專利名稱：控制禽類病原體的減毒沙門氏菌活疫苗的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明總地涉及用于家禽和其它鳥類的疫苗，更具體地說，涉及保護家禽或其它鳥類抵抗禽類致病性革蘭氏陰性菌感染的疫苗。
相關(guān)領域描述禽類致病性大腸桿菌(APEC)菌株在家禽和其它鳥類中引起了許多相關(guān)的疾病，包括肺泡炎、蜂窩織炎、大腸桿菌病、大腸桿菌肉芽腫、大腸桿菌敗血病、Hjarre病、臍炎、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎(Gross,W.B.,in Diseases of Poultry,Calnek等人編輯，Iowa State University Press,第138-144頁，1991；Messier等人，Avian Diseases 37:839-844,1993)。這些疾病和由革蘭氏陰性禽類致病菌導致的其它疾病可造成飼料轉(zhuǎn)化成禽體的損失率或動物的死亡率的升高，從而導致家禽產(chǎn)業(yè)每年幾百萬美元的損失。Norton,R.A.Broiler Industry,Feb.1998，第28-32頁。
被沙門氏菌污染的禽體制品是沙門氏菌感染人的重要來源，將導致人的胃腸炎，因此這是一個大眾關(guān)心的公共衛(wèi)生問題?？诜o予鼠傷寒沙門氏菌株的活細胞(該菌株在cya和crp基因上有減毒缺失)，已顯示能對小雞提供優(yōu)異的抗野生型沙門氏菌攻擊的保護力(Hassan等人，Res.Microbiol.141:839-850,1990；Hassan等人，Infect.Immun.62:5519-5527,1994)，并已開發(fā)出在這種菌株中穩(wěn)定表達異源抗原的系統(tǒng)(Hone等人，Microb.Pathog.5:407-418,1998；Strugnell等人，Gene,88:57-63,1990；Galan等人，Gene 94:29-35；1990；Nakayame等人，Bio/Technology 6:639-697,1995)。
APEC菌株基本上僅有幾種血清型(O1、O2、O35和O78)(Cloud等人，Avian Dis.29:1084-1093,1985,Glantz等人，Avian Dis.6:322-328,1962；Gross同上)，而家禽中最普遍的沙門氏菌血清型是B、C和D群。用所謂O-抗原結(jié)構(gòu)是在分子水平測定O血清型革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌和沙門氏菌)，也稱為O-特異性鏈或O-多糖，其通常由各種長度的聚合同種糖單元組成，這些糖單元固著于細菌外膜，作為脂多糖(LPS)分子的最外層組分(Helander等人，in MolecularBiology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,R.A.Meyers編輯，VCH Publishers,Inc.,1995)。
抗LPS O-抗原的特異性抗體己表現(xiàn)出在人的腸道外大腸桿菌感染的哺乳動物模型中保護作用(Cryz等人，Vaccine 13；449-435,1995；Pluschke等人,Infect.Immun.49:365-370,1985)并和已認識到LPS O-抗原可作為其它革蘭氏陰性病原菌的保護性抗原(Ding等人，J.Med.Microb.31:95-102,1990；MicheRi等人，Infect.Immun.60:1786-1792,1992；Robbins等人，Clin.Infect Dis.15:346-361,1992)。另外，一些研究小組已報導了用減毒的沙門氏菌和沙門氏菌-大腸桿菌雜交菌作為幾種人病原菌(包括索氏志賀氏菌、霍亂弧菌和銅綠假單胞菌)的O-抗原的疫苗送遞運載體(Black等人，J.Infect.Dis.155:1260-1265,1987；Formal等人，Infect.Immun.34:746-750,1981；Pier等人，Infect.Immun.63:2818-2825,1995)；(Morona等人，美國專利號No.5,110,588)。然而，在本文所述的研究前，未曾報導過用表達APEC O-抗原的活的減毒沙門氏菌免疫接種家禽。
用大腸桿菌和沙門氏菌制得的LPS O-抗原包括脂類A、R-核心寡聚糖和O-特異性多糖(O-PS)，它們按此順序共價連接。Sugiyama等人，J.Bacteriol.173:55-58,1991。在鼠傷寒沙門氏菌中，R-核心部分的合成是由rfa基因座和一些持家基因(如galE、galU和pgi)指導的，而O-PS的合成是由rfb基因簇(其編碼參與單體糖單元生物合成的酶)和rfc基因(其編碼負責糖單元聚合成大分子量多糖鏈的O-抗原聚合酶)指導的。Sugiyama等人，同上。
-研究合成大腸桿菌O9的LPS O-抗原所需基因的研究組，將含有大腸桿菌O9的rfb基因座的質(zhì)粒引入到野生型鼠傷寒沙門氏菌和在rfb、rfc或rfe基因座中有缺失的鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株中，并報導了含有該質(zhì)粒的野生型菌株在細胞表面表達了大腸桿菌O9和鼠傷寒沙門氏菌的特異性LPS，而rfc突變體僅表達了O9特異性LPS。在鼠傷寒沙門氏菌rfb突變體中也合成了大腸桿菌O-抗原，但在rfe突變體中沒有合成(Sugiyama等人，同上)。該研究組推斷鼠傷寒沙門氏菌rfa和大腸桿菌O9 rfb基因座的基因產(chǎn)物可協(xié)作合成鼠傷寒沙門氏菌R-核心上的大腸桿菌O9抗原。然而，該研究組并未報導任何一種這些重組鼠傷寒沙門氏菌構(gòu)建物是否能在動物宿主中生長或產(chǎn)生抗野生型大腸桿菌O9或鼠傷寒沙門氏菌的宿主保護性免疫應答。因此，需要一種二價疫苗來控制家禽中沙門氏菌和大腸桿菌的感染。這些疫苗將同時有利于公眾的健康以及降低家禽產(chǎn)業(yè)的成本。
