>[0117] 采用改良的Ellman體外酶活性篩選方法進(jìn)行，利用經(jīng)典的反應(yīng)體系：140iiL 0.lmol/LPBS(pH8. 0)，20yL待測(cè)樣品溶液（分別為樣品1?9)，20yL乙酰膽堿酯酶溶 液，依次加入96孔板中，震蕩混勻，4°C培養(yǎng)20分鐘。然后加10iiL0. 01M的DTNB，最后通 過(guò)加10iiLO. 075M的ATCI開始反應(yīng)。37°C培養(yǎng)20分鐘后，用酶標(biāo)儀在405nm下測(cè)量吸光 度（A)并根據(jù)下式計(jì)算抑制率：
[0118] 抑制率（％ ) = [1_(A實(shí)驗(yàn)-A實(shí)驗(yàn)對(duì)照V(A空白-A空白對(duì)照）]X100%。
[0119] 3、試驗(yàn)結(jié)果
[0120] 附圖1的結(jié)果顯示，山臘梅水提物50mg/ml、100mg/ml乙酰膽堿酯酶抑制率分別為 40. 58%、80. 36%;山臘梅醇提物50mg/ml、100mg/ml乙酰膽堿酯酶抑制率分別為60. 89%、 92. 37%;山臘梅石油醚提取物50mg/ml、100mg/ml乙酰膽堿酯酶抑制率分別為48. 26%、 60. 52%;異嗪皮啶0. 05mg/ml、0.lmg/ml乙酰膽堿酯酶抑制率分別是57. 56%，96. 87%;力口 蘭他敏（陽(yáng)性藥）〇. 〇lmg/ml乙酰膽堿酯酶抑制率為49. 82%。表明山臘梅水提、醇提、石油 醚提取物均有一定的抗乙酰膽堿酯酶作用，其中醇提物抑制活性最強(qiáng)，而異嗪皮啶的抑制 率與山臘梅醇提物的相當(dāng)，說(shuō)明異嗪皮啶為山臘梅醇提物中的有效成分。
[0121] 試驗(yàn)例2
[0122] 試驗(yàn)?zāi)康模荷脚D梅提取物改善老年癡呆病癥的試驗(yàn)
[0123] 本試驗(yàn)例選擇山臘梅提取物作為抗老年癡呆的藥物，通過(guò)建立東莨菪堿誘導(dǎo)的小 鼠學(xué)習(xí)記憶障礙癡呆模型，探討山臘梅醇提物對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用，旨在選擇一種療效確切、 副作用少的抗老年癡呆新藥物。
[0124] 1、材料與方法
[0125] 1.1藥品及試劑
[0126] 山臘梅樣品：
[0127] 樣品1 :實(shí)施例1的山臘梅醇提物；
[0128] 樣品2:實(shí)施例4的山臘梅水提物；
[0129] 樣品3:實(shí)施例7的山臘梅石油醚提取物。
[0130] 乙酰膽堿酯酶（AChE)，碘代硫代乙酰膽堿（ATCI)和5, 5'-二硫代雙硝基苯甲酸 (DTNB)均購(gòu)自Sigma公司；
[0131] 氫溴酸加蘭他敏：天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H41023666;
[0132] 氫溴酸東莨菪堿：徐州萊恩藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32022136;
[0133] 乙酰膽堿（ACh)和乙酰膽堿酯酶（AChE)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。
[0134] 1.2 動(dòng)物
[0135]SPF級(jí)KM小鼠，體重20_22g，武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為 NO. 42000500001804,生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂）2008-2004。鼠飼料，購(gòu)于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中心。
[0136] 2、試驗(yàn)方法
[0137] 2. 1動(dòng)物分組與處理
[0138] 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組3組和試驗(yàn)組5組：
[0139] 對(duì)照組：對(duì)照組1為正常組；對(duì)照組2為模型組；對(duì)照組3為模型+加蘭他敏組。
[0140] 試驗(yàn)組：試驗(yàn)組1為模型+0. 5g/kg山臘梅醇提物；
[0141] 試驗(yàn)組2為模型+0. 3g/kg山臘梅醇提物；
[0142] 試驗(yàn)組3為模型+0?lg/kg山臘梅醇提物；
[0143] 試驗(yàn)組4為模型+0?5g/kg山臘梅水提物；
[0144] 試驗(yàn)組5為模型+0. 5g/kg山臘梅石油醚提取物。
[0145] 上述各組均采用灌胃給藥，每日1次，連續(xù)21天。第16天開始，除對(duì)照組1外，其 余各組均于實(shí)驗(yàn)前30min給予腹腔注射3mg/kg氫溴酸東莨菪堿，制備小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙癡 呆模型。
[0146] 2. 2Morris水迷宮測(cè)試
[0147]Morris水迷宮主體為直徑100cm，高35cm的圓形水池，水池內(nèi)加入奶粉使水不透 明，且將迷宮均分為4個(gè)象限，水溫保持在（25±2)°C。另有一個(gè)白色圓形平臺(tái)（直徑9cm， 高29cm)，置于某一象限中央，位于水面下l-2cm，迷宮上方安置著連接顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)， 同步記錄小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡。測(cè)試方法參照現(xiàn)有的文獻(xiàn)進(jìn)行。第16天開始進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)， 歷時(shí)5天，每天1次。將小鼠面向池壁放入水中，記錄其在120s內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間（逃避 潛伏期）。超過(guò)120s找不到平臺(tái)，可引導(dǎo)其找到平臺(tái)并在平臺(tái)上滯留10s，逃避潛伏期記成 120s。第21天上午進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤除平臺(tái)，將小鼠隨機(jī)從某一象限面向池壁放入水 中，記錄120s內(nèi)小鼠尋找原平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)軌跡。
