專利名稱：選擇性癌癥化療方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤細(xì)胞毒性化療方法。
在另一方面本發(fā)明涉及腫瘤細(xì)胞毒性化療組合物。
更獨特地，本發(fā)明涉及用來治療人類宿主中癌癥的腫瘤細(xì)胞毒性化療方法和組合物化療的有害的副作用可包括脫發(fā)、惡心和嘔吐、心毒性和繼發(fā)癌癥。很多細(xì)胞毒性劑的最常見副作用毒性表現(xiàn)之一是骨髓抑制，骨髓抑制可以導(dǎo)致免疫抑制和造血功能不良。因為感染并發(fā)癥是癌癥患者死亡的主要原因之一，所以非常期望提供無毒性的沒有免疫抑制副作用的腫瘤細(xì)胞毒性化療組合物和方法。
具有維生素C活性的化合物，例如抗壞血酸(AA)和抗壞血酸鹽衍生物，不是免疫抑制的，而是對多種癌癥有效的靜脈注射的細(xì)胞毒性化療劑。Riordan等，醫(yī)藥假說(Medical Hypotheses)，1995，44，207-213。但是，在人類組織中沒有維生素C的貯存機(jī)制，維生素C全部被代謝和/或排泄掉。進(jìn)一步，由于胃腸道并發(fā)癥，難以通過抗壞血酸的口服給藥建立和維持維生素C的高血清水平。所以，通常認(rèn)為為了建立和維持產(chǎn)生有效細(xì)胞毒性的血漿水平，必須通過靜脈施用抗壞血酸。因此，提供含有非抗壞血酸形式的維生素C腫瘤化療組合物是非常有優(yōu)勢的，可以用足以建立和維持血清維生素C腫瘤細(xì)胞毒性水平的劑量口服給藥。
但是，由于如果血漿濃度足夠高即使是維生素C也可以對正常人細(xì)胞有毒性，所以非常期望提供口服或靜脈注射劑型的選擇性維生素C腫瘤化療組合物，其可在比抗壞血酸引起腫瘤細(xì)胞凋亡所需的血漿濃度更低的血漿濃度引起細(xì)胞凋亡。由于這種劑型給藥的維生素C腫瘤細(xì)胞毒性濃度較低，建立和維持一種化療上有效的血漿濃度是更可行的，其可比正常細(xì)胞的細(xì)胞凋亡維生素C血漿水平低。
Elvin等(歐洲癌癥臨床腫瘤學(xué)雜志(Eur.J.Cancer Clin.Oncol.)，17(7)759-65(1981))報告，抗壞血酸與醛(例如甲基乙二醛、乙酰丙烯醛)的加合物抑制小鼠中歐利希氏腹水瘤的生長。
EP-A-0086544提出抗壞血酸的縮酮和縮醛作為血管生成抑制劑的用途。(血管生成是指新血管生成的過程，在腫瘤生長中包括新血管的增生。)EP-A-0148094和美國專利5,032,610提出口服或靜脈注射給藥5，6-O-苯亞甲基-L-抗壞血酸及其鹽和其與L-抗壞血酸的混合物表現(xiàn)出抗癌性質(zhì)。
3-氨基-1，2，4-三唑的同時給予增強(qiáng)抗壞血酸對歐利希氏腹水腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，維生素K3(甲萘醌重亞硫酸鹽)的增加看來好像增加抗壞血酸的優(yōu)先腫瘤細(xì)胞毒性。Benande等，腫瘤學(xué)(Oncology)，2333-43(1969)。
同樣，以前的工作者提出Cu2+的催化濃度增加抗壞血酸對包括4種人源株在內(nèi)的幾種惡性黑素瘤細(xì)胞系的優(yōu)先毒性。Bram等，自然(Nature)284629-631(1980)。
有報道，來源于患者的幾種白血病、前白血病和骨髓瘤先祖細(xì)胞對體內(nèi)可達(dá)到的對正常造血細(xì)胞無任何毒性的抗壞血酸濃度敏感。Park等，癌癥研究，41062-65(1980)；美國臨床營養(yǎng)學(xué)技術(shù)(Am.J.Clin.Nutr.)541241S-46S(1991)。
圖2是相似的條形圖，如試驗1說明的，闡明在優(yōu)選發(fā)明的實施使用的“無機(jī)抗壞血酸鹽加代謝產(chǎn)物”組合物對不同腫瘤細(xì)胞類型相對于正常細(xì)胞的選擇性。
