專利名稱：細小病毒衣殼顆粒抑制細胞增生及遷移的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抑制細胞生長和遷移的方法和組合物的發(fā)現(xiàn)。更確切地，B19細小病毒衣殼或B19細小病毒衣殼蛋白片段可用于生產藥物，這些藥物施用于受試者以抑制含有P抗原的細胞(包括但不限于造血源細胞和內皮細胞)的生長和/或遷移。
背景技術：
B19細小病毒是一種人致病原，它與患免疫妥協(xié)或溶血性貧血的患者的不同的臨床癥狀，從中度癥狀(傳染性紅斑)到更為嚴重的疾病相聯(lián)系。胎兒水腫和宮內胎兒死亡是孕期B19感染的眾所周知的綜合征(Anderson和Young，病毒學專論(Monographs in Virology)，20(1997))。B19細小病毒顆粒呈二十面體對稱，直徑18-26nm，由60個衣殼蛋白組成，大約95％為主要衣殼蛋白(VP2)，其分子量為58 kd。(Fields等人，病毒學(Virology)，2卷，3版，賓西法尼亞，費城，LipponcottRaven出版社出版，2202頁(1996))，構成B19細小病毒衣殼的大約3-5％的衣殼蛋白為分子量83kd的次要衣殼蛋白質(VP1)，VP1與VP2的不同是在氨基端的額外227個氨基酸(參考文獻同上)。
B19細小病毒特別容易感染人紅細胞和骨髓培養(yǎng)物。例如，B19細小病毒與人紅細胞系先祖細胞結合，通過在這些細胞中復制而抑制造血集落形成。(Brown等人，科學(Science)，262114(1993)；Mortimer等人，自然(Nature)，302426(1983))。感染個體的骨髓樣本中也發(fā)現(xiàn)造血細胞抑制，導致暫時性貧血，個別情況出現(xiàn)暫時性各類血細胞減少。(Saunders等人，英國血液學雜志(Br J Haematol)，63407(1986))。進一步發(fā)現(xiàn)，在天然和試驗性人體感染中，B19細小病毒引起骨髓抑制。(Anderson和Young，病毒學專論，20(1997))。
已鑒定出B19細小病毒的細胞受體為紅細胞糖苷脂或紅細胞P抗原，一種四己糖神經酰胺(tetrahexoceramide)。(Fields等人，病毒學，2卷，3版，賓西法尼亞，費城，Lipponcott Raven出版社出版，2204頁(1996))。P抗原見于成熟的紅細胞、紅細胞系先祖細胞、巨核細胞、內皮細胞、腎皮質、胎盤、胎兒心肌(von dem Brone等人，英國血液學雜志，6335(1986))和胎肝中的原紅細胞(Morey和Flemming，英國血液學雜志，82302(1992))中。先天缺乏P抗原的個體對B19細小病毒感染不敏感，給予過量P抗原或抗P抗原的單克隆抗體可保護紅細胞系先祖細胞免受B19細小病毒的感染。(參考文獻同上)另外，還生產了能識別B19細小病毒顆粒的幾個區(qū)域的中和抗體。例如，針對VP2抗原決定簇，比如見于氨基酸38-87、253-272、309-330、328-344、359-382、449-468和491-515中，及VP1的特有區(qū)域的單克隆抗體可中和B19細小病毒(Fields等人，病毒學，2卷，3版，賓西法尼亞，費城，Lipponcott Raven出版社出版，2207頁(1996))。
也已開發(fā)出用于生產B19細小病毒抗原的基因工程表達體系(Kajigaya等人，美國國家科學院院報(Proc Natl Acad SciUSA)，867601(1989)；Kajigaya等人，美國國家科學院院報，884646(1991).)。在桿狀病毒體系中產生的重組B19細小病毒衣殼，與天然顆粒一樣由VP1和VP2組成，這些衣殼蛋白自我組裝成病毒樣顆粒(VLP)。(Kajigaya等人，美國國家科學院院報，864646(1991))。對B19細小病毒衣殼的電子顯微鏡分析表明，VLP的結構與血漿衍生的病毒顆粒相類似(Kajigaya等人，美國國家科學院院報，864646(1991))。B19 VLP目前正被評價為一種潛在的抗B19細小病毒感染的疫苗，初步結果表明其具有良好的中和作用且沒有嚴重的不良反應。(Bostic等人，感染病學雜志(J.Infect.Dis.)，179619(1999))。許多人正嘗試施用B19衣殼來防止B19細小病毒感染，但還沒有人試圖利用B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白或其片段的性質以開發(fā)新的抑制細胞增生或遷移的藥物。
發(fā)明簡述在此所述的發(fā)明中，發(fā)明人公開了B19細小病毒衣殼、B19細小病毒衣殼蛋白或其片段抑制含有P抗原的細胞之生長和/或遷移的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明實施方案包括含有B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白或其片段的藥物，其可施用于需要抑制細胞生長和/遷移的藥劑之受試者。與造血細胞或內皮細胞的增生或遷移有關的疾病或病情治療方法也在本發(fā)明范圍內。
例如，一個實施方案涉及空的、非感染性的重組B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白或B19衣殼蛋白片段生產用于抑制含有P抗原的細胞生長或遷移的藥物的用途。根據(jù)這一用途，該藥可用于抑制造血細胞的生長、內皮細胞的生長或遷移。另外，根據(jù)這一用途，該藥還可用于治療造血細胞增生紊亂、血管生成、腫瘤發(fā)生或內皮細胞向植入的修補裝置中的內生。更進一步，根據(jù)此用途，該藥物可用于干細胞移植前對受試者的治療，該受試者可以是胎兒。
在另一個實施方案中，提供了抑制含有P抗原的細胞生長或遷移的方法。此方法包括下列步驟將選自B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白和其片段的衣殼劑與細胞接觸，然后測定細胞生長或遷移的抑制。在某些方面，這個細胞可以是造血源細胞或內皮細胞。
本發(fā)明還包括了一種干細胞移植前治療受試者的方法。此方法的實行包括鑒定需要抑制造血細胞生長的衣殼劑的受試者，并向需要的受試者提供有效量的選自B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白和其片段的衣殼劑。同樣，另一項相關的實施方案涉及一種治療造血細胞增生紊亂的受試者的方法，包括下列步驟鑒定需抑制造血細胞增生紊亂的衣殼劑的受試者，并向需要的受試者提供有效量的選自B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白和B19衣殼蛋白片段的衣殼劑。
本發(fā)明還提供了一種抑制組織向植入假體內生長的方法。該方法包括下列步驟鑒定需抑制組織向植入假體生長的衣殼劑的受試者，并向需要的受試者提供有效量的選自B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白和B19衣殼蛋白片段的衣殼劑。另一個實施方案涉及一種治療或防止腫瘤發(fā)生的方法，該方法包括下列步驟鑒定需抑制造血細胞生長的衣殼劑的受試者，并向需要的受試者提供有效量的選自B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白和B19衣殼蛋白片段的衣殼劑。
一種含有衣殼劑的試劑盒也是本發(fā)明的一個實施方案，此試劑盒包括一種選自B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白和B19衣殼蛋白片段的衣殼劑，以及用于抑制造血先祖細胞生長、內皮細胞生長抑制或治療造血細胞增生的受試者的劑量和施用的說明。
附圖簡述

圖1本圖以示意圖形式表示用不同濃度的B19細小病毒衣殼(VP1/2)對人臍帶血細胞所作的集落形成試驗結果。
圖2本圖以示意圖形式表示用不同濃度的B19細小病毒衣殼(VP1/2)對猴(狒狒和短尾猴)骨髓細胞所作的集落形成試驗結果。
圖3本圖以示意圖形式表示用不同濃度的B19細小病毒衣殼(BacVP1/2)、僅含有VP2(BacVP2 only)的B19細小病毒衣殼或對照抗原(Bac對照抗原)對人胎肝細胞所作的集落形成試驗結果。
圖4本圖以棒狀圖形式表示用不同濃度的對照抗原(KYVTGIN)(SEQ ID No.1)接觸人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)所作的細胞增生試驗結果。x軸代表逐漸增加的對照抗原的濃度(從左到右)，0μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml、10.0μg/ml，y軸代表540nm處的吸光度(A540)。
