng)可視；(B)小島體積分析顯示，與假處理（白條）相比， 在瘦蛋白處理（灰條）過程中，小島生長逆轉(zhuǎn)；在瘦蛋白或假處理結(jié)束后，小島生長不具有 差異。（C)在瘦蛋白處理結(jié)束時，通過對胰島素和Ki67的免疫染色，對由ob/ob小鼠得到 的移植的眼睛和胰腺樣品實施的免疫組織化學(xué)證明β細胞增殖減慢（參見圖2F，用于比 較）。共聚焦圖像是代表性的，并且顯示為ΜΙΡ。尺寸條=100μπι。值為平均值土標準誤； ***ρ〈0· 001。
[0013] 圖5.瘦蛋白處理對小島內(nèi)血管化的作用。將小島移植到4周齡ob/ob小鼠的眼 前房中。在3月齡時，使小鼠每天接受瘦蛋白腹膜內(nèi)注射。（A)瘦蛋白給予對血管直徑具 有快速作用，這可由處理開始前和處理1周后同一小島的體內(nèi)成像可見（通過鼠尾靜脈注 射右旋糖苷-FITC使脈管系統(tǒng)可視）。在不同的時間點識別相同的血管節(jié)段，并測量它們 的直徑（參見紅線）。注意我們可以在給予瘦蛋白后觀察血管再生術(shù)（箭頭）；(B)單一血 管直徑的縱向分析表明在瘦蛋白處理前、處理過程中和處理后血管形態(tài)學(xué)的改變（上方跟 蹤表示在一段時間后，在ob/ob小鼠中由小島移植物得到的20個血管節(jié)段；下方條線圖顯 示相應(yīng)的平均每個月的直徑的增長）。共聚焦圖像是代表性的，并且顯示為MIP。尺寸條= 100 μπι。值為平均值土標準誤；**ρ〈0· 001 ;***ρ〈0· 0001。
[0014] 發(fā)明詳述
[0015] 所引用的所有參考文獻全部以引用方式并入本文。在本申請中，除非另作 說明，所用的技術(shù)都可以在多個公知的參考文獻的任一者中找到，例如：Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook, et al. , 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology(Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), "Guide to Protein Purification''in Methods in Enzymology (M.P.Deutshcer, ed. , (1990)Academic Press,Inc.) ；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innis, et al. 1990.Academic Press,San Diego, CA), Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique, 2ndEd. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. NewYork, NY), Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc. , Clifton, N. J.),和 the Ambion 1998Catalog(Ambion, Austin, TX)〇
[0016] 如本文所用，除非內(nèi)容中清楚地作出相反的說明，否則單數(shù)形式"a"、"an"和 "the"包含復(fù)數(shù)參照物。如本文所用，除非內(nèi)容中清楚地作出相反的說明，"和"與"或"可 交換使用。
[0017] 除非內(nèi)容中清楚地作出相反的說明，本發(fā)明的任一方面的所有實施方案可以組合 使用。
[0018] 在第一個方面中，本發(fā)明提供了用于監(jiān)測受試對象中器官的生理狀態(tài)的方法，其 包含移植的組織在受試對象的眼睛上在一段時間后的形態(tài)學(xué)改變，其中所述的組織得自所 關(guān)注的器官，并且其中移植的組織在受試對象的眼睛上在一段時間后的形態(tài)學(xué)改變表明受 試對象中所關(guān)注的器官的生理狀態(tài)。
[0019] 如以下的實例中所示，本發(fā)明人證明了基于移植到眼前房中的一些"報告小島"的 用途的新方法，其中所述的"報告小島"作為胰腺小島群在幾個月時間后原位發(fā)生形態(tài)學(xué) 改變的體內(nèi)指示劑。這一概念可以通過以下過程在實例中說明：肥胖誘導(dǎo)的小島生長和血 管化圖案變得縱向可視并可定量，其中所述的圖案隨后在藥品處理后被歸一化，由此第一 次顯示通過適應(yīng)于特定的需要而擴張或降低其胰島素的分泌潛力，使得單一小島重建的證 據(jù)。因此，"報告小島"作為胰腺中小島功能的光學(xué)可行的指示劑，并且可以作為個人體內(nèi)生 物標志物，其發(fā)揮有效的讀取器的作用，用于診斷