發(fā)明概述本發(fā)明的一實施例涉及保護禽類抵抗禽致病性革蘭氏陰性(APG-N)微生物感染的疫苗。該疫苗含有表達APG-N微生物O抗原(系將APG-N的rfb基因簇和rfc基因(下文與APG-Nrfb/rfc基因簇互換使用)整合到沙門氏菌染色體中)的重組沙門氏菌株的活細胞。由于沙門氏菌rfb基因簇和/或沙門氏菌rfc基因中的突變，這種重組沙門氏菌株(為毒性沙門氏菌株的減毒突變株)不表達毒性沙門氏菌株的O-抗原。在一優(yōu)選實施例中，APG-N微生物是APEC菌株，且APG-Nrfb/rfc基因簇為APEC rfb/rfc基因簇。
這種重組沙門氏菌株的其它特性使其可用于家禽和其它禽類的疫苗。首先，可將該疫苗配制成用于口服給予，且已知口服疫苗能刺激腸相關(guān)淋巴組織(GALT)，包括粘膜、體液和細胞免疫應答。同樣口服活疫苗造價低廉，而且在飼養(yǎng)場中比注射用疫苗易于給藥。其次，由于不表達載體菌株的特異性LPS O-抗原，避免了載體菌LPS O-抗原可能對APG-NO-抗原表達的干擾或疫苗接受者免疫系統(tǒng)對其的識別。第三，該重組沙門氏菌株具有抵抗APG-N微生物和沙門氏菌親代株的保護作用，因為其表達了沙門氏菌親代株的其它細胞表面抗原。另外，對于表達APEC菌株O-抗原的疫苗，用沙門氏菌(而不是大腸桿菌)作為載體菌能提供更強的抗APEC O-抗原的免疫應答，因為當腸炎沙門氏菌亞種在脾和法氏囊(bursa of Fabricius)中長期存在時，大腸桿菌不能有效地入侵這些淋巴組織或即使偶爾成功地進入也會被迅速殺死。
在一些實施例中，用于疫苗的重組沙門氏菌株也含有編碼所需基因產(chǎn)物的重組多核苷酸。一優(yōu)選基因產(chǎn)物是禽類致病性革蘭氏陽性(APG-N)微生物或真核禽類病原體的抗原。
在另一實施例中，本發(fā)明提供用于免疫接種禽類以抵抗至少兩種禽類致病性革蘭氏陰性(APG-N)微生物的多價疫苗，該疫苗含有表達每種APG-N微生物O-抗原的重組沙門氏菌株的活細胞，該重組沙門氏菌株具有已整合入沙門氏菌染色體的每種APG-N微生物的rfb/rfc基因簇，并在沙門氏菌rfb基因簇中或沙門氏菌rfc基因中有一個突變，從而使沙門氏菌O-抗原的表達失活，所述的重組沙門氏菌株是毒性沙門氏菌株的減毒突變株。在一優(yōu)選實施例中，一種或兩種APG -N微生物是APEC菌株。
在另一實施例中，本發(fā)明提供用于免疫接種禽類以抵抗至少兩種APG-N微生物的多價疫苗，該疫苗含有兩種重組沙門氏菌的活細胞混合液，第一種重組沙門氏菌株已具有整合入沙門氏菌染色體的第一種APG-N微生物的rfb/rfc基因簇，并表達第一種APG-N微生物的O-抗原，第二種重組沙門氏菌株已具有整合入沙門氏菌染色體的第二種APG-N微生物的rfb/rfc基因簇，并表達第二種APG-N微生物的O-抗原，其中所述的第一和第二種重組沙門氏菌株在沙門氏菌rfb基因簇中或沙門氏菌rfc基因中各有一個突變，從而使沙門氏菌O-抗原的表達失活，所述的第一和第二種重組沙門氏菌株都是毒性沙門氏菌株的減毒突變株。在一優(yōu)選實施例中，在多價疫苗中的一種或兩種重組沙門氏菌株表達APEC菌株的O-抗原。
本發(fā)明的其它實施例涉及免疫接種禽類以抵抗APG-N微生物感染的方法。這些方法包括免疫接種禽類以抵抗APG-N微生物的一種方法，其包括給予禽類免疫學有效劑量的疫苗，所述的疫苗含有表達APG-N微生物O-抗原的重組沙門氏菌的活細胞，該重組沙門氏菌株具有已穩(wěn)定整合入沙門氏菌染色體的APG-N微生物的rfb/rfc基因簇，且在沙門氏菌rfb基因簇或沙門氏菌rfc基因中有一個突變，從而使沙門氏菌O-抗原的表達失活，所述的重組沙門氏菌株是毒性沙門氏菌株的減毒突變株。這些方法還包括同時免疫接種禽類以抵抗多種APG-N微生物的方法，包括給予禽類免疫學有效劑量的上述多價疫苗。還包括同時免疫接種禽類以抵抗APG-N微生物和載體沙門氏菌的方法，包括給予禽類免疫學有效劑量的上述任何一種疫苗。
在另一實施例中，本發(fā)明提供制造用于免疫接種禽類以抵抗APG-N微生物的疫苗的方法。該方法包括以下步驟選擇能在禽類中定居的沙門氏菌；將APG-N微生物的rfb/rfc基因簇整合入沙門氏菌的染色體中；在沙門氏菌rfb基因簇和/或沙門氏菌rfc基因中引入突變；和分離表達APG-N微生物O-抗原但不表達沙門氏菌O-抗原的重組沙門氏菌。在一實施例中，所選定的沙門氏菌株是毒性沙門氏菌株的減毒突變株。在另一實施例中，所選定的沙門氏菌株是毒性沙門氏菌株，所述方法還包括在毒性沙門氏菌株中將減毒突變引入到沙門氏菌毒性基因中的步驟，以及分離毒性減弱(與毒性沙門氏菌株相比)的突變株。
本發(fā)明可實現(xiàn)的幾個益處是提供能保護禽類，尤其是家禽以抵抗APEC菌株和其它APG-N微生物感染的重組沙門氏菌活疫苗，以及制造這種疫苗的方法；提供可一同時保護禽類抵抗兩種或多種APG-N微生物感染的多價疫苗；提供免疫接種禽類以抵抗APEC菌株和其它APG-N微生物的方法；和提供免疫接種禽類以抵抗APEC和沙門氏菌的方法。
附圖簡述

圖1為自殺粘粒pMEG219的基因圖，表現(xiàn)有以下特征復制的pir-依賴性起點(P6K ori)；Tn10的四環(huán)素抗性基因(tetR,tetA)；質(zhì)粒RK2的可移動片段(mob)、pCOS2EMBL的卡那霉素抗性基因(Kan)和雙cos位點(cos)；和鼠傷寒沙門氏菌Δcya-27等位基因；和本文所述的NotⅠ和PvuⅡ限制位點；圖2顯示了用抗鼠傷寒沙門氏菌B群LPS抗體(圖2A)或抗O78LPS抗體(圖2B)探測從示出的菌株分離得到的LPS作Western印跡的數(shù)字化圖像；圖3顯示了用抗鼠傷寒沙門氏菌B群LPS抗體(圖3A)或抗O78LPS抗體(圖3B)探測從示出的菌株分離得到的LPS作Western印跡的數(shù)字化圖像，圖3A顯示的印跡凝膠中包括分子量標記；圖4顯示了pMEG287的基因圖，顯示了本文所述的基因位點；和圖5顯示了pMEG055的基因圖，顯示了本文所述的基因位點。