圖5本圖以棒狀圖形式表示用不同濃度、僅含有VP1的B19細小病毒衣殼接觸人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)所作的細胞增生試驗結果。x軸代表逐漸增加的B19細小病毒衣殼(VP1)濃度(從左到右)，0μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1.0μg/ml，10.0μg/ml，y軸代表540nm處的吸光度(A540)。
圖6本圖以棒狀圖形式表示用不同濃度的B19細小病毒衣殼(VP1/2)接觸人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)所作的細胞增生試驗結果。x軸代表B19細小病毒衣殼(VP1/2)逐漸增加的濃度(從左到右)，0μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml、10.0μg/ml，y軸代表540nm處的吸光度(A540)。
圖7本圖以棒狀圖形式表示用不同濃度的B19細小病毒衣殼(VP2)對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)所作的細胞增生試驗結果。x軸代表逐漸增加的B19細小病毒衣殼(VP2)濃度(從左到右)，0μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml、10.0μg/ml，y軸代表540nm處的吸光度(A540)。
圖8本圖以棒狀圖形式表示用不同濃度的B19細小病毒衣殼(VP1/2)、僅含有VP1的B19細小病毒衣殼(VP1 only)、僅含有VP2的B19細小病毒衣殼(VP2 only)或對照抗原接觸人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)細胞所作的細胞遷移試驗結果。
發(fā)明詳述在此所述的發(fā)明中，發(fā)明人公開了B19細小病毒衣殼、B19細小病毒衣殼蛋白或其片段抑制含有P抗原的細胞生長和/或遷移的發(fā)現(xiàn)。通過集落形成試驗，發(fā)明人證明了由VP1和VP2組成的B19細小病毒衣殼或僅含VP2的B19細小病毒衣殼能抑制幾種不同類型造血源細胞(包括人胎肝細胞、人臍帶血細胞、成人骨髓細胞)的生長。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)B19細小病毒衣殼抑制獲自狒狒和短尾猴骨髓細胞的生長。更進一步通過用針對P抗原的單克隆抗體、已知的抑制B19細小病毒感染的單克隆抗體和獲自兩例無癥狀個體的B19 lgG陽性血清所作的中和試驗，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)B19細小病毒衣殼通過涉及P抗原的相互作用來抑制造血細胞生長。另外，通過B19細小病毒衣殼與含P抗原的細胞孵育后再進行免疫標記，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)B19細小病毒衣殼在含有P抗原的細胞中被內化。
發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)B19細小病毒衣殼抑制內皮細胞的增生和遷移。通過在B19細小病毒衣殼存在時人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)與成纖維細胞生長因子的接觸來進行內皮細胞的增生試驗。用結晶紫染色監(jiān)測細胞的增生，結果證明B19細小病毒衣殼有效地降低內皮細胞的增生。用Boyden小室試驗，發(fā)明人進一步證明B19細小病毒衣殼抑制HUVEC的遷移。
本發(fā)明的幾個實施方案涉及修飾的B19細小病毒衣殼的生產。發(fā)明人公開了許多生產含小于5％VP1的B19細小病毒衣殼及僅含VP2的B19細小病毒衣殼的方法。發(fā)明人進一步教導了生產B19衣殼蛋白片段及與這些肽相類似的肽模擬物的方法，這些肽模擬物可用于抑制含P抗原的細胞的生長和/或遷移。本發(fā)明中的肽片段長度至少為3個氨基酸，可多至780個氨基酸，可包含保守氨基酸替換。另外，B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白或B19衣殼蛋白片段可通過引入B19衣殼蛋白中非天然的取代基團、引入突變或通過產生融合蛋白質而進行修飾。衍生的或合成的B19衣殼蛋白也是一種實施方案。發(fā)明人還教導了引起受試者較小免疫反應以用于長期治療方案的設計和生產B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白或其片段的方法。更進一步，發(fā)明人描述了各種以B19衣殼為基礎的治療方法的構建，包括如下信息序列的信息、突變或修飾的位點、功能分析的實施信息及包括疾病指征、臨床評價之類的治療信息。
本發(fā)明的其它實施方案包括B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白或其片段的多聚體展示的制備，這些多聚體是通過支持物(可以為珠、樹脂、塑料盤，優(yōu)選為醫(yī)學裝置，如斯坦特固定膜、瓣膜或其他假體)與B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白或其片段連接制得。這些多聚體展示可提供抑制含P抗原的細胞的增生和/或遷移(例如，移植后的再狹窄)的有效藥劑。發(fā)明人還教導了許多不同的包含B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白或其片段的藥物和醫(yī)學裝置的制備。這些藥物可與其它添加劑、載體或賦形劑配伍，以用于不同的給藥途徑。
治療和預防方法也在本發(fā)明范圍之內。在幾項實施方案中，發(fā)明人教導了幾種通過給予包含B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白或其片段的藥物抑制含P抗原的細胞(包括但不僅限于造血源細胞和內皮細胞)的增生和/或遷移的方法。一個實施方案中，提供了一種宮內干細胞移植前抑制受試者造血細胞的方法。另一項相關的方案中，發(fā)明人教導了出生后干細胞移植前的抑制受試者造血(例如，非成髓性治療的新方法)的方法。本發(fā)明的其它方法包括抑制患有造血增生紊亂(比如真性紅細胞增多)受試者細胞增生的方法。更進一步，實施方案包括阻止血管生成、腫瘤發(fā)生或癌癥的方法，和制備醫(yī)療器械比如斯坦特固定膜或瓣膜，阻止纖維化或心瓣手術后的再狹窄或延遲內皮細胞內生的方法。一種包含B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白或B19衣殼蛋白片段的試劑盒也是本發(fā)明的實施方案。在下面一節(jié)，發(fā)明者描述了提供B19細小病毒衣殼抑制造血細胞生長證據(jù)的實驗。B19細小病毒衣殼抑制造血細胞的生長在第一組試驗中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)重組B19細小病毒衣殼可用于抑制造血細胞生長，表現(xiàn)為新鮮人胎肝細胞、臍帶血細胞和骨髓細胞的集落形成降低。這些試驗描述如下。
為得到胎肝組織，通過合法流產取得孕齡6-12周的胎兒，受試者志愿捐獻胎兒組織。根據(jù)特異的解剖標志來估計孕齡，并給出月經時間。用真空吸引行流產術。在無菌條件下將胎肝切碎，置于含RMPI 1640的無菌試管中，使其通過乙烯篩而使細胞分離形成單細胞懸液。然后清洗有核細胞三次、計數(shù)，用培養(yǎng)液稀釋。
采用商品試劑盒-“干細胞CFU試劑盒”(美國，紐約，生命技術公司，GIBCO BRL)進行集落形成試驗。試劑盒提供了一種模擬基質細胞產生的細胞間質之半固體支持物。試劑盒中包括的其它組分有Iscove改良Dulbecco培養(yǎng)基、改良胎牛血清、甲基纖維素、2-巰基乙醇、調節(jié)培養(yǎng)基和促紅細胞生成素。形成的集落分別鑒定為具有致密包裝的血紅蛋白化的細胞BFU-E(類紅細胞爆發(fā)集落形成單位)、具有非血紅蛋白化細胞排列的CFU-GM(粒細胞、巨噬細胞集落形成單位)和具有血紅蛋白化細胞及小外周血細胞、大外周血細胞的CFU-GEMM(粒細胞、類紅細胞、巨噬細胞、巨核細胞集落形成單位)。