在施行本發(fā)明方法中有用的本發(fā)明的新化療組合物包含在藥理學(xué)上可接受的靜脈注射載體中的這樣的化療組合物成分。發(fā)明優(yōu)選的實施方案上文描述的化療組合物成分是以適當(dāng)?shù)谋壤唵蔚鼗旌显谝黄鸬摹?zhǔn)確的比例不是非常關(guān)鍵?？刹僮鞯暮妥罴训谋壤梢员粵Q定和在一定限度內(nèi)可以改變，這可以由那些本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過適當(dāng)?shù)脑囼瀬頉Q定，例如通過體外試驗(如下面描述的那些)?；蛘?，按照本發(fā)明目前優(yōu)選的實施方案，含有適當(dāng)比例這些成分的合適的無機(jī)抗壞血酸鹽代謝產(chǎn)物組合物是商業(yè)可得的，來自Inter-Cal公司，Prescott，Arizona，美國，注冊商標(biāo)ESTER-C。這些組合物在美國專利4,822,816；4,968,716；和5,070,085中被進(jìn)一步描述，在這里引用作為參考。
通過本發(fā)明的化療方法和組合物提供的細(xì)胞毒性有效的維生素C血漿濃度將根據(jù)被治療的腫瘤細(xì)胞的特殊類型而變化，該濃度可以按照本領(lǐng)域周知的技術(shù)通過如下文描述的體外試驗、動物試驗和人體內(nèi)試驗來決定。
為了靜脈注射給藥，本發(fā)明的化療組合物按照本領(lǐng)域周知的技術(shù)被制備，方法是使無機(jī)抗壞血酸和維生素C代謝產(chǎn)物成分包含在藥理學(xué)上可接受的靜脈注射載體中，即在一種載體中的成分的無菌、無毒溶液經(jīng)配制以提供適當(dāng)?shù)臐B透壓濃度、pH等。例如，林格氏乳酸鹽是一種合適的靜脈注射載體。
在靜脈載體中的維生素C的濃度為了適應(yīng)治療的需要可以在寬范圍內(nèi)變化。例如，當(dāng)期望建立抗壞血酸當(dāng)量(equivalent)血漿濃度在150-200mg/dL范圍內(nèi)時，一種適當(dāng)?shù)挠糜?小時，1000cc輸注的劑量是無機(jī)鹽提供的100-150mg抗壞血酸鹽。在達(dá)到和維持期望的血漿濃度前有可能要求重復(fù)幾次這樣的輸注，這取決于患者系統(tǒng)對抗壞血酸鹽破壞、消除或排泄的能力。
使用含有無機(jī)抗壞血酸鹽/維生素C代謝產(chǎn)物組合物的口服劑型，建立有效引起一些類型腫瘤細(xì)胞凋亡的這些組合物的初始血漿濃度也是可能的。按照現(xiàn)有的信息，在每天大約12-15g抗壞血酸鹽口服劑量范圍，大約可以達(dá)到5mg/dL的血漿水平(AA當(dāng)量)，這足以引起黑素瘤和肝細(xì)胞瘤細(xì)胞選擇性細(xì)胞凋亡。
而且，一旦通過靜脈注射給藥獲得選擇性引起腫瘤細(xì)胞凋亡的血漿濃度，則可以通過口服劑型給藥或口服和靜脈注射給藥的組合來維持濃度。
實施例提出下面的實施例是為了對本領(lǐng)域人員說明本發(fā)明的實施和確認(rèn)目前優(yōu)選的實施方案，不要被認(rèn)為是對本發(fā)明的范圍的限制。
檢測幾種腫瘤細(xì)胞系和相應(yīng)的正常非惡性細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡是通過Ester-C(抗壞血酸鈣加代謝產(chǎn)物)，相對于4種其他試驗組合物單獨抗壞血酸鈣(CA)，單獨蘇糖酸鈣(CT)，抗壞血酸鈣加蘇糖酸鈣(CA＋CT)和無菌水(sH2O)。
實施例1試驗步驟細(xì)胞系Malme-3M 人黑素瘤(ATCC編號HTB-64)Malme-3正常人皮膚成纖維細(xì)胞(ATCC編號HTB-102)SK-Hep-1 人肝腺癌(ATCC編號HTB-52)WRL正常人肝細(xì)胞(ATCC編號CL-98)SK-N-MC人成神經(jīng)細(xì)胞瘤(ATCC編號HTB-10)T-84 人結(jié)腸癌(ATCC編號CCL-248)貯存細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如下細(xì)胞系生長培養(yǎng)基SK-Hep-1，SK-N-MC和在Earle氏鹽中的Eagle氏最低必需培WRL 88 養(yǎng)基，補(bǔ)加上2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，10％胎牛血清(FBs)和抗生素(青霉素，鏈霉素，兩性霉素B)Malme-3和Malme 3-M McCoy氏培養(yǎng)基，加上L-谷氨酰胺，15％FBs和抗生素T-84 Dulbecco氏改變的MEM和Ham氏F-12培養(yǎng)基1∶1混合，補(bǔ)加上L-谷氨酰胺，鹽酸吡哆醛，25mM Hepes加5％FBS和抗生素所有培養(yǎng)物被維持在37℃5％CO2/95％空氣的濕化空氣中。