發(fā)明詳述本發(fā)明的基礎是發(fā)現(xiàn)腸炎沙門氏菌，尤其是鼠傷寒沙門氏菌能被工程改造成在細胞表面以免疫原性形式表達APG-N微生物(尤其是O78和O1 APEC菌株)的O抗原，而這種表達不受載體沙門氏菌在家禽體內(nèi)生長或在GALT中定居的干擾。另外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)口服給予小雞這種重組沙門氏菌株，導致明顯降低毒性APEC菌株在疫苗接種過的小雞中感染并致病的能力。
因此，本發(fā)明的一實施例為用于免疫接種禽類以抵抗禽病原性革蘭氏陰性微生物(APG-N)的疫苗，該疫苗包含表達APG-N菌株O抗原的重組沙門氏菌株的活細胞。以免疫原性形式表達的APG-NO抗原意味著APG-NO抗原是整個LPS O-抗原分子的一部分，其中APG-NO抗原連接于LPS核心部分，給予禽類后，能產(chǎn)生可與野生型APG-N微生物的LPS O抗原反應的抗體。通常，LPS核心部分是由重組沙門氏菌載體菌合成的，但在一些實施例中LPS核心可以來自O抗原相同的APG-N微生物或來自不同的APG-N微生物。
考慮可用此疫苗免疫接種各種類型禽類，包括雞、火雞、鴨、鵝、野雞和其它被分類為家禽的馴養(yǎng)禽類，以及未馴養(yǎng)的禽類如野火雞，和外來品種如鸚鵡、長尾小鸚鵡等，使它們能抵抗任何目前已知的或后來測定的對禽類病原性APG-N微生物。這些APG-N微生物包括，但并不限制于(1)APEC菌株，如大腸桿菌血清型O1、O2、O3、O6、O8、O15、O18、O35、O71、O74、O78、O87、O88、O95、O103和O109；(2)禽致病性沙門氏菌株，如C群和D群菌株；和(3)以下菌屬的品種彎曲桿菌屬、擬桿菌屬、博德特氏菌屬、嗜血菌屬、巴斯德氏菌屬、弗朗西絲氏菌屬、放線桿菌屬、克雷伯氏菌屬、穆爾氏菌屬、假單胞菌屬、變形菌屬和鳥桿菌屬。較佳地，該重組沙門氏菌株表達APEC菌株的O抗原。更佳的是，APEC O抗原是O1、O2、O35或O78血清型特征，最佳的是O抗原是O1 LPS、O2 LPS或O78 LPS。
用于疫苗的重組沙門氏菌株的制備是通過將所需APG-N微生物的rfb/rfc基因簇整合到適當沙門氏菌株的染色體中。用作載體菌的沙門氏菌株可從能在禽類(尤其是家禽)中定居的沙門氏菌衍生獲得。這些菌種包括，但并不限制于鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、雞沙門氏菌、雛沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌亞利桑那亞種、海德爾堡沙門氏菌、鴨沙門氏菌、哈達爾沙門氏菌、會聚沙門氏菌、蒙得維的亞沙門氏菌、肯塔基沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌、施瓦曾格隆得沙門氏菌、圣保羅沙門氏菌、勃蘭登堡沙門氏菌、S.instanbul、古巴沙門氏菌、布雷得尼沙門氏菌、布靈得盧柏沙門氏菌、利文斯通沙門氏菌、貝塔沙門氏菌、加里福尼亞沙門氏菌、森夫頓堡沙門氏菌和salmonella mbandaka。本文所用的“定居的”指能附著于、侵入并保留在接種疫苗家禽的以下一種或多種組織中的沙門氏菌種肺、脾、肝、法氏囊和盲腸。較佳地，該重組沙門氏菌株是從鼠傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌、雛沙門氏菌或腸炎沙門氏菌衍生獲得的。更佳的是，APG-Nrfb/rfc基因簇被插入到鼠傷寒沙門氏菌株中。
如本文所述，APG-Nrfb/rfc基因簇含有合成APG-N微生物特征性O抗原必須的所有基因，包括所有rfb基因(其產(chǎn)物為生物合成單體糖單元所需的)，以及rfc基因(其編碼糖單元聚合所需的O抗原聚合酶)。術(shù)語rfb基因和rfc基因是指任何APG-N微生物的那些經(jīng)鑒定為編碼基因產(chǎn)物的基因，其在O抗原生物合成中具有與大腸桿菌rfb/rfc基因簇相同的功能。在大多數(shù)大腸桿菌和沙門氏菌血清型中，rfc基因緊密連接于rfb基因簇，其在大腸桿菌中的長度約為10kb，位于大腸桿菌基因圖上45分鐘附近。但在一些大腸桿菌株以及鼠傷寒沙門氏菌中，rfc基因不連接于rfb基因簇，而且發(fā)現(xiàn)兩者距離非常大。例如，在鼠傷寒沙門氏菌中，約21kb的rfb基因簇在鼠傷寒沙門氏菌基因圖上從44.9-45.3 centisomes延伸，而rfc基因位于35.7 cenrisome。
用常規(guī)粘?？寺》椒ㄒ芽煽寺」δ芡耆腁PG-Nrfb/rfc基因，如先前克隆細菌rfb/rfc基因簇所述?？蓞⒁奦iret等人，歐洲專利0 564 689 B1；Neal等人，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.82:345-352,1991；Haraguchi等人，Microb.Pathog.6:123-132,1989；Microb.Pathog.10:351-361,1991；Heuzenroeder等人,Mol.Microbiol.3:295-302,1989；Bastin等人，Mol.Microbiol.5:2223-2231,1991；和Valvano等人，Infect.Immun.57:937-943,1989。Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989中詳細描述了一般的粘粒克隆方法。簡單地說，在大腸桿菌K-12菌株中制備所需APG-N微生物染色體DNA的粘粒文庫，由于rfb區(qū)域的突變K-12菌株不產(chǎn)生O抗原。接種此粘粒文庫，用對所需APG-N菌株O抗原特異性的抗血清，來篩選分離出的菌落是否表達APG-NO抗原。可從陽性粘?？寺≈蟹蛛x出APG-N染色體DNA片段，并用標準技術(shù)(如限制圖和亞克隆)進一步鑒定以確定指導APG-NO抗原合成所需APG-NDNA的最小量。本文所述的最小量是指rfb/rfc基因簇。對于那些rfc基因與rfb基因簇距離相當遠的APG-N微生物而言，在該粘粒文庫中可能不存在含有功能性rfb/rfc基因簇的單個APG-N染色體片段。在這種情況中，需要進行其它常規(guī)克隆和篩選實驗來克隆rfc基因并構(gòu)建含有rfb基因和rfc基因的重組片段。然后將rfb/rfc基因簇作為粘?；蛸|(zhì)粒轉(zhuǎn)染入選定的沙門氏菌株，用本領域已知的方法以及以下簡述的方法分析所得重組體產(chǎn)生的LPS。