重組B19細小病毒空的衣殼顆粒(Kajigaya等人，美國國家科學院院報，884646(1991))由MedImmune(美國，馬里蘭，Gaithersburg)惠贈，在重組桿狀病毒昆蟲細胞(草地夜蛾)表達系統(tǒng)中制備。(Kajigaya等人，美國國家科學院院報，884646(1991))。衣殼用緩沖液(20mMTris，0.5M NaCl，pH8.5)稀釋，每30μl稀釋物加到含25×103細胞(出生后細胞為50×103)的100μl的培養(yǎng)基中，4℃孵育1小時。然后將混合物轉移到孵育板中，每孔加培養(yǎng)基至終體積0.5ml，在5％CO2的潮濕氣氛中孵育11天，然后在集落形成分析中對BFU-E、CFU-E和CFU-GEMM衍生的集落形成進行計分。
在11天集落形成試驗中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)B19細小病毒衣殼抑制造血細胞生長，表現(xiàn)為新鮮人胎肝細胞、臍帶血細胞和成人骨髓細胞的集落形成降低。即，當人胎肝細胞、臍帶血細胞和成人骨髓細胞與B19細小病毒衣殼一起孵育時，BFU-E(類紅細胞爆發(fā)集落形成單位)、CFU-GM(粒細胞、巨噬細胞集落形成單位)和CFU-GEMM(粒細胞、類紅細胞、巨噬細胞、巨核細胞集落形成單位)的集落形成降低(見表1)。
表1胎肝細胞集落形成單位試驗*
*細胞在11天培養(yǎng)前先與B19衣殼一起孵育。
如表1所示，B19細小病毒衣殼顆粒抑制造血細胞的濃度可小至0.007μg/ml，在70μg/ml時造血細胞生長有明顯抑制。
在集落形成分析中用重組乳頭瘤病毒衣殼(棉尾兔乳頭瘤病毒和6型人乳頭瘤病毒)作為對照。這些衣殼在結構上與B19細小病毒衣殼相似，但不與P抗原作用。重組人乳頭瘤病毒衣殼(HPV6)和棉尾兔乳頭瘤病毒衣殼(CRPV)由瑞典斯德哥爾摩Karolinska研究所的J.Dillner博士惠贈。結果B19細小病毒衣殼抑制造血細胞生長，而乳頭瘤病毒衣殼(測試范圍0.01-100μg/ml)對集落形成沒有影響。
在第二組試驗中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在將B19衣殼混合物加到細胞之前，使B19衣殼與抗B19單克隆抗體或B19細小病毒IgG陽性人血清一起孵育，可恢復造血細胞集落形成的能力。抗B19細小病毒單克隆抗體(MAB8292)，為一種IgG家族抗體，從瑞典馬爾摩Cehmicon AB公司購得。B19 IgG陽性(細小病毒B19 IgM陰性)血清從兩名無癥狀的個體中獲得。在中和試驗中，在將混合物加到胎肝細胞前，將B19細小病毒衣殼先與抗B19單克隆抗體一起孵育。大約25μl抗B19細小病毒單克隆抗體(MAB8292)與25μl B19細小病毒衣殼在4℃孵育2小時，然后將混合物加至細胞中，如上所述，對中和的衣殼/細胞混合物進行11天集落形成試驗。
雖然采用的B19細小病毒衣殼的濃度相對較高(7μg/ml，與表1數(shù)值相比)，低至0.02μg/ml的抗B19單克隆抗體便可降低B19細小病毒衣殼抑制胎肝細胞生長的能力，20.0μg/ml的抗B19單克隆抗體濃度可完全阻斷對BFU-E集落形成的抑制，明顯降低對CFU-GM和CFU-GEMM集落形成的影響(見表2)。
表2利用抗B19細小病毒單克隆抗體的中和試驗*
*注在11天培養(yǎng)前，細胞先與相應試劑孵育。
與此相似，對兩批B19細小病毒IgG陽性血清中和B19細小病毒衣殼的能力進行了分析。大約25μl B19細小病毒IgG陽性血清與25μl B19細小病毒衣殼在4℃孵育2小時，然后將混合物加至胎肝細胞中。隨后，對血清中和的B19衣殼/細胞混合物進行前述的集落形成試驗。如表3所示，沒有血清時，B19細小病毒衣殼(0.14μg/m1)顯著抑制胎肝細胞集落形成，而血清1在稀釋度1∶100時降低B19細小病毒衣殼抑制胎肝細胞生長的能力。
表3用人B19細小病毒IgG陽性血清進行中和試驗*
*注在11天培養(yǎng)前細胞先與相應試劑孵育。
用針對P抗原的單克隆抗體進行中和試驗得到B19細小病毒衣殼抑制造血細胞生長的進一步證據(jù)。抗P抗原單克隆抗體(CLB-ery-2)為一種鼠源IgM抗體，由荷蘭阿姆斯特丹的荷蘭紅十字輸血service中心實驗室的von dem Borne博士惠贈(見von dem Borne等人，英國血液學雜志，6335(1986))。在這些實驗中，大約2.5×104胎肝細胞懸浮于100μl培養(yǎng)基中，然后與25μl抗P單克隆抗體(CLB-ery-2)或25μl作為對照單克隆抗體的抗P1(Seraclone)一起孵育。細胞和單克隆抗體于4℃孵育1小時。在加入B19細小病毒衣殼前，用預冷的培養(yǎng)液將細胞/抗體混合物洗兩次，然后，如前所述，進行集落形成試驗。
與先前用天然病毒顆粒進行的試驗研究(見Brown等人，科學，262114(1993))的數(shù)據(jù)相一致，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抗P抗原的單克隆抗體能夠恢復在B19細小病毒衣殼存在下孵育的新鮮胎肝細胞孵育之生長能力。如表4所示，細胞在CLB-ery-2存在下孵育時，B19細小病毒衣殼的抑制效應至少降低25％。相反，抗P1單克隆抗體(Seraclone)(瑞典斯德哥爾摩，Labdesign)不與P抗原作用，與細小病毒B19衣殼對照相比，對集落形成沒有影響。
表4用抗P或抗P1單克隆抗體進行中和試驗*
*注在11天培養(yǎng)前細胞先與相應試劑孵育。
還用從臍帶血和成人骨髓樣本中分離到的新鮮干細胞檢測了B19細小病毒衣殼對集落形成的抑制效應。按照上述方法，在B19細小病毒衣殼存在下，對從臍帶血和骨髓中分離到的細胞進行集落形成試驗。臍帶血樣本是在正常出生陰道分娩后立即得到的，成人骨髓樣本從健康異體捐獻者獲得。新鮮細胞懸液經肝素處理，用0.9％NaCl稀釋，在Lymphoprep(挪威奧斯陸帕爾瑪Nycomed公司)上2000轉/分梯度離心20分。細胞用巴斯德吸管小心吸取，用0.9％NaCl洗3次，計數(shù)，用培養(yǎng)液稀釋，準備進行集落形成試驗。
B19細小病毒衣殼抑制臍帶血和骨髓來源的造血細胞的能力與其對胎肝細胞所示的能力相當(見表5)。例如，如圖1所示，隨著細小病毒B19衣殼濃度升高，來自臍帶血的細胞的生長降低。進一步用來自臍帶血或骨髓的細胞和B19細小病毒衣殼所作的中和試驗也顯示了與人胎肝細胞試驗相似的結果。即，B19細小病毒衣殼在接觸來自臍帶血和骨髓來源的細胞前，先與抗B19細小病毒單克隆抗體(Mab8292)孵育，證實了抑制細胞生長的能力降低，表現(xiàn)為集落形成提高。
表5用臍帶血和成人骨髓細胞進行集落形成試驗*
*注在11天培養(yǎng)前細胞先與B19細小病毒衣殼(μg/ml)孵育。
另外，按上述方法，在B19細小病毒細胞存在下，用從猴(狒狒和短尾猴)骨髓中得到的造血細胞進行了集落形成試驗。如圖2所示，隨著B19細小病毒衣殼濃度增加，靈長類造血細胞生長降低。這一試驗結果不僅證實靈長類造血細胞含有與B19細小病毒衣殼相互作用的P抗原，還表明狒狒和短尾猴適于本發(fā)明的治療和預防實施方案的體內研究。在下面一節(jié)，發(fā)明人描述了可用于抑制造血細胞生長的組成B19細小病毒衣殼的修飾的B19細小病毒衣殼和肽。組成B19細小病毒衣殼的修飾的B19細小病毒衣殼和肽抑制造血細胞生長本節(jié)中，發(fā)明人描述了怎樣制造含有不同比例的VP1和VP2蛋白或僅含VP2的修飾的B19衣殼，這種修飾的B19衣殼可用于抑制造血細胞生長的長期治療方案。在試圖鑒定B19細小病毒衣殼參與抑制細胞生長的區(qū)域時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)與P抗原結合后，衣殼與含有P抗原的細胞融合而被內化。在一個提供B19細小病毒衣殼內化證據(jù)的實驗中，發(fā)明人將胎肝細胞與B19細小病毒衣殼一起孵育，然后將經衣殼處理過的細胞固定在BioRad載玻片上，用抗B19單克隆抗體(Mab8292)標記，用熒光二抗檢測。據(jù)此，用PBS溶液洗胎肝細胞兩次，制成2×106/ml濃度的混懸液，取一部分懸液與B19天然衣殼(0.35μg衣殼/ml細胞懸液)于37℃孵育1小時。然后將大約20μl微滴細胞/衣殼懸液(大約40000個細胞)加到兩塊BioRad載玻片上，每塊載玻片有10個孔，在每塊載玻片的兩個孔中，未經B19衣殼處理的細胞作為對照。下一步，其中一塊BioRacl載玻片上的細胞用皂角苷滲透處理，其使得允許抗體透過，隨后，加入一級抗B19單克隆IgG抗體，結合后用PBS溶液沖洗除去未結合的一級抗體，再加入二級熒抗IgG抗體，結合后，用PBS沖洗除去未結合的二級抗體。用紫外光學顯微鏡進行分析，結果經皂角苷滲透處理再用B19細小病毒衣殼處理的細胞，在細胞內和細胞膜上均有熒光。相反，未經皂角苷滲透處理的對照細胞，僅在細胞表面顯示熒光。這些結果提供了B19細小病毒衣殼介導的細胞生長的抑制要涉及比編碼P抗原受體更多的蛋白質序列的證據(jù)。