培養(yǎng)基和培養(yǎng)試劑從Life Techonologies(Gibco/BRL，Long Island，NY)獲得。FBS從Hyclone Labs(Logan，UT)獲得。
試驗材料從Inter-Cal公司(Prescott，AZ)獲得，如下試驗1 Ester-C無機(jī)抗壞血酸鹽(見下文)試驗2 抗壞血酸鈣(USP級)，82.15％抗壞血酸(AA)當(dāng)量試驗3 蘇糖酸鈣，87.08％L-蘇糖酸(TA)當(dāng)量試驗4 抗壞血酸鈣(U.S.P.)＋U.S.P.鈣，81.21％AA，1％TA當(dāng)量試驗5 抗壞血酸通過實驗室分析，試驗1材料含有如下物質(zhì)抗壞血酸鈣 78.4％AA當(dāng)量蘇糖酸鈣 0.9％AA當(dāng)量其它AA代謝產(chǎn)物110.4％AA當(dāng)量結(jié)晶水 平衡注1醛糖酸，醛糖酸內(nèi)酯，醛糖酸交酯和無毒的醛糖酸金屬鹽，脫氫抗壞血酸，蘇糖，赤蘚糖，4-羥基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮，3-羥基曲酸和5-羥基落葉松皮素抗壞血酸(組織培養(yǎng)級)從Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)獲得。對照組合物由適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基，林格氏溶液或無菌水組成。
所有工作液在使用前從母液新鮮配制。AA的60mM貯存母液在無血清的培養(yǎng)基中配制，貯存在-15℃。工作液用生長培養(yǎng)基從10倍濃度貯存液稀釋配制。30mM(1gm/％)蘇糖酸鈣貯液用林格氏液(Fay和Verlangieri，生命科學(xué)(Life Sciences)，491377(1991))或溫?zé)o菌水配制。工作液制備為1×貯液(在林格氏液中)或10×貯液(在sH2O中)，這取決于治療的性質(zhì)，也就是說短期還是連續(xù)的(見下文)。
為評價試驗1的材料，1-1.3％試驗材料貯存母液在溫?zé)o菌水中配制。工作貯存液(10倍濃度)在使用前用無菌水新鮮配制。為比較性評價，試驗2和試驗4貯存液用無菌水制備，被標(biāo)化成含有與試驗1貯液相同AA當(dāng)量。這些貯液貯存在室溫用于評價。
實施例2用抗壞血酸和/或蘇糖酸鈣處理細(xì)胞培養(yǎng)物在新鮮配制的補(bǔ)充物由抗壞血酸(AA)或抗壞血酸鈣(CA)組成的遞增濃度存在下，0.25-1.0×105腫瘤來源的細(xì)胞或正常肝細(xì)胞系的細(xì)胞被接種和培養(yǎng)在24孔板的單個孔中。培養(yǎng)物被周期地添加各自的補(bǔ)充物，依所示有或沒有培養(yǎng)基的改變。對照由接受沒有添加補(bǔ)充物的生長培養(yǎng)基的細(xì)胞組成。
為了用蘇糖酸鈣處理，細(xì)胞被允許通過過夜溫育附著。第二天，使用二種方案中的一種開始蘇糖酸鹽處理。
在一種方案中(短期暴露)，洗滌單層細(xì)胞，在37℃直接短時期暴露于1ml/孔的7.5-30mM蘇糖酸鹽(在林格氏液中配制)，如Fay和Verlangieri所述(上文作為參考)。對照用相同間隔暴露于1ml/孔的單獨的林格氏液中。暴露后，溶液被移除，用生長培養(yǎng)基替代。
在另一種方案中(連續(xù)暴露)，十分之一體積的10×蘇糖酸鹽(在無菌水中制備)被加入到培養(yǎng)基中，在37℃繼續(xù)溫育。這一相同處理通過每天的添加新鮮工作液來重復(fù)。