已報導了沙門氏菌LPS核心部分不接受一些細菌的異源性O抗原，導致非結(jié)合O抗原，其可能比攜帶異源性O抗原(共價連接于載體菌的核心部分)的完整LPS分子免疫原性低(歐洲專利0 564 689 B1；Morona等人，美國專利No.5,110,588)?？捎肧DS-PAGE分析指數(shù)生長后期提取的LPS或用快速小規(guī)模小量制備方法進行靜止培養(yǎng)，將表達完整LPS O抗原的重組菌株與那些表達非結(jié)合O抗原的重組菌株相區(qū)別(Hitchcock和Brown,J.Bacteriol.154:269-277,1983)?？捎勉y染色法或用O抗原特異性抗體作免疫印跡分析檢測凝膠中分開的LPS分子。完整LPS O抗原(本文也稱為光滑性、或S型LPS)能產(chǎn)生可用銀染色法或免疫印跡分析檢測的高分子量梯狀條帶，而非結(jié)合O抗原用銀染色法或抗體檢測不產(chǎn)生(序列)梯而為成片條帶。在這種情況中，沙門氏菌rfa基因座(指導LPS核心的合成)可用其它細菌(如大腸桿菌K-12或APG-N微生物)的rfa基因座替換，以衍生得到rfa和APG-Nrfb/rfc基因簇的組合，該組合將指導免疫原性形式的APG-NO抗原的合成。
為了確保異源性抗原的穩(wěn)定表達并消除維持沙門氏菌株的染色體外元件所需要使用的抗生素，可將APG-Nrfb/rfc基因簇整合到沙門氏菌染色體中。這可用任何已知的方法實現(xiàn)，較佳地通過在毒力基因中缺失/插入明確的突變，以產(chǎn)生下述的減毒突變株。另外，也可以不減弱重組沙門氏菌株毒性的方式整合入APG-Nrfb/rfc基因簇。
重組沙門氏菌株在沙門氏菌rfc基因中也含有突變，從而使沙門氏菌O抗原聚合酶的表達失活。O抗原聚合酶缺陷型沙門氏菌突變株能產(chǎn)生稱為半粗糙型(SRLPS)的LPS分子，其最多具有一個連接于給定核心單元的O抗原性糖單元，而不是通常在Rfc+菌株中所見到的30-40個糖單元。這些SR LPS分子不大可能干擾長得多的APEC LPS O抗原刺激保護性免疫應答的能力?？蓮囊押衦fc突變的菌株制備重組沙門菌株，或在將APEC rfb/rfc基因簇整合入沙門氏菌染色體的同時或之后引入rfc突變。
可用本領域已知的常規(guī)方法制造沙門氏菌rfc突變株。例如，在所需沙門氏菌株(見，如Curtiss，美國專利5,672,345)和具有Rfc-表型(即，表達SR LPS)的突變體(Collins等人，J.Bacteriol.173:2521-2529,1991)的染色體中進行隨機轉(zhuǎn)座子插入。另外，可用重組DNA技術(shù)(如本文實施例中所述)在沙門氏菌rfc基因中引入一個缺失突變。簡單地說，已克隆和測序了鼠傷寒沙門氏菌的rfc基因，據(jù)信其在沙門氏菌株血清群A、B和D1中是保守的(Collins等人，同上)。根據(jù)這一信息，可克隆沙門氏菌株(屬于這些血清群之一)的rfc基因，并用于構(gòu)建在克隆的rfc基因中含有一個缺失的自殺質(zhì)粒。將這種質(zhì)粒引入到rfc+沙門氏菌株中，將使染色體rfc基因和Δrfc質(zhì)粒間發(fā)生同源重組。然后在培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞，而無需選擇質(zhì)粒和篩選Rfc-表型的分離物。
可通過SDS-PAGE分析從細菌分離得的LPS和檢測具有沙門氏菌株特異性O-糖單元的高比例SR LPS，以測試沙門氏菌突變株的Rfc-表型。另一可用于篩選Rfc-表型的沙門氏菌突變株的方法是用S型LPS特異性噬菌體的噬菌體敏感試驗。例如，用P22裂解鼠傷寒沙門氏菌和其它具有Rfc+表型(即表達S型LPS)的B群沙門氏菌株，而這些菌株的Rfc-突變體抵抗P22介導的裂解，因為P22不識別這些突變體菌株表達的SR LPS。
同樣也設想采用與本文所述的制備僅表達APG-NO抗原菌株方法類似的技術(shù)，可構(gòu)建表達多種APG-N微生物APG-NO抗原的重組沙門氏菌株。
因為此疫苗含有重組沙門氏菌的活細胞，因此可將活的重組沙門氏菌送遞給消耗家禽食品(如蛋和肉)的人。另外，腸炎沙門氏菌會在幼禽中引起疾病。因此，本發(fā)明的一個重要特征是此重組沙門氏菌株是毒性腸炎沙門氏菌的減毒突變株。如本文所述，減毒突變株是指能在疫苗接種過的禽類中定居并復制，但基本上不能導致疾病癥狀的重組沙門氏菌株，所述的病癥與相應的毒性菌感染禽類和感染人相關(guān)。術(shù)語“基本不能導致病癥”是指減毒突變株不產(chǎn)生病癥或產(chǎn)生不大嚴重和/或數(shù)量較少的這些病癥。然而減毒突變株對疫苗接受者的正常生理功能可能有一定的影響，可能是禽類而不是預定疫苗接受者以及其它非人類宿主的病原體。
此重組沙門氏菌株可從毒性腸炎沙門氏菌天然無毒突變株衍生獲得，或通過用熟知的方法將減毒突變引入到野生型毒性菌株中。減毒突變可位于生物合成基因、調(diào)節(jié)基因和/或與毒力有關(guān)的基因中。(見Doggett和Brown,in Mucosal Vaccines,Kiyono等人編輯，Academic Press,San Diego,1996，第105-118頁)。突變能導致減毒的基因例子包括，但并不限制于，在pab基因、pur基因、aro基因、asd、dap基因、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cdt、cya、crp、phoP、phoQ、rfc、poxA、galU中的突變和它們的混合。突變可以是插入、部分或完全缺失等，只要降低該基因的表達并減少毒性。本領域技術(shù)人員易于理解，任何適當?shù)幕蛲蛔兛捎糜诒景l(fā)明，只要該基因的突變使微生物減毒。較佳地，本發(fā)明的載體菌至少有兩個突變，每個突變都能起降低微生物毒性作用，而且聯(lián)合起來能明顯增加微生物不能回復成野生型毒力的可能性。