雖然本發(fā)明的實施方案中可包括未經修飾的B19細小病毒衣殼，但天然B19 VLP(即含95％VP2和5％VP1的衣殼)可引發(fā)免疫反應，不適于某些治療應用(例如，用于長期治療方案)。有人構建了含25％VP1和75％VP2的經修飾的B19細小病毒衣殼，以試圖開發(fā)B19細小病毒疫苗，但這種修飾的VLP會引起增強的體內中和反應(美國專利號5508186，Young等人)。這種修飾的B19細小病毒衣殼不適合長期治療方案，因為受試者的免疫反應會很快消除體內的VLP而降低有效的量。另外，由于針對細小病毒的抗體在總體中接近50％，治療方案應優(yōu)選能引發(fā)較小免疫反應的衣殼劑。由于VP1的特有區(qū)域在對B19細小病毒的免疫反應中起整合作用(Fields等人，病毒學，2卷，3版，賓西法尼亞，費城，Lipponcott Raven出版社出版，2207頁(1996))，可生產比天然衣殼含VP1要少的修飾衣殼，其在長期治療方案中效果更好。下面是一些實施方案，其中包括了含VP1占VP1和VP2總量分別小于或等于0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.8％和5.0％的B19細小病毒衣殼。B19細小病毒衣殼(僅含VP1和VP1/2)的由芬蘭赫爾辛基大學Klaus Heddman提供。
更進一步，重組的VP2可自發(fā)形成類似于不含VP1的VP1/VP2結構的衣殼結構(美國專利號5508186，Young等人)。VP2衣殼僅有很小的中和區(qū)域，因此是用于長期治療方案中非常有效的療法。利用前述的集落形成試驗方法，發(fā)明人證實VP2衣殼可抑制造血細胞的生長(圖3)。如前所述，人胎肝細胞在VP2衣殼存在下孵育，然后進行11天集落形成試驗。此實驗陽性對照為天然B19 VLP，即含95％VP2和5％VP1的B19細小病毒衣殼(VP1/2)。
圖3結果表明VP2衣殼濃度低至3μg/ml時抑制造血細胞的生長，30μg/ml時顯著抑制其生長。適合長期治療的實施方案也包含了與抑制細胞生長有關的VP2片段(例如，P抗原結合位點或參與融合/內化或二者的區(qū)域)。下面要詳細討論的蛋白質工程技術、計算機建模、抗原決定簇作圖及此處所述的‘衣殼劑表征試驗’可用于快速鑒別有效抑制細胞生長但不產生強免疫反應的VP1、VP2(或二者)的肽。
‘衣殼劑表征試驗’指的是分析‘衣殼劑’抑制含P抗原的細胞生長的能力的試驗。衣殼劑的實例包括但不限于B19 VLP、或VP1/2、或VP1、或VP2衣殼、或修飾的或未修飾的VP1或VP2(或二者)的肽片段、或者具有VP1或VP2(或二者)序列的合成分子、或者類似VP1或VP2的肽模擬物或這些分子之一或二者的區(qū)域。衣殼劑表征試驗的實例包括但不僅限于集落形成試驗、中和試驗、蛋白質結合或融合試驗、內化試驗、轉錄或翻譯試驗、評價接觸衣殼劑后細胞內蛋白質磷酸化或鈣動員的試驗(美國專利號5508186，Young等人，此處引用一些描述衣殼劑表征試驗的文獻作為參考)。下一節(jié)，發(fā)明人公開了B19細小病毒衣殼可抑制另一類型含P抗原的細胞(即內皮細胞)的發(fā)現(xiàn)。B19細小病毒衣殼抑制其它表達P抗原的細胞(包括但不僅限于內皮細胞)的生長第一組試驗結果證實，B19細小病毒衣殼和VP2衣殼有效抑制大量不同的含P抗原的造血細胞(包括不同種屬的造血細胞)的生長。發(fā)明人在第二組試驗中發(fā)現(xiàn)，重組的B19細小病毒衣殼抑制另一種類型的含P抗原細胞的生長。確切地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)B19細小病毒衣殼可抑制內皮細胞的生長，表現(xiàn)為內皮細胞的增生和遷移的降低。下面為這些實驗描述。
為確定B19細小病毒衣殼是否可抑制內皮細胞增生，進行如下試驗，將原代人臍靜脈內皮細胞種板于24孔板，每孔含1.5×104個細胞，在0.5％胎牛血清和10.0ng/ml堿性成纖維細胞生長因子存在下，與B19細小病毒衣殼孵育。第二天在各孔加入不同的B19衣殼制劑(即VP1/2或僅含VP1或VP2的衣殼)，然后細胞與衣殼再孵育72小時。用結晶紫染色試驗測定細胞的增殖。據(jù)此，衣殼處理的細胞用PBS洗后，經3.7％的甲醛固定，與結晶紫孵育。用蒸餾水充分沖洗除去染料。與細胞結合的結晶紫可溶于10％的醋酸溶液，用ELISA板測定儀于540nm處測定其吸收。
內皮細胞增殖試驗的結果見圖4-7。這些圖中x軸分別為代表增加濃度的對照抗原KYVTGIN(SEQ ID No.1)濃度(圖4)、B19細小病毒衣殼濃度(僅含VP1)(圖5)、B19細小病毒衣殼濃度(VP1/2)(圖6)、B19細小病毒衣殼濃度(僅含VP2)(圖7)。因此，從左至右，棒圖分別代表540nm處0μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml、10.0μg/ml濃度時的吸收度。Y軸代表540nm處吸收值的標準。標準偏差不超過10％。如圖7所示，VP2衣殼在濃度低至1.0μg/ml有效抑制內皮細胞的增生，在10.0μg/ml時觀察到顯著抑制。
還測定了B19細小病毒衣殼制劑對細胞遷移的作用。遷移試驗是通過改良的Boyden小室試驗(Neuroprobe，Inc)進行的。加入堿性成纖維細胞生長因子(40ng/ml)來刺激人臍靜脈內皮細胞遷移穿過1型膠原包被的8μm孔徑的微孔濾膜。在進行遷移試驗前，細胞與不同的B19衣殼劑(即VP1/2或僅含VP1或VP2的衣殼)。為進行遷移試驗，Boyden小室于37℃，10％CO2下孵育4.5小時，隨后取出濾膜，在3.7％甲醛中固定。濾膜在吉爾氏蘇木精中過夜染色以觀察細胞的遷移。通過染色細胞計數(shù)來計量每一高倍放大視野下濾膜遷移邊的遷移細胞數(shù)(見圖8)。如圖8所示，VP2衣殼蛋白在濃度低至1μg/ml時有效抑制內皮細胞遷移。更進一步，VP2衣殼蛋白介導的內皮細胞遷移之抑制效應顯著強于天然衣殼(VP1/2)或僅含VP1的衣殼所觀察的情況。
上述試驗的結果表明可以生產B19細小病毒衣殼、修飾的細小病毒B19衣殼和VP2衣殼并用于有效抑制含有P抗原的細胞(比如造血源細胞和內皮細胞)的生長和/或遷移。上述試驗也揭示與P抗原結合的和/或參與顆粒融合或內化的B19衣殼蛋白序列可參與抑制細胞生長或細胞遷移。這些實施方案適用于本發(fā)明的許多治療應用，可構造含有VP1或VP2蛋白質(或二者)的片段或合成分子的藥物用于更有效地結合、融合及內化含有P抗原的細胞。在下一節(jié)，發(fā)明人描述了抑制細胞生長和遷移的更多衣殼劑的生產和特性。抑制含有P抗原的細胞生長和遷移的B19衣殼劑在本節(jié)中，發(fā)明人描述了幾種可用于生產、設計和表征衣殼劑的技術，這些衣殼劑包括但并不限于B19細小病毒衣殼、修飾的B19細小病毒衣殼、VP2衣殼和含有與VP1或VP2(或二者)對應序列的肽或肽模擬物。VP1和VP2的結構基因已完全測序，可從NCBL數(shù)據(jù)庫獲得，資源索取號為U38506.1，或索取號AAB47788，或medline號97081188，或見Erdman等人，普通病毒學雜志，772767(1996)，此處引用所有文獻和其中的序列作為參考。本發(fā)明實施方案所用的VP1或VP2或二者(或二者之一)的片段相應于參與抑制細胞生長和遷移的序列。本發(fā)明期望的肽可包含VP1和VP2結構蛋白質的3-780個氨基酸，但必須至少包括參與抑制含P抗原的細胞的生長和/或遷移的分子的一些部分。換言之，本發(fā)明優(yōu)選的實施方案可包括VP1和VP2結構基因的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90或100個氨基酸。期望的實施方案可至少包括VP1和VP2結構蛋白質的110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、31 0、320、330、340、350、360、370、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770或780個氨基酸。