實施例3抗壞血酸加蘇糖酸鈣處理細(xì)胞培養(yǎng)物如實施例2，細(xì)胞用蘇糖酸鈣(CT)在37℃處理60分鐘，接下來加入在林格氏液中的抗壞血酸(AA)，連續(xù)溫育30分鐘。在處理期結(jié)束時，溶液被移除，用1ml/孔的生長培養(yǎng)基替代。
實施例4用試驗1(Ester-C抗壞血酸鈣加代謝產(chǎn)物)和試驗4(抗壞血酸鈣加蘇糖酸鈣)處理細(xì)胞培養(yǎng)物被接種在24孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)物的不全融合單層，經(jīng)補(bǔ)充十分之一體積工作貯液，達(dá)到在試驗1中的終濃度在0.006-0.06％范圍內(nèi)(相當(dāng)于0.28mM-2.8mM抗壞血酸當(dāng)量)?？椎钠叫薪M被相似地用CA＋CT和單獨CA貯液處理，貯液含有如試驗1的AA相當(dāng)量。對照培養(yǎng)物被用等體積無菌水處理。以1-2天間隔用這些組合物周期性處理通過直接加新鮮溶液(無生長培養(yǎng)基的改變)重復(fù)。
實施例5細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡(細(xì)胞凋亡)的分析通過使用Nuebauer血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行存活細(xì)胞計數(shù)，以預(yù)先決定的間隔處理后評估細(xì)胞存活。有存活力的細(xì)胞是指如以前描述的(Harakeh和Jariwalla，美國臨床營養(yǎng)學(xué)雜志541231S-1235S(1991))能排除臺盼藍(lán)的那些。數(shù)據(jù)被用于繪制有活力細(xì)胞培養(yǎng)物(每毫升細(xì)胞的數(shù)目)相對于試驗溶液濃度的圖，以評價細(xì)胞存活效果。
用Boehringer-Mannheim(Indianapolis，IN)開發(fā)的一種酶聯(lián)免疫法(ELISA)評價不同腫瘤細(xì)胞類型經(jīng)實施例1中描述的試驗組合物和對照處理后的細(xì)胞凋亡發(fā)生。這種分析特異性地篩選和檢測出現(xiàn)在被處理細(xì)胞胞漿中相對于未被處理對照的組蛋白結(jié)合DNA復(fù)合物(核小體片段)。使用Boehringer-Mannheim提供的細(xì)胞死亡檢測ELISA試劑盒中指定的步驟，確定不同處理后胞漿裂解物中核小體片段的存在和水平。
簡單地說，ELISA分析如下進(jìn)行。在用試驗組合物處理的不同間隔，吸出培養(yǎng)基，細(xì)胞膜用200-500μl裂解液室溫溫育30分鐘裂解。細(xì)胞裂解物被收集在Eppendorf離心管中，2500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，以分離核級分。含有胞漿級分的上清液等份被用于用分光光度計在410nm的酶標(biāo)儀上定量核小體片段。
數(shù)據(jù)被如下處理410nm平均吸收值相對于試驗化合物濃度作圖，以比較每一處理確定的相對引起細(xì)胞凋亡的劑量，且數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。最小的引起細(xì)胞凋亡的劑量被定義為引起對于未處理的對照而言細(xì)胞凋亡(也就是核蛋白的水平)2倍改變所需的劑量。最大細(xì)胞凋亡被定義為相對于對照的細(xì)胞凋亡的最大倍數(shù)的改變。
表1數(shù)據(jù)總結(jié)最小細(xì)胞凋亡劑量最大細(xì)胞凋亡倍數(shù)增加組合物細(xì)胞株劑量濃度處理 劑量濃度 處理最大細(xì)胞凋(％) 次數(shù)(％)次數(shù)亡倍數(shù)增加[抗壞血 Malme-30.025 20.033 2 3.58酸鈣＋代 Malme-3M 0.006 10.025 2 116謝產(chǎn)物] WRL-68 0.006-0.012 30.025 2 2.04SK-Hep-1 0.006 30.033 3 14.9SK-N-MC0.008 20.033 4 13.6T-84 0.015 30.02-0.03 4 4[抗壞血 