可用本領域已知的方法進行突變，以產(chǎn)生本發(fā)明的減毒重組沙門氏菌株。例如，可用轉(zhuǎn)座子Tn10在各種細菌(包括沙門氏菌)中產(chǎn)生染色體缺失(Kleckner等人，J.Mol.Biol.116:125-159,1997；歐洲專利局公開號No.315,682；美國專利號No.5,387,744)。
最近已有新方法在基因中產(chǎn)生特異性缺失。這些方法包括首先選出其中要產(chǎn)生缺失的基因。在一種方法中，這種基因可選自可購得的或用本領域熟知方法構(gòu)建的基因組文庫(Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版,1989,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)。用在相同基因中含有突變的菌株進行互補，從該基因組文庫中分離出含該基因的克隆。另外，當已知該基因的DNA序列時，選出的用于聚合酶鏈反應(PCR)的引物能從細菌樣品或純化的基因組DNA擴增該基因，通常帶有某些側(cè)翼序列，可將PCR產(chǎn)物插入到一個克隆載體中。
可用兩種通用常規(guī)方法之一在選定的基因中產(chǎn)生特異性缺失。第一個方法用限制酶從基因組DNA文庫所含的克隆群分離的基因中產(chǎn)生突變，第二種方法用PCR在已知序列的基因中產(chǎn)生突變。第一種方法中，用轉(zhuǎn)座子靶向鑒定該基因在載體上的位置，并產(chǎn)生該載體中重組DNA的限制圖。由轉(zhuǎn)座子靶向得到的信息，使得能用已知的限制酶位點從該載體切出基因的所有部分或一部分。當該基因的DNA序列是已知時，可采用基于PCR方法的第二種方法。按這種方法，趨異性(divergent)PCR引物擴增了(將從該基因中缺失的)側(cè)接特定DNA序列的上游和下游區(qū)域，并產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，包含克隆載體和側(cè)翼核苷酸序列的上游和下游(Innes等人編輯，PCR Protocols,1990,Academic Press,New York)。在該方法的改進中，產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物具有該基因部分或側(cè)翼序列，然后將其與一克隆載體連接在一起。
用化學方法或電穿孔法轉(zhuǎn)化、重組噬菌體感染或偶聯(lián)，可將含有突變基因的DNA引入到細菌宿主中。在優(yōu)選實施例中，將突變基因引入到細菌的染色體中，這可通過本領域熟知的許多方法之一來實現(xiàn)，例如用溫度敏感復制子的方法(Hamilton等人，J.Bacteriol.171:4617-4622,1989)、recBC突變體的線性轉(zhuǎn)化(Jasin等人，J.Bacteriol.159:783-786,1984)或稱為自殺載體的宿主限制的復制子(Milller等人，J.Bacteriol.170:2575-2583,1988)。將所用的特定方法與適當?shù)姆催x擇方法如鐮孢菌酸抗性或蔗糖抗性聯(lián)合，然后篩選含有突變體等位基因(根據(jù)表型特征)的克隆，或作PCR、核酸雜交，或用免疫學方法。
本發(fā)明中所用的重組沙門氏菌株也可用于將所需的基因產(chǎn)物送遞給接種疫苗的禽類。術(shù)語“基因產(chǎn)品”是指在某基因控制下發(fā)生的生物化學反應結(jié)果而產(chǎn)生的任何生物產(chǎn)品?；虍a(chǎn)品的可以是如RNA分子、肽、蛋白質(zhì)、或在酶或其它分子(是該基因的最初產(chǎn)物)控制下得到的產(chǎn)物，即代謝產(chǎn)物。例如，基因可能先控制RNA分子的合成，而RNA分子通過核糖體的作用翻譯產(chǎn)生成酶，該酶控制發(fā)現(xiàn)該基因的原細胞的外環(huán)境中聚糖的形成。此RNA分子、酶和聚糖都是本文所述的基因產(chǎn)物。理想基因產(chǎn)物的例子包括，但并不限制于，抗原、各種宿主細胞蛋白質(zhì)、藥理活性產(chǎn)物、毒素和細胞凋亡調(diào)節(jié)劑。
抗原或免疫原是指含有一個或多個表位的分子，這些表位能刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對該抗原特異性的分泌性體液和/或細胞免疫應答。表位可以是抗原上抗體特異性接合的位點。對于蛋白質(zhì)抗原，一個表位包含有呈立體構(gòu)象的3個氨基酸，此構(gòu)象是該表位特有的；通常，一個表位至少由此抗原的6個連續(xù)氨基酸構(gòu)成，或更經(jīng)常由此抗原的至少10-12個連續(xù)氨基酸構(gòu)成。術(shù)語“表位”與本文所用的“抗原決定簇”可互換。術(shù)語“表位”還包括T-輔助細胞表位，其中包括T-輔助細胞通過與主要組織相容性復合物Ⅱ類分子相結(jié)合而識別的抗原決定簇。此外，術(shù)語表位包括細胞毒T細胞所識別的抗原、表位或抗原決定簇(當通過抗原遞呈細胞表面的MHCⅠ類分子遞呈時)。細胞毒T細胞表位可包含約6-11個連續(xù)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，較佳地是由8-9個連續(xù)氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列。
若所需的基因產(chǎn)物是細菌、真菌、寄生蟲或病毒疾病因子的抗原，可用此重組沙門氏菌株疫苗接種禽類以抵抗這些因子造成的疾病，同時也是抗APG-N微生物的疫苗接種。例如，可用此重組沙門氏菌株送遞不表達O-抗原的禽類病原性微生物的抗原，如革蘭氏陽性(APG-P)菌。這些微生物包括，但并不限制于，枝原體屬、利斯特氏菌屬、疏螺旋體屬、衣原體屬、梭菌屬、棒桿菌屬、柯克斯立克次體屬、Eysipelothrix、黃桿菌屬、葡萄球菌屬和鏈球菌屬。已知感染家禽的真菌和寄生蟲禽致病體的例子為變形帶屬、Aproctella、雞蛔蟲屬、曲霉屬、念珠菌屬、毛細線蟲屬、隱孢子蟲屬、Cvathostroma、咽飾帶屬、艾美蟲屬、縐緣絳蟲屬、筒線蟲屬(Gongylonemia)、異刺屬、組織滴蟲屬、尖旋尾線蟲屬、瘧原蟲屬(P1asmondium)、瑞立絳蟲屬、類圓線蟲屬、錐尾線屬、比翼屬、四棱線蟲屬和毛圓線蟲屬。已知感染家禽的病毒包括腺病毒(如出血性腸炎病毒)、星形病毒、冠狀病毒(如傳染性支氣管炎病毒)、副粘病毒(如新城疫雞瘟病毒)、小核糖核酸病毒(如禽腦脊髓炎病毒)、痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(如禽造白細胞組織增生/肉瘤病毒)、呼腸孤病毒和輪狀病毒。較佳地用作抗原的基因產(chǎn)物是多糖和蛋白質(zhì)，包括糖蛋白和脂蛋白。可克隆這些原核和真核微生物的抗原編碼基因，并用標準方法在此重組沙門氏菌株中表達。