[0148] 2. 3生物化學(xué)檢測(cè)
[0149] 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)束后，處死小鼠，迅速取出腦組織，用生理鹽水制成10%勻漿， 放入低溫離心機(jī)中，3000r/min4°C離心lOmin，取上清液裝入試管中冷凍備用，按照試劑盒 說(shuō)明書進(jìn)行ACh、AChE的測(cè)定。
[0150] 3、試驗(yàn)結(jié)果
[0151] 3. 1山臘梅提取物對(duì)東莨菪堿誘導(dǎo)的記憶障礙的保護(hù)作用
[0152] 表1山臘梅提取物對(duì)東莨菪堿所致小鼠的記憶獲得性障礙的作用情況
[0153]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 山臘梅提取物在制備治療神經(jīng)系統(tǒng)性疾病和肌無(wú)力疾病的藥物中的用途。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其用于治療老年癡呆癥、腦卒中、精神分裂癥、抑郁癥、重 癥肌無(wú)力和進(jìn)行肌營(yíng)養(yǎng)不良。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述山臘梅提取物通過(guò)溶劑提取得到，所述 溶劑為乙醇、蒸餾水或石油醚。
4. 如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述溶劑為乙醇，所述山臘梅提取物為山臘 梅醇提物； 所述山臘梅醇提物的制備方法為：稱取重量份為100的山臘梅，粉碎，加入重量份為 500?1200的65?95%乙醇提取1?3次，每次提取時(shí)間為1?2h，將提取液過(guò)濾合并， 濃縮，即得山臘梅醇提物。
5. 如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述山臘梅醇提物中的有效成分為異嗪皮 啶。
6. 如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述溶劑為蒸餾水，所述山臘梅提取物為山 臘梅水提物； 所述山臘梅水提物的制備方法為：稱取重量份為100的山臘梅，粉碎，加入重量份為 500?1200的蒸餾水煎煮1?3次，每次煎煮時(shí)間為1?2h，將煎煮液過(guò)濾合并，濃縮，即 得山臘梅水提物。
7. 如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述溶劑為石油醚，所述山臘梅提取物為山 臘梅石油醚提取物； 所述山臘梅石油醚提取物的制備方法為：稱取重量份為100的山臘梅，粉碎，加入重量 份為500?1200的石油醚提取1?3次，每次提取時(shí)間為1?2h，將提取液過(guò)濾合并，濃 縮，加乙醇稀釋，即得山臘梅石油醚提取物。
8. 如權(quán)利要求1?7中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述山臘梅提取物的施用劑量 為0. 1?0. 5g/kg患者體重。
9. 如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述山臘梅提取物用于治療重癥肌無(wú)力時(shí) 的施用劑量為〇. lg/kg患者體重。
10. 如權(quán)利要求4?7中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，由所述山臘梅提取物和輔料 制備成口服制劑或注射劑； 所述口服制劑包括片劑和膠囊劑；所述口服制劑包括重量份數(shù)為50-150份的山臘梅 提取物、30-40份的淀粉、70-80份的糊精、1-3份的硬脂酸鎂、3-9份的滑石粉以及8-20份 的70 %乙醇溶液； 所述山臘梅提取物和注射用水制備成注射劑，所述注射用水與山臘梅提取物的重量份 數(shù)比為5-12 :1。
【專利摘要】本發(fā)明涉及提供一種山臘梅提取物的新用途，山臘梅提取物在制備治療神經(jīng)系統(tǒng)性疾病和肌無(wú)力疾病的藥物中的用途；具體為山臘梅提取物在制備治療老年癡呆、腦卒中、精神分裂癥、重癥肌無(wú)力、進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良的藥物中的用途；在上述用途中，山臘梅提取物通過(guò)溶劑提取得到，其溶劑為乙醇、蒸餾水或石油醚。該山臘梅提取物能有效改善患者上述疾病的癥狀，其療效確切、副作用少。
【IPC分類】A61P21-04, A61P9-10, A61P25-28, A61P21-00, A61P25-24, A61K36-185, A61P25-18
【公開號(hào)】CN104523779
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410798725
【發(fā)明人】丁虹, 李曉斐, 陶莉, 武雙嬋, 岳源, 杜思達(dá)
【申請(qǐng)人】武漢華納聯(lián)合藥業(yè)有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月19日