其中參與抑制含有P抗原細胞的生長和遷移的肽和其肽片段或衍生物，包括但不限于見于天然的VP1和VP2結構基因中的那些區(qū)域。另外，在這些衣殼劑中還包括改變的序列，其中用功能相當?shù)陌被釟埢鎿Q序列中的殘基而產生沉默改變。據(jù)此，VP1和VP2結構基因序列中一個或更多個氨基酸殘基可被另外的極性相似作為功能等同物的氨基酸所替換，產生沉默改變。替換序列中的某一氨基酸可從該氨基酸所屬家族的其它氨基酸中選取。例如，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。不帶電荷的極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性)的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。上述肽優(yōu)選地在確定該片段是否保持抑制含P抗原的細胞生長和/或遷移能力的試驗中進行分析。本發(fā)明所用肽也可被修飾，例如肽可以含有肽上不常見的取代或肽上常見的取代，但取代是發(fā)生在肽非正常的區(qū)域。例如，這些肽例如可以被乙?；Ⅴ；虬坊?。修飾肽的取代基包括但不限于H、烷基、芳基、鏈烯基、炔基、芳香族、醚、酯、未取代或取代的胺、酰胺、鹵素、未取代或取代的磺?；?元或6元脂族或芳香環(huán)。另外，VP1、VP2、或二者之一(或二者)的片段可被衍生化，可使衍生化的肽包含影響分子功能和穩(wěn)定性的氨基酸序列。例如，參與抑制含有P抗原細胞的生長和遷移的肽可工程化為含一個或多個半胱氨酸殘基，以促進通過二硫鍵形成更穩(wěn)定的衍生物(例如，美國專利號4908773)。用計算機圖形程序和此處所述的試驗來鑒定半胱氨酸連接位點，這些位點可提供更好的穩(wěn)定性而不影響對含有P抗原細胞的生長或遷移的抑制。(例如，Perry LJ和WetzelR，科學，226555-557(1984)；Pabo，C.O.，生物化學(Biochemistry)，255987-5991(1986)；Bott，R.等人，歐洲專利申請SEQID No.130756，Perry LJ和Wetzel R，生物化學，25733-739(1986)；，Perry LJ和Wetzel R，生物化學，25733-739(1986Wetzel RB，歐洲專利申請SEO ID No.155832作為本發(fā)明實施方案的另外的衍生物包括與VP1、VP2或二者區(qū)域相類似的肽模擬物。合成的肽可采用相應于利用傳統(tǒng)的合成方法制備這些分子的方法制備，用L-氨基酸、D-氨基酸或兩種不同構型氨基酸的不同比例的混合物制備。合成的化合物模仿某一特定肽的構型和需要的特點但避開了不需要的特點，例如，彈性(構型缺失)和鍵的斷裂，稱為“肽模擬物”(例如，見Spatola AF，氨基酸、肽和蛋白質化學和生物化學(Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides，andProteins)(Welstein B主編)，7卷，267-357頁，紐約，MarcelDekker(1983)，該章描述了腦啡肽類似物中用甲烯硫[CH2S]生物同配物作為酰胺取代；及Szelke等人，第八屆美國肽研討會，肽結構、功能和進展(Hruby和Rich主編)579-582，伊利諾斯，洛克福得，Pierce化學公司出版，該文描述了從血管緊張肽原衍生的6-13的八肽中的亮氨酸-纈氨酸肽鍵含有甲烯氨[CH2NH]和羥乙烯[CHOHCH2]生物同配物的腎素抑制劑)。已知在設計和生產肽模擬物方面有多種方法和技術，可任意選用。(例如，F(xiàn)armer PS，藥物設計(Drug Design)(Ariens EJ主編)第十卷，119-143頁(紐約，倫敦，多倫多，悉尼和圣弗朗西斯科，學術出版社)(1980)；Farmer等人，TIPS，9/82，362-365頁；Verber等人，TINS，9/85，393-396頁；Kaltenbronn等人，醫(yī)學化學雜志(JMedChem)，33838-845(1990)；Spatola AF，氨基酸、肽及蛋白質化學和生物化學，第七卷，267-357頁，第五章，“肽骨架修飾含有酰胺鍵替代物的肽的結構-活性分析。構型的限制與關聯(lián)(Peptide BackboneModificationsA Structure-Activity Analysis of Peptide ContainingAmide Bond Surrogates.Conformational Constrains，and Relations)”(BWeisten主編，紐約Marcell Dekker出版)(1983)；Kemp DS，肽中β片層和α螺旋晶核的肽模擬和模板方法(Peptidomimetics and theTemplate Approach to Nucleation of beta-sheets and alpha-helice inPeptidea)Tibech，第八卷，249-255頁(1990)。另外的技術可在美國專利號5288707；5552534；5811515；5817626；5817879；5821231和5874529中發(fā)現(xiàn)，此處引用作為參考。因此，只要分子的某些區(qū)域能抑制含有P抗原細胞的生長或遷移，本發(fā)明的肽模擬物可具有這樣的結構，至少與VP1和VP2結構蛋白質的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770或780個氨基酸相似。
分子生物學的傳統(tǒng)技術，如美國專利號5508186所述，此處引用作為參考，可用于制備多種類型的衣殼劑?！耙職币辉~可以指包含不同比例的VP1、VP2、VP1/2、或者VP1或VP2或二者之一或二者的片段、含對應于VP1或VP2或二者序列的融合蛋白質、與參與抑制含有P抗原細胞的生長和/或遷移的VP1和VP2結構基因相對應的修飾的或未修飾的蛋白質或肽或肽模擬物。
按美國專利5508186所述，衣殼劑可用下面的方法生產。構建含全長VP1、VP2或二者的質粒。為構建質粒pVP1/941，從pYT103c切下幾乎是全長B19細小病毒分子克隆的編碼VP1基因的cDNA(Cotmore等人，科學，2261161(1984)；Ozawa等人，病毒學雜志，622884(1988))，用限制性內切酶Hind III(圖第45位切割)和EcoRI(圖第95位切割)消化后，用綠豆核酸酶補平單鏈末端。將得到的DNA片段插入桿狀病毒轉化載體pVL941的BamHI位點(用DNA聚合酶Klenow片段處理成平端)，此載體是將缺失多角體蛋白基因的苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV)基因克隆進pUC8質粒中所得(Summers等人，Tex.Agric.Exp.Stn.1555(1987))。pVP2/941的構建是在pVL941的BamHI位點插入pYT103c的PstI-EcoR消化片段(圖58-95位，EcoRI位點為平端)和與Sstl-Pstl區(qū)域(Sstl位點為平端)對應的合成的20個核苷酸DNA片段。另外，用聚合酶鏈反應(PCR)克隆VP1或VP2基因或Erdman等人所描述的全長克隆的一部分(普通病毒學雜志，772767(1996))，此處引用作為參考。為便于克隆，如本領域所知，引物可設計為產生方便的限制酶切位點。
為產生重組桿狀病毒，將編碼VP1、VP2、VP1/2或其片段的重組質粒轉染昆蟲細胞。據(jù)此，用磷酸鈣介導沉淀法將8μg重組質粒和2μg野生型AcMNPV共轉染進Sf9細胞。Sf9細胞株(American Type CultureCollection，Rockville Md.)從草地夜蛾的卵巢(秋季幼蟲)獲得，在含10％熱滅活的胎牛血清、2.5μg/ml二性霉素、50μg/ml慶大霉素、3.33mg/ml乳清蛋白水解產物、3.33mg/ml酵母水解物(全部由Gibco BRL LifeTechnologies，Gaithersburg Md.提供)的Grace昆蟲組織培養(yǎng)基中，于100％的室內空氣、95％濕度、27℃條件下培養(yǎng)。轉染后六天收獲子代病毒，并在新鮮的Sf9細胞上重新產生噬斑。重組病毒通過其細胞核沒有肉眼可見的包含體來鑒別(包含體陽性表型是大量多角體蛋白合成的結果)。在大量VLP儲液制備和分離或純化前重組病毒可經過3輪噬斑純化，特別構思了含0.1％、0.5％、1％、2％、5％、10％、25％或更多活性成分(重量/重量)的純化組合物。
“分離的”指的是與其最初的環(huán)境相分開的物質(例如，如果物質是天然存在的，則是指天然環(huán)境)。例如，活細胞中天然存在的蛋白質不是分離的，但同一蛋白質從天然體系中從與其共存的部分或全部物質中分開，則是分離的?！凹兓辈恍枰^對的純，而是一相對概念。例如，用考馬斯染色法檢測。將蛋白質常規(guī)純化成電泳純后，盡管會有雜質存在，但它已能適于幾種試驗。優(yōu)選地用分離或純化的衣殼劑進行衣殼劑表征試驗，包括但不僅限于美國專利號5508186描述的試驗方法(例如，DNA、RNA和蛋白質分析、免疫印跡、免疫熒光法、沉淀分析、電子顯微鏡、免疫電子顯微鏡及前述的衣殼劑表征分析)。