在其它實施例中，該所需基因產(chǎn)物指導了配子特異性抗原的表達，該抗原能引發(fā)免疫應答，從而對免疫接種的動物起抗生殖作用(見美國專利5,656,488)。
如本文所述，疫苗是指用于刺激動物免疫系統(tǒng)的制劑，從而提供針對免疫系統(tǒng)不識別為自身抗原的抗原的保護作用。免疫接種是指在受免疫接種的動物中誘導持續(xù)高水平的抗體和/或細胞免疫應答的過程，應答中T淋巴細胞能殺死病原體和/或激活其它細胞(如吞噬細胞)來殺死病原體，該應答是針對動物先前接觸過的病原體或抗原的。在本申請中術(shù)語“免疫系統(tǒng)”是指解剖特征和機理，禽類通過該系統(tǒng)產(chǎn)生針對抗原性物質(zhì)(侵入脊椎動物的細胞或個體的細胞外液態(tài))的抗體，并包括細胞免疫應答。
就抗體產(chǎn)生而言，如此產(chǎn)生的抗體可屬于任何免疫類別，如免疫球蛋白A、D、E、G或M。特別感興趣的是刺激產(chǎn)生免疫球蛋白A(IgA)的疫苗，因為其是禽類分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的主要免疫球蛋白，但本發(fā)明的疫苗并不僅限制于那些刺激產(chǎn)生IgA的疫苗。例如，本文所述的天然疫苗除形成IgA外，可產(chǎn)生范圍廣泛的其它免疫應答，例如細胞和體液免疫力。已很好的研究了對抗原的免疫應答并有許多報導。
也可用本發(fā)明的無毒微生物作為合成其它蛋白質(zhì)的載體，包括合成禽類產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)分子，和刺激或抑制各種生理功能(如生長速率、脂肪或蛋白質(zhì)含量等)的藥理活性產(chǎn)物的載體。
重組多核苷酸編碼了所需的基因產(chǎn)物。術(shù)語“重組多核苷酸”是指實驗室操作的結(jié)果，導致將一啟動子引入到此沙門氏菌株中，該啟動子可操作性連接于來自各種內(nèi)源和/或外源的基因。這種啟動子是在沙門氏菌株中有功能性的啟動子，以表達此基因。該基因可以來自染色體、質(zhì)粒或病毒。本文所用的基因是任何能產(chǎn)生所需基因產(chǎn)物的生物性遺傳單元。但該基因不必是親代微生物中那樣的完整基因，也無需具備產(chǎn)生大分子(如功能性多肽)或調(diào)節(jié)大分子產(chǎn)生的能力。因此該重組多核苷酸可編碼某抗原性產(chǎn)物的全部或部分?；蛞部芍妇哂袕挠H代微生物天然序列突變產(chǎn)生的序列的多核苷酸。該重組多核苷酸也可指編碼幾種基因產(chǎn)物的DNA的一長段，這些基因產(chǎn)物中的一個或多個可以是抗原性的或是生物合成通路(導致產(chǎn)生所需的基因產(chǎn)物)的一部分。例如，這種DNA的一長段可編碼5-15個菌毛抗原(菌毛)合成所必需的蛋白質(zhì)，該菌毛介導了病原體與宿主細胞的粘附(Baumler等人，同上)。誘導抗菌毛的免疫應答能提供抵抗病原體的保護力。本文所用的術(shù)語“基因”還包括缺失內(nèi)含子的DNA分子，例如cDNA分子，只要此DNA序列能編碼所需的基因產(chǎn)物。編碼所需基因產(chǎn)物的重組多核苷酸可包括除啟動子以外的其它DNA序列，如終止序列和原核基因表達的其它調(diào)節(jié)子。
可用各種方法如偶聯(lián)、電穿孔或轉(zhuǎn)化(從外環(huán)境中攝取裸DNA，可用各種化學試劑(如鈣離子)進行人工誘導)，以質(zhì)粒、噬菌體或粘粒載體形式將編碼所需基因產(chǎn)物的重組多核苷酸轉(zhuǎn)移到沙門氏菌株中。其它方法如轉(zhuǎn)導也是適用的，其中用噬菌體包裝呈轉(zhuǎn)導噬菌體或粘粒載體形式的重組DNA。一旦重組多核苷酸在載體沙門氏菌中，它就可作為獨立自主的復制子持續(xù)存在，或它可插入到沙門氏菌染色體中，在細胞分裂過程中隨染色體一起再生。
較佳地，將該多核苷酸摻入一“平衡致死”系統(tǒng)中，通過將存活的微生物與持續(xù)存在的該重組多核苷酸相連，選擇含有并能表達所需基因產(chǎn)物的微生物。這種類型的“平衡致死”突變體的特征為缺失編碼細胞存活所必須的酶的功能性天然染色體基因，較佳地是催化生物合成二氨基庚二酸(DAP)中一個步驟的酶，更佳的是一編碼β-天冬氨酸半醛脫氫酶(Asd)的基因。細胞壁合成需要DAP通路的酶和Asd?！捌胶庵滤馈蓖蛔凅w也含有起補充非功能性染色體基因作用的一個重組基因，該補充性重組基因結(jié)構(gòu)上連接于編碼所需基因產(chǎn)物的重組多核苷酸。當細胞處于缺乏DAP的環(huán)境時，丟失該補充性重組基因?qū)е录毎蛄呀舛劳觥Ｓ捎贒AP不是由真核生物合成的，因此DAP在感染的禽類組織中并不存在，故這一策略尤其有用。美國專利No.5,672,345中公開了制備這些類型“平衡致死”微生物的方法。
可用任何已知的或標準方法(包括粘膜或肌內(nèi)注射)，將此疫苗給予家禽。較佳地給藥方法包括口服或支氣管-鼻腔-眼噴霧。這些方法使重組沙門氏菌易于到達腸相關(guān)淋巴組織(GALT)或支氣管相關(guān)淋巴組織(BALT)，并誘導抗體形成和細胞介導免疫。特別優(yōu)選的給藥方法是疫苗接種剛孵化的家禽，如在孵化日通過粗噴淋接種。