Malme-30.025 20.025 2 2.16酸鈣＋蘇 Malme-3M 0.012 20.025 2 65.7糖酸鈣] WRL-68＞0.05 30.0125 2 1.68SK-Hep-1 0.006 30.033 3 9.31SK-N-MC0.015 40.033 4 7.02T-84 ＞0.06 30.033 3 1.5抗壞血酸 Malme-30.025 20.025 2 2.16鈣Malme-3M 0.012 20.025 2 92.8WRL-68 0.012 30.012 3 2.22SK-Hep-1 0.006 30.033 3 12.04SK-N-MC0.015 40.015 4 5.03T-84 ＞0.06 30.033 3 1.77在上面的表1中“最小細(xì)胞凋亡劑量”是引起相對于對照的細(xì)胞凋亡2倍改變所需的組合物的濃度?！疤幚淼拇螖?shù)”是用組合物處理的總次數(shù)?！白畲蠹?xì)胞凋亡倍數(shù)增加”是相對于對照的細(xì)胞凋亡的最大倍數(shù)改變，“最大劑量”是與對照相比引起“最大倍數(shù)細(xì)胞凋亡”的組合物濃度。
結(jié)論上文描述的試驗結(jié)果引出以下的結(jié)論由試驗1組合物說明的無機(jī)抗壞血酸鹽/維生素C代謝產(chǎn)物組合物以一種劑量依賴的方式引起多種腫瘤細(xì)胞類型的選擇性細(xì)胞死亡(細(xì)胞凋亡)。
無機(jī)抗壞血酸鹽/維生素C代謝產(chǎn)物組合物(如由試驗1組合物說明的)引起細(xì)胞凋亡(也就是說細(xì)胞死亡率最小2倍增加)，是在比單獨用無機(jī)抗壞血酸鹽(如由試驗2組合物說明的)或者單獨用無機(jī)抗壞血酸引起這種降低所需的更低的濃度下。
用無機(jī)抗壞血酸鹽/維生素C代謝產(chǎn)物組合物(如試驗1組合物說明的)引起的針對特異細(xì)胞類型之細(xì)胞凋亡最大水平比單獨用無機(jī)抗壞血酸鹽或單獨用抗壞血酸引起的高。
引起腫瘤細(xì)胞細(xì)胞凋亡所需的無機(jī)抗壞血酸鹽/維生素C代謝產(chǎn)物組合物(如試驗1組合物說明的)的AA當(dāng)量的濃度比正常細(xì)胞所需的低，正常細(xì)胞中細(xì)胞死亡的量明顯少于腫瘤細(xì)胞中的情況。
用抗壞血酸(AA)和/或蘇糖酸鈣(如實施例2說明的)處理細(xì)胞培養(yǎng)物，與他們的各自正常細(xì)胞對應(yīng)物相比，引起肝細(xì)胞瘤和黑素瘤中選擇性的劑量依賴性細(xì)胞死亡(細(xì)胞凋亡)。
肝細(xì)胞瘤細(xì)胞用CT預(yù)處理后應(yīng)用AA處理，引起比相應(yīng)劑量的單獨AA或CT處理更高的細(xì)胞凋亡水平。
為使本領(lǐng)域技術(shù)人員理解和使用本發(fā)明，在這里描述了本發(fā)明，而且，描述了它的目前優(yōu)選的實施方案。
權(quán)利要求
1.一種包括使腫瘤細(xì)胞與一種組合物接觸的步驟的選擇性化療方法，所述組合物包含(a)一種血漿可溶的抗壞血酸的金屬鹽；和(b)一種或者多種維生素C代謝產(chǎn)物，選自(i)醛糖酸，醛糖酸內(nèi)酯，醛糖酸交酯和其無毒的金屬鹽，和(ii)脫氫抗壞血酸，蘇糖，赤蘚糖，4-羥基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮，3-羥基曲酸和5-羥基落葉松皮素。
2.一種組合物，其包含在藥理學(xué)上可以接受的靜脈注射載體中的權(quán)利要求1的化療組合物。
全文摘要
一種選擇性化療方法,包括使腫瘤細(xì)胞與一種無機(jī)抗壞血酸鹽/維生素C代謝產(chǎn)物組合物接觸的步驟。一種化療組合物,其包含一種在藥理學(xué)上可以接受的靜脈注射的載體中的無機(jī)抗壞血酸鹽/維生素C代謝產(chǎn)物組合物。
文檔編號A61K31/7004GK1329489SQ99813918
公開日2002年1月2日 申請日期1999年8月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月30日
發(fā)明者R·J·賈里瓦拉 申請人:奧克斯可爾實驗室公司