一些特別涉及長期給予衣殼劑的應用的實施方案中，需要生產一種不會引發(fā)受試者顯著免疫反應的藥物。生產不會引發(fā)免疫反應的衣殼劑的總體框架包括藥劑設計、藥劑構建、藥劑抑制細胞生長和/或細胞遷移的能力分析、對藥劑免疫反應的分析。許多B19細小病毒衣殼的免疫原區(qū)已經知曉，用常規(guī)的分子生物學技術這些免疫原區(qū)可被刪除、誘變、或修飾，最新設計的合成衣殼蛋白可用一種或多種衣殼劑表征試驗進行分析(例如，集落形成試驗和用無癥狀個體的血清進行的中和試驗)?？捎迷S多方法來識別B19細小病毒衣殼的免疫原區(qū)，并生產抑制細胞生長和/或細胞遷移的非免疫原性VLPs。下面的實施例提供了一種可行的方法。
可按下述方法進行設計、生產和分析測試表達構建體。此步驟可以重復以產生幾種VLP和根據(jù)其抑制細胞生長、細胞遷移和引發(fā)受試者中免疫反應的能力而不同的含有衣殼劑的藥物。據(jù)此，通過一種方法，根據(jù)公開的VP2序列設計引物，用PCR方法從臨床分離物中可以克隆到VP2結構基因。隨后VP2基因被亞克隆到Bluescript(Pharmacial)用于誘變、亞克隆到pVL1393(Stratagene)用于在Sf9細胞中的表達。用Amersham Sculptor體外誘變試劑盒在VP2基因引入對應VP2免疫原區(qū)的突變(例如，氨基酸253-272、309-330、328-344、359-382、449-468和491-515)。本領域普通技術人員應當理解VP1和VP2結構蛋白的羧基端截短、氨基端截短、內部截短和定點誘變可以用幾種方法來完成。優(yōu)選生成如上所述的含有一個或多個缺失的幾種不同的克隆。希望的突變通過測序得到確證，然后突變基因被亞克隆到pVL1393用于在Sf9細胞中表達。用Baculogold轉染試劑盒(Pharmingen)轉染Sf9細胞。根據(jù)使用說明作下列修改進行轉染。在100mM盤用4μg BaculogoldDNA和6μg測試DNA轉染大約8×108Sf9細胞，6天后收獲細胞，分析VLP的產生。
接著，將細胞刮下然后低速離心。細胞重懸于300ml裂解緩沖液中(1M NaCl，0.2M Tris，pH 7.6)，冰浴下在Falcon 1259管中用帶PT-OA1205/2-A(Brinkman)探頭的Polytron PT 1200 B勻漿30秒。樣品2500轉/分離心3分鐘以沉淀碎片，試管用另外的150ml裂解緩沖液洗滌。收集上清夜至1.5ml微離心管中，再于Eppendorf微離心管中(Brinkman)離心5分鐘。收集的上清液于4℃保存。
然后按下面的方法對分離得到的VLPs進行酶聯(lián)免疫分析測定(ELISA)。大約5ml提取液稀釋到50ml含1％BSA的PBS(磷酸緩沖鹽液，20mM NaPO4，pH 7.0，150mM NaCl)溶液，鋪于聚苯乙烯板上。4℃孵育過夜。除去提取物，用含5％奶粉的PBS溶液封閉聚苯乙烯板。下面所有的洗滌步驟均使用1％BSA的PBS溶液。室溫下聚苯乙烯板與一級抗體(例如，無癥狀受試者的血清)孵育1小時。洗去未結合的抗體后，聚苯乙烯板再與二級抗體孵育1小時。二級抗體、過氧化物酶標記的山羊抗小鼠lgG(g)可從Kirkegaard & Perry Laboratories，Inc購得，使用時可用1％BSA的PBS溶液稀釋至103倍。最后一次洗滌后，進行堿性磷酸化酶試驗，于405nm處測定吸收度。最成功的衣殼劑按此試驗方法應檢測不到。即希望的突變VP2衣殼應是失去了能被血清中存在的抗體識別的抗原決定簇，故用ELISA檢測不到。通過用不同批次的來源于不同個體的血清、對集落形成或細胞遷移的抑制起中和作用的單克隆抗體進行這些試驗，本領域技術人員可快速鑒定VP2免疫原區(qū)和最好避開免疫反應的突變VP2衣殼。
接著對成功避開上述ELISA檢測的突變VP2衣殼用衣殼劑表征試驗分析其抑制細胞生長和細胞遷移的能力。通過評價每種突變VP2衣殼抑制細胞生長和細胞遷移的能力，并與ELISA試驗得到的免疫原性結果相協(xié)調，可得到“衣殼劑情況簡介”。“衣殼劑情況簡介”可包括代表突變衣殼蛋白或突變VLP的符號或圖標、序列信息(例如，突變或修飾的位置)、衣殼劑家族說明(例如，與其它衣殼劑關系的信息)、應用信息(例如，適用癥或治療信息、臨床或生物技術中的用途)、衣殼劑表征試驗得到的功能信息(例如，集落形成試驗、中和試驗、融合/內化試驗、結合試驗、磷酸化試驗、細胞遷移試驗、增生試驗、包括ELISA的免疫原性試驗結果)。
衣殼劑情況簡介可用計算機可讀媒介記錄，存貯于硬盤、軟盤或內存上的數(shù)據(jù)庫中，用搜索引擎讀取，可相互比較或與疾病狀態(tài)或“疾病狀態(tài)簡介”(即與疾病、病情或適用療法有關的信息)相聯(lián)系。調查人可以用這些衣殼劑情況簡介和疾病狀態(tài)簡介合理設計藥物或進行生化分析，內科醫(yī)生或臨床大夫則用來根據(jù)治療持續(xù)時間選擇合適的藥物組合物，以平衡抑制細胞生長和遷移和受試者的免疫反應之間的水平。
在一些實施方案中，衣殼劑被置于支持物上以產生多聚體衣殼劑。單體制劑(即，代表單個分散分子的制劑，僅攜帶一個結合結構域)足以達到想要的效應，而多聚體衣殼劑(即，代表多個分子的制劑，含有幾個結構域)通常產生更大的的效應。應當指出，“多聚體”是指一個支持物上有不止一個分子，例如，幾個單獨的VP2分子連接在一個支持物上，應和“多聚化”相區(qū)別，“多聚化”指的是多個分子連接為一個單獨的化合物加到支持物上，例如，幾個VP2分子連接起來形成連接到支持物上的單一化合物分子。此處所述的衣殼劑的多聚體形式由于使該制劑與含P抗原的細胞有更高的親和力而在許多生物技術和臨床的應用上更有利。
多聚體衣殼劑可通過將蛋白質(例如VP2或其片段)耦聯(lián)到大分子支持物上獲得。支持物也可叫做運載體、樹脂或任何用于連接或固定蛋白質的大分子結構。大分子支持物可具有疏水表面，其與衣殼劑的區(qū)域發(fā)生疏水的非共價作用。支持物的疏水表面，例如，可以是如塑料的聚合物或任何含有與聚苯乙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯相連接的疏水基團的其它聚合物。衣殼劑可以選擇性地與包括蛋白質和寡/多糖(例如，纖維素、淀粉、糖原質、脫乙酰殼多糖或氨化的Sepharose)的載體進行共價結合。后面的實施方案中，衣殼劑中的反應基團(如羥基或肽上的氨基)可以用于和載體上的反應基團連接形成共價鍵。實施方案還包括帶有可與衣殼劑相互作用的荷電表面的一種支持物。另外的實施方案涉及帶其它反應基團的支持物，這些基團經化學活化可以與衣殼劑連接。例如，溴化氰活化的基質、環(huán)氧活化的基質、硫代和硫丙基凝膠、硝苯基氯甲酸酯和N-羥基琥珀酰氯甲酸酯的鏈或環(huán)氧乙烷丙烯酸支持物(SIGMA)。
進一步地，支持物還可包括硅氧化物類的無機載體(如硅膠、沸石、硅藻土或氨化玻璃)，衣殼劑通過肽上的羥基、羧基或氨基和載體上的反應基團進行共價連接。所以，在相應的上下文中，“支持物”可以是反應盤、試管、導管、斯坦特固定膜、氣囊、假體、醫(yī)學裝置、聚苯乙烯珠、磁珠、硝基纖維素帶、膜、微小粒子(如膠乳粒子)、綿羊(或其它動物)紅細胞、Duracyte人造細胞等的壁或孔。象硅氧化物類的無機載體(如硅膠、沸石、硅藻土、氨化玻璃)與衣殼劑通過羥基、羧基、氨基和載體上的反應基團形成共價鍵也在實施方案之中。用于體內的載體(如用于預防、治療用途)優(yōu)選的是生理學的無毒非免疫原性的。這類載體包括但不限于聚L-賴氨酸、聚D-、L-丙氨酸和Chromosorb(Johns-Manville，Products，Denver Co)其它實施方案中，合適長度的連接子，如λ連接子、生物素-親和素(或鏈親和素)插入衣殼劑與支持物之間來增加彈性，以克服支持物上的空間位阻。用所述的衣殼劑表征試驗篩選含有不同長度連接子的衣殼劑以確定能保證最佳作用的連接子的合適長度。
其它實施方案中，上面討論的多聚體支持物與多聚化的衣殼劑結合產生“多聚化-多聚體支持物”。多聚化衣殼劑的實施方案是這樣獲得的創(chuàng)建含有兩個或多個編碼VP2或其片段的核苷酸序列(例如將其連接到一起)的表達構建體。表達的融合蛋白質是多聚化衣殼劑的一個實施方案，然后將其連接到支持物上。含有多個這種多聚化制劑的支持物稱之為多聚化-多聚體支持物。一些實施方案中，構成多聚化制劑的結構域之間的連接子和間隔基可與支持物結合，優(yōu)選地間隔連接子可通過衣殼劑表征試驗確定。
一些實施方案中，衣殼劑置于將植入受試者體內的假體裝置上。對于各種類型的假體如斯坦特固定膜和瓣膜，為穩(wěn)定植入物一定限度的組織內生是需要的。然而，移植過程中對周圍組織傷害的結果是大大加劇了細胞增生，這可引起纖維化增生或再狹窄，一段時間后會壓縮斯坦特固定膜或改變瓣膜的位置?，F(xiàn)有技術的裝置嘗試通過使用放射活性解決此問題，但是治療成功和將身體暴露于從裝置中釋放的放射性物質中的可能性使得這一方法不受歡迎。類似地，象氣囊血管再生術的技術常常由于內皮細胞浸潤會發(fā)生再狹窄。
將衣殼劑連接到醫(yī)療假體如斯坦特固定膜、瓣膜上或用多孔導管(如血管再生術中用到的氣囊導管)輸送衣殼劑，內皮細胞的遷移、增生、纖維化增生、組織內生和再狹窄可以得到有效抑制。更進一步，使用在與治療過程相關的炎癥消除后的一定時間內由免疫系統(tǒng)清除的衣殼劑，可以使組織內生延遲。用上述方法，衣殼劑可通過疏水相互作用或共價連接結合到不同的假體如斯坦特固定膜或瓣膜上。而且，現(xiàn)有技術中用的導管可經改造用來將衣殼劑輸送到血管再生部位。通過對衣殼劑情況簡介的分析，醫(yī)生可以根據(jù)要求的細胞抑制時間或組織內生延遲時間，選擇合適的衣殼劑包被的假體進行移植或合適的衣殼劑。也構思了用其它方式局部輸送衣殼劑。例如，在斯坦特固定膜、移植物、瓣膜、或其它假體附近植入緩釋組合物或者用輸注泵或其它合適裝置將藥物輸送到一定部位，可抑制血管內皮細胞的生長。除了可以包被醫(yī)學裝置、作為導管輸送的制劑，此處所述的衣殼劑可配制入藥物，用于與含P抗原的細胞增生或遷移有關的人類疾病和病情的治療和預防。下節(jié)討論衣殼劑制成藥物制劑并確定合適劑量的諸多方法。預防和治療制劑的生產和劑量本發(fā)明的衣殼劑(例如，VP1、VP1/2、VP2或其片段)適用于作為疾病和病情的預防措施對受試者的治療，或對已感染疾病的受試者的治療。這些藥理活性化合物按蓋倫藥學的傳統(tǒng)方法制成給予受試者的藥劑，例如包括人在內的哺乳動物。修飾及未經修飾的活性成分可以加入到藥物制劑中。更進一步，經幾種途徑輸送本發(fā)明中的藥理活性化合物的治療劑或藥物的生產方法也是本發(fā)明的內容，例如，在實施方案中不局限于應用含有編碼衣殼的DNA、RNA和病毒載體。編碼衣殼的核酸可以單獨給予或與其它活性成分一起使用。
本發(fā)明的化合物可與傳統(tǒng)的賦形劑混合使用，即藥學上可接受的適于非腸道的、腸道的(如，口服)或局部應用的，且與本發(fā)明藥理活性的化合物沒有損害作用的無機或有機載體物質。合適的藥學上適用的載體包括，但不僅限于水、鹽溶液、醇類、阿拉伯膠、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明膠、碳水化合物(如乳糖)、直鏈淀粉或淀粉、硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟、香油、脂肪酸單甘油酯、脂肪酸二甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯酮等。許多更合適的賦形劑參見下列文獻中報道，雷明頓藥學(Remmington’s PharmceuticalScinces)，15版，EastonMack出版社，1405-1412，1461-148(1975)；美國國家藥品集，美國藥學會(1975)。藥物制劑可經消毒，如果需要可與象潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩沖液、著色劑、香味劑和/或芳香物質等等與活性化合物不產生損害反應的輔助試劑混和。
某一特定藥物制劑的有效量和服用方法可根據(jù)具體受試者、疾病類型、疾病程度及本領域熟知的其它因素而改變。這些化合物的療效和毒性可根據(jù)細胞培養(yǎng)和動物試驗例如，ED50(50％有效治療劑量)中的標準藥理過程確定。前述的短尾猴或狒狒是合適的實驗模型。細胞培養(yǎng)試驗和試驗動物研究結果用于確定人用劑量范圍。這些化合物的劑量范圍優(yōu)選在包括ED50的沒有毒性的循環(huán)濃度范圍之內。在此范圍之內劑量隨衣殼劑的類型、使用的劑量型式、受試者的敏感性和施用方式而改變。
依據(jù)給藥途徑，正常的劑量范圍可以從大約1μg到100000μg，直到總劑量大約10g。合適的劑量包括250μg、500μg、1mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、1g、1.1g、1.2g、1.3g、1.4g、1.5g、1.6g、1.7g、1.8g、1.9g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g和10g。另外，在表皮給藥的實施方案中，衣殼劑的濃度可以很高。有些實施方案中可以采用衣殼劑的摩爾濃度。希望的表皮給藥和/或包被醫(yī)療裝置的濃度從100μM到800mM。這些實施方案的優(yōu)選濃度從500μM到500mM，例如，優(yōu)選的表皮給藥和/或包被醫(yī)療裝置的濃度包括500μM、550μM、600μM、650μM、700μM、750μM、800μM、850μM、900μM、950μM、1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、300mM、325mM、350mM、375mM、400mM、425mM、450mM、475mM和500mM。
在一些實施方案中，衣殼劑的劑量優(yōu)選產生的組織或血液濃度(或二者)大約是0.1μM到500mM。希望的劑量產生的組織或血液濃度(或二者)大約是1μM到800μM。優(yōu)選劑量產生的組織或血液濃度(或二者)大于約10μM到大約500μM，例如，優(yōu)選需要的量的衣殼劑達到組織或血液濃度(或二者)為10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、150μM、160μM、170μM、180μM、190μM、200μM、220μM、240μM、250μM、260μM、280μM、300μM、320μM、340μM、360μM、380μM、400μM、420μM、440μM、460μM、480μM和500μM。雖然產生組織濃度大于800μM的劑量不是優(yōu)選，但在本發(fā)明的有些實施方案中可以應用。為了維持同血液水平一樣的穩(wěn)定的組織濃度，也可以持續(xù)滴注衣殼劑。
精確的劑量要由具體醫(yī)生視受試者而定。為了提供足夠水平的活性組分和維持希望的效果，劑量和給藥方案要進行調整。還要考慮其它的因素，包括受試者的病情、年齡和體重；飲食、給藥的時間和次數(shù)、藥物聯(lián)用、反應的靈敏性、對治療的耐受/反應。短效活性藥物組合物每天給藥一次，而長效活性藥物組合物每2、3、4天，每周或每2周給藥一次。根據(jù)具體制劑的半衰期和清除率，本發(fā)明的藥物組合物每天給予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。
本發(fā)明的給藥途徑包括，但不限于，透皮、非腸道、胃腸道、經支氣管和牙槽。透皮給藥通過允許藥物活性化合物穿透皮膚的霜劑、洗劑、凝膠劑等完成。非腸道給藥途徑包括但不僅限于，電或直接注射，比如直接注入中央靜脈，靜脈、肌肉、腹腔、皮內或皮下注射。胃腸道給藥途徑包括，但不限于，口服和直腸給藥。經支氣管和牙槽給藥包括，但不限于，經口腔或鼻腔吸入。
適合透皮給藥的本發(fā)明中含有藥理活性化合物的組合物包括，但不限于，藥學能夠接受的可直接用于皮膚或整合進(透皮片)透皮設備的保護性載體的混懸劑、油劑、霜劑和膏劑。合適的霜劑、膏劑等的實例可以在內科醫(yī)生手冊中看到。所述的合適的透皮設備的實例在1989年4月4日授權的Chinen等人的美國專利號4818540中有述，此處引用作為參考。
適合非腸道給藥的本發(fā)明中含有藥理活性化合物的組合物包括，但不限于藥學可接受的滅菌等滲溶液。這些溶液包括，但不限于用于中樞靜脈、靜脈、肌肉、腹腔、皮內或皮下注射的鹽和磷酸鹽緩沖的鹽溶液。
適合支氣管和牙槽給藥的本發(fā)明中含有藥理活性化合物的組合物包括，但不限于用于吸入的各種氣霧劑。適于支氣管和牙槽給藥的裝置也是本發(fā)明的實施方案，這些設備包括，但不限于噴霧器和汽化器。目前應用的許多形式的噴霧器和汽化器都很容易用于輸送本發(fā)明的含有藥理活性化合物的組合物。
適合胃腸道給藥的本發(fā)明中含有藥理活性化合物的組合物包括，但不限于藥學可接受的用于口服的粉末、藥丸和液體及用于直腸給藥的栓劑。因為應用便利，胃腸道給藥，特別是口服，是優(yōu)選的實施方案。一旦得到含有衣殼劑的藥物，就可施用于需要治療或預防與含P抗原細胞的增生或遷移有關的疾病的受試者。
本發(fā)明的內容也包括治療器具比如假體、植入物和儀器的包衣。適于治療器具的包衣可由含衣殼劑的凝膠或粉末提供，或由衣殼混懸其中的聚合體包衣提供。適于包衣的聚合材料應在生理學上可以接受，而且能達到治療效果劑量的衣殼能在其中擴散。合適的聚合物包括，但不限于聚亞胺酯、聚甲基丙烯酸酯、聚酰胺、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙稀、醋酸纖維素、硅樹脂彈料、膠原及絲等。這些包衣，例如，在1986年9月16日授權的Fox等人的美國專利號4612337中有述，此處引用作為參考。在下面一節(jié)，發(fā)明人公開了幾種治療與含P抗原的細胞增生或遷移有關的疾病的方法，其中涉及提供一種含衣殼劑的藥物。治療和預防措施在本發(fā)明的幾個方面中，為需要治療或預防與異常細胞增生和/或細胞遷移有關的疾病或病情的受試者提供了衣殼劑，尤其是含衣殼劑的藥物。配制抑制含P抗原的細胞(這些細胞包括，但不限于造血細胞和內皮細胞)的生長和/或細胞遷移的藥物的方法是本發(fā)明的實施方案。即本發(fā)明的實施方案包括含衣殼劑的藥物用于抑制含P抗原的細胞(比如造血細胞和內皮細胞)的生長和/或遷移的用途。
在一個實施方案中，在宮內干細胞移植前，衣殼劑可用于抑制治療受體受試者的造血細胞。在先前對人胎兒中干細胞的組織分布的研究中，據(jù)估計，在第二個三月期對胎兒移植5×107個細胞，產生的供體-受體比大約為11000-110000。這樣低的比率不能為移植細胞提供可同受體自身的干細胞競爭的界限。(Westren等人，美國婦產學雜志(Am JObstet Gynecol)，17649(1996))。為提高這一比率和干細胞移植的成功率，可在移植前給予衣殼劑，以抑制自身干細胞群體從而促進移植。另外，移植前對供體干細胞用抗P抗原的單克隆抗體處理，可保護它們免受衣殼劑的抑制，從而產生更好的效果。所以，一個實施方案包括干細胞移植前為患者提供含衣殼劑的藥物。這一治療方法可如此進行鑒定需要進行宮內干細胞移植的受試者，然后向該受試者提供具有治療有效量的抑制造血細胞生長的衣殼劑。
本發(fā)明的另一相似的方面是一種在出生后干細胞移植前非重度骨髓抑制調節(jié)方法。最近，非重度骨髓抑制調節(jié)的方法已受到極大關注，因為這些方案與應用大劑量化療的標準方案相比對患者的毒性要小。(Giral等人，血液(Blood)，894531(1997)；Slavin等人，血液，91756(1998))。但是，在非重度骨髓抑制治療中用已有技術達到完全的供體造血嵌合性還不很成功。在出生后干細胞移植前給予衣殼劑，供體細胞對受體細胞的比率可以被有利地改變，不經放射即可達到供體造血細胞嵌合性。因此，非重度骨髓抑制調節(jié)的方法可通過鑒定需要在進行出生后干細胞移植前非重度骨髓抑制調節(jié)的受試者，然后給予該受試者具有治療有效量的衣殼劑。
該發(fā)明的另一方面是一種治療患血液增生疾病(例如，真性紅細胞增多)的受試者的方法。真性紅細胞增多(PVC)是由骨髓中紅細胞的無控制增生引起的一種血液疾病。也涉及其它譜系的細胞(白細胞和血小板)，但不引起相似嚴重性的癥狀。該病見于中年或老年人(診斷的中值年齡為60歲)，在瑞典的發(fā)病率是每100000人1.5例。目前，還沒有特異的藥物治療，現(xiàn)在的措施是緩解這一緩慢發(fā)展的疾病的癥狀。未經治療的中值存活時間很短。年輕的個體，經優(yōu)化治療，可存活長達20年并有相當?shù)纳钯|量。
通過給予患PVC患者衣殼劑，可抑制造血細胞的增生，為這種致死性疾病進行有效的治療。據(jù)此，一種治療PVC的方法可通過鑒定需要治療PVC的受試者，然后向該受試者給予具有治療有效量的衣殼劑。因為考慮長期治療方案，所用的衣殼劑應優(yōu)選能引起較小免疫反應的一種。
該發(fā)明還有一方面是一種對患者進行抑制內皮細胞生長的治療方法。如上所述，例如在手術損傷后，即在植入瓣膜、斯坦特固定膜或其它修補術或血管形成術之后，受試者會發(fā)生不期望的內皮細胞生長。另外，腫瘤形成和轉移需要內皮細胞的生長和細胞遷移。所以本發(fā)明的實施方案包括抑制癌癥，更精確地說，是抑制與轉移有關的血管生成和細胞遷移的藥物。
血管生成是指通過從已有血管中萌發(fā)的過程形成新的毛細血管。血管生成在發(fā)育過程和許多生理和病理條件下發(fā)生，是組織生長、傷口愈合、女性生殖功能所必需的，是病理過程比如血管瘤形成和眼球新血管化的一個步驟。然而，對血管生成的長期興趣多是源于這一發(fā)現(xiàn)實體瘤生長要突破一臨界體積，必須經歷血管生成。即，腫瘤必須從周圍的基質中募集內皮細胞形成自己的內源性微循環(huán)。
對癌癥患者給予衣殼劑，可以抑制內皮細胞的增生和遷移，所以，腫瘤發(fā)生和遷移就可以防止。因此，抑制血管生成、腫瘤發(fā)生或癌癥的方法可以通過鑒定需要抑制血管生成、腫瘤發(fā)生或癌癥的受試者，然后向該患者給予治療劑有效量的衣殼劑。因為要考慮長期治療方案，所用的衣殼劑應優(yōu)選引起較小免疫反應的那種。
本發(fā)明的另外的實施方案包括含衣殼劑的試劑盒以及用于抑制造血先祖細胞的劑量和用法的書面說明、對所述患者(比如胎兒)進行干細胞移植前抑制患者造血先祖細胞生長的劑量和用法的說明、抑制患者內皮細胞生長的劑量和用法說明，和/或抑制患者P抗原陽性細胞(如真性紅細胞增生)造血增生紊亂的劑量和用法的說明。
雖然根據(jù)實施方案和實施例對本發(fā)明進行了描述，但應該清楚的是在不違背本發(fā)明精神的條件下，可以進行多種修改。因此，本發(fā)明僅受限于下列權利要求。所有此處引用的文獻均作為參考。
序列表<110>Broliden，KristinaWestgren，Magnue<120>細小病毒衣殼顆粒抑制細胞增生和遷移的用途<130>TRIPEP.019A<150>SE 9，804，022-3<151>1998-11-28<160>1<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽<400>1Lys Tyr Val Thr Gly Ile Asn1 權利要求
1.空的、非感染性的重組B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白或B19衣殼蛋白片段用于生產抑制含P抗原的細胞生長或遷移的藥物的用途。
2.根據(jù)權利要求1所述的用途，其中的藥物是抑制造血細胞生長、內皮細胞生長或內皮細胞遷移的藥物。
3.根據(jù)權利要求1所述的用途，其中的藥物是治療血液增生紊亂、血管生成、腫瘤發(fā)生或內皮細胞向植入的假體裝置生長的藥物。
4.根據(jù)權利要求1所述的用途，其中的藥物是干細胞移植前對受試者進行治療的藥物。
5.根據(jù)權利要求4所述的用途，其中的受試者為胎兒。
6.一種抑制含P抗原的細胞的生長或遷移的方法，包括下列步驟將選自B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白和B19衣殼蛋白片段的一種衣殼劑與所述細胞接觸，并測定對該細胞生長或細胞遷移的抑制。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中的細胞是造血源細胞或內皮細胞。
8.一種在干細胞移植前治療受試者的方法，包括下列步驟鑒定需要抑制造血細胞生長的衣殼劑的受試者，然后為該需要的受試者提供選自B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白和B19衣殼蛋白片段的有效量的衣殼劑。
9.一種治療造血增生紊亂的受試者的方法，包括下列步驟鑒定需要抑制造血增生紊亂的衣殼劑的受試者，然后為該需要的受試者提供選自B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白和B19衣殼蛋白片段的有效量的衣殼劑。
10.一種抑制組織向植入的假體中生長的方法，包括下列步驟鑒定需要抑制組織向植入的假體生長的衣殼劑的受試者，然后為該需要的受試者提供選自B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白和B19衣殼蛋白片段的有效量的衣殼劑。
11.一種治療或預防腫瘤發(fā)生的方法，包括下列步驟鑒定需要抑制造血細胞生長的衣殼劑的受試者，然后為該需要的受試者提供選自B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白和B19衣殼蛋白片段的有效量的衣殼劑。
12.一種試劑盒，其包含選自B19細小病毒衣殼、B19衣殼蛋白和B19衣殼蛋白片段的衣殼劑，及用于造血先祖細胞生長抑制、內皮細胞生長抑制或治療造血性增生向受試者施用和劑量的說明。
全文摘要
此處所述的發(fā)明涉及抑制含有P抗原的細胞的生長和/或遷移的方法及組合物的發(fā)現(xiàn),所述細胞包括但不限于造血源細胞和內皮細胞。更確切地,將細小病毒衣殼顆?；蚣毿〔《疽職さ鞍灼斡糜谏a藥物,這些藥物可施用于受試者用來抑制造血先祖細胞生長(例如,在干細胞移植前)、內皮細胞生長(例如,作為抗腫瘤發(fā)生治療或阻止假體植入后再狹窄或纖維化增生)、或用來防止涉及含有P抗原的細胞異常增生的紊亂(例如,真性紅細胞增多)。
文檔編號A61P9/00GK1328469SQ99813653
公開日2001年12月26日 申請日期1999年11月23日 優(yōu)先權日1998年11月24日
發(fā)明者克里斯蒂娜·布羅里登, 馬格努斯·韋斯特格倫 申請人:克里斯蒂娜·布羅里登, 馬格努斯·韋斯特格倫