在重組沙門氏菌株生長和收獲后，凍干細菌細胞，尤其當它們與食物混合時?？捎萌魏嗡帉W上欲接種疫苗禽類可接受的賦形劑，來制備由重組沙門氏菌組成的疫苗。例如，若疫苗是以固態(tài)形式給予的，可用對待接種禽類無毒的且與該細菌相容的材料包被細胞和/或膠囊化。也可用固態(tài)運載體如滑石粉或蔗糖。如果是以液態(tài)形式給予的，可將細胞懸浮在適當?shù)囊簯B(tài)運載體中，包括如脫脂乳、普通鹽水和/或其它無毒鹽水(生理濃度或接近生理濃度)，和其它本領域技術(shù)人員已知的適當液態(tài)運載體。需要時也可加入佐劑已提高抗原性。當疫苗是以噴淋形式給予時，可將重組沙門氏菌細胞懸浮在適當?shù)木彌_液中，如BSG中(含明膠的緩沖鹽水，CurtissⅢ,R.,J.Bacteriol.89:28-40,1965)。
需要的劑量取決于重組沙門氏菌株表達的APEC LPS O-抗原的量和抗原性，也取決于待疫苗接種的禽的類型、大小和年齡。例如，與疫苗接種年老禽類所需的劑量相比，疫苗接種剛孵化的禽類需要的劑量較小。用例行實驗易得出所需的劑量。通常劑量的濃度范圍為105-109活細胞/禽。用活重組沙門氏菌細胞組成的疫苗噴淋接種剛孵化的小雞的優(yōu)選劑量為約106-108活細胞/禽，更佳的劑量是約5×107活細胞/禽。
以下實施例描述了本發(fā)明的優(yōu)選實例。本領域技術(shù)人員在參考了本文所公開的本發(fā)明的說明書或?qū)嵗螅瑢髁嗽跈?quán)利要求書范圍以內(nèi)的其它實施例。本說明書以及實施例僅作說明用，權(quán)利要求書才表明本發(fā)明的范圍和精神。
實施例1本實施例說明共表達鼠傷寒沙門氏菌B群LPS和大腸桿菌O78 LPS的減毒重組鼠傷寒沙門氏菌株的構(gòu)建。
減毒策略在cya和crp基因中具有缺失的鼠傷寒沙門氏菌株已表現(xiàn)出是減毒的，且對小雞有免疫原性(Hassan等人，Res.Microbiol.141:839-850,1990；Porter等人，Avian Dis.37:265-273,1993)，此外，能引發(fā)抗野生型鼠傷寒沙門氏菌攻擊的保護性免疫應答(Hassan等人，同上，Hassan等人，Infect.Immun.62:5519-5527,1994)。從生化角度而言，cya或crp中的缺失將導致不能發(fā)酵各種糖，包括麥芽糖(Botsford等人，Microbiol.Rev.1992)。因此，在MacConkey麥芽糖培養(yǎng)基上ΔcyaΔcrp鼠傷寒沙門氏菌疫苗菌株形成白色菌落，而野生型沙門氏菌株形成紅色菌落，因此就可用簡單的方法鑒別疫苗菌株和野生型鼠傷寒沙門氏菌。根據(jù)早期的這些發(fā)現(xiàn)，選擇ΔcyaΔcrp鼠傷寒沙門氏菌作為載體菌株。
將O78 rfb/rfc基因簇插入到沙門氏菌染色體中。為了便于將O78 rfb插入到鼠傷寒沙門氏菌染色體中，并在一個步驟中在沙門氏菌cya基因中產(chǎn)生減毒性缺失突變，構(gòu)建了一pir依賴性粘粒載體，pMEG219。如圖1和下表1所示，pMEG219具有以下特征復制的pir-依賴性起點；Tn10的四環(huán)素抗性基因、質(zhì)粒RK2的可動片段、pCOS2EMBL的卡那霉素抗性基因和雙cos位點、以及克隆的鼠傷寒沙門氏菌Δcya-27等位基因。因為起點是pir依賴性的，該粘粒只能在已工程改造過提供Pir蛋白質(zhì)的特異性大腸桿菌株中復制，但在野生型鼠傷寒沙門氏菌株中則不能(Kolter等人，Cell 15:1199-1208,1978)。cya-27等位基因含有確定的cya缺失(其由cya下游區(qū)域的327bp缺失構(gòu)成，包括前13個密碼子)、和此缺失側(cè)翼序列上游的476bp及側(cè)翼序列下游的1,826bp。此外，在該缺失點工程改造了一NotⅠ位點，以便于將DNA插入到cya基因中(P.Sundarum，個人通信)。
表1．菌株和質(zhì)粒菌株 相關(guān)基因型來源或參考文獻大腸桿菌x7122 禽病原性菌株078:K80:H9,nalrProvence等人.,Infect.Immun.
60:4460-4467,1992MGN026 endA1 hsdR17 supE44 thi-1 recA1gyrA relA1Δ(lacZYA-argF)U169S.Tingeλpir deoR(φ80ΔlacZM15)MGN617 SM10λpir[thi-1 thr-1 leuB6 supE44 tonA21lacY1 recA RP4-2-Tc::Muλpir]ΔasdA4 本研究Δzgf-2::Tn10MGN803 MGN617(pMEG226)本研究MGN1142MGN617(pMEG315)本研究鼠傷寒沙門氏菌χ3761 UK-1，野生型R.CurtissⅢMGN394 Δcya-27Δcrp-28P.SundaramMGN431 Δcya-27Δcrp-28, Mot+P.SundaramMGN510 ΔphoP22 pMEG113整合體 P.SundaramMGN806 x3761 pMEG226整合體本研究MGN807 Δcya-28::rfb078 本研究MGN868 Δcya-28∷rfb078 Δcrp-28 本研究
MGN996 Δcya-28::rfb078Δcrp-28,Mot+本研究MGN1175MGN431Δasd::xylE729(pYA292) 本研究MGN1180Δcya-28::rfb078Δcrp-28Δrfc,Mot+本研究MGN1181Δcya-28::rfb078Δcrp-28Δrfc,Mot+本研究MGN1182Δcya-28::rfb078Δcrp-28Δrfc,Mot+本研究MGN1183Δcya-28::rfb078Δcrp-28Δrfc,Mot+本研究MGN1184Δcya-27Δcrp-28Δffc,Mot+本研究MGN1185Δcya-27Δcrp-28Δrfc,Mot+本研究MGN1717MGN1180Δasd::xylE729本研究MGN1718MGN1717(pYA292) 本研究MGN1720MGN1717(pMEG287) 本研究質(zhì)粒pYA292 帶p15a ori,Ptrc啟動子Asd+的表達載體 R.CurtisspYA3255pYA3174(帶pSC101 ori Apr粘粒克隆載體) Brown等人.,Proc.
攜帶x7122的rfb Nat.Acad.Sci.USAVol.93第.11149-11154頁，1996pMEG055攜帶大腸桿菌衍生的iutA的pYA292 本研究pMEG113攜帶Δcrp-28、Tetr的pir-依賴性自殺載體，P.SundarampMEG219攜帶Δcya-27,Tetr,Kanr的pir-依賴性本研究“自殺”粘粒載體pMEG226攜帶x7122的rfb的pMEG219 本研究(Δcya-28::rfbO78)pMEG387攜帶大腸桿菌衍生的Ⅰ類菌毛的pYA292 本研究pMEG315攜帶Δrfc的pMEG149(pir-依賴性自殺質(zhì)粒， 本研究sacBR,Apr，由S.Tinge提供)從粘粒克隆pYA3255得到的078 rtb/rfc基因簇，含有插入到粘粒載體pYA3174的BamHⅠ克隆位點的APECx7122菌株的rfb區(qū)域(Brown等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:11149-11154,1996)。pYA3255的限制分析表明除側(cè)接于BamHⅠ克隆位點的兩個NotⅠ位點外，在克隆的x7122 DNA中還存在一個NotⅠ位點(Brown等人，同上)。因此，用NotⅠ部分消化粘粒pYA3255，并與NotⅠ/PvuⅡ消化的pMEG219連接，得到粘粒pMEG226，其具有APEC菌株x7122的rfb區(qū)域插入到粘粒pMEG219的Δcya-27等位基因中。然后用電穿孔將粘粒pMEG226引入到大腸桿菌株MGN617中，產(chǎn)生MGN803(表1)。菌株MGN617在asd基因中有一個缺失，導致需要補充二氨基庚二酸(DAP)(Schleifer等人，Bacteriol Rev.36:407-477,1972)，且因為它還攜帶有pir基因的一個拷貝，所以能支持pMEG226的復制(表1)。
為了將粘粒pMEG226引入到鼠傷寒沙門氏菌中，將大腸桿菌供體菌株MGN803與野生型UK-1鼠傷寒沙門氏菌x3761交配，方法是將每種菌株的50μl通氣過夜培養(yǎng)物點滴到LB瓊脂板上(Miller,H.,in Methods in Enzymology,Vol.152,第147頁，Berger,S.L.和Kimmel,A.R編輯，Academic Press,Inc.1978)，該瓊脂板含有200μg/ml DAP,37℃培養(yǎng)過夜。用無菌金屬圈從平板上刮下交配的混合物，懸浮于1ml BSG中。將細胞分散在含有10μg/ml四環(huán)素的LB板上，37℃培養(yǎng)過夜。接種在不含DAP的選擇性培養(yǎng)基上，進行針對供體菌株MGN803的反選擇。因為粘粒pMEG226在鼠傷寒沙門氏菌中不能復制，重組細胞獲得四環(huán)素抗性的唯一途徑是通過同源重組將該質(zhì)粒整合入染色體中。用抗078特異性抗血清，以玻片凝集法篩選產(chǎn)生078 LPS的耐四環(huán)素的反偶聯(lián)物，該抗血清獲自PennsylvaniaState University的大腸桿菌參品中心。37℃使一個耐四環(huán)素的O78+分離物(命名為MGN806)(表2)在LB肉湯中穩(wěn)定生長過夜，接種到鐮孢菌酸培養(yǎng)基(Bochner等人，J.Bacteriol.243:926-933,1980)上，進行針對整合質(zhì)粒的反選擇。篩選出丟失四環(huán)素抗性的耐鐮孢菌酸菌落以及MacConkey麥芽糖培養(yǎng)基上的白色菌落。在該培養(yǎng)基上cya突變體是白色的，因為它們不能發(fā)酵麥芽糖(Botsford等人，同上)，而能發(fā)酵麥芽糖的野生型鼠傷寒沙門氏菌產(chǎn)生紅色的菌落。選出四環(huán)素敏感的、Cya-、O78+分離物，命名為MGN807(表1)。
為了在沙門氏菌crp基因中加入一個缺失，用上述菌株MGN510(表1)上生長的P22噬菌體轉(zhuǎn)導菌株MGN807(Maloy,S.R.,Experimental Techniques inbacterial genetics,Jones and Bartlett,Boston,1990)。MGN510已被整合入其染色體，質(zhì)粒pMEG113(表1)是pir-依賴性、耐四環(huán)素的自殺載體，含有帶一明確缺失突變的鼠傷寒沙門氏菌crp基因。在含有10μg/ml四環(huán)素的LB平板上選擇轉(zhuǎn)導子。選出一個轉(zhuǎn)導子，接種在鐮孢菌酸培養(yǎng)基上。通過在含有2mM cAMP的MacConkey麥芽糖平板上劃線，篩選出Crp-表型的耐鐮孢菌酸分離物。在該培養(yǎng)基上，Cya-、Crp+菌株是紅色的，而Cya-、Crp-菌株是白色的。將一個Δcya::rfbO78Δcrp分離物命名為MGN868。
由于ΔcyaΔcrp菌株是不能動的(Yokota等人，J.Bacteriol.103:513-516,1970)，而且因為已知抗鞭毛抗體能保護動物抵抗鼠傷寒沙門氏菌(Yokoyama等人，Vaccine 16:388-393,1998)，將MGN868通過一個裝滿流動瓊脂(Difco)的流動管傳代(Holt等人，Enrichment and Isolation,in Methods for General andMolecular Bacteriology,Gerhardt等人編輯.，第222頁，Am.Soc.for Microbiol.,Washington,D.C.)，產(chǎn)生MGN868的能動變體，命名為MGN996(表1)。
如下用SDS-PAGE和Western印跡法檢驗MGN807、MGN868和MGN996表達的LPS。將這些菌株各自的細胞，以及分別作為O78 LPS和鼠傷寒沙門氏菌B群LPS對照的x7122和MGN431的細胞(表1)在LB肉湯中培養(yǎng)過夜。將細胞調(diào)節(jié)到OD600當量，離心沉淀1ml每種培養(yǎng)物。用Hitchcock和Brown(J.Bacteriol.154:269-277,1983)的方法從沉淀細胞制備LPS。將樣品在雙份12.5％聚丙烯酰胺凝膠上跑電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，用抗B群特異性抗血清(Difco)或抗O78特異性抗血清探測(如ELC Western Blotting Protocols，第16-17頁，Amersham LifeScience,1997中所述)。圖2顯示了結(jié)果。
如預期的，從大腸桿菌x7122株分離的LPS不與抗B群抗體(圖2A)反應，但與抗O78抗體(圖2B)反應。類似地，鼠傷寒沙門氏菌對照菌株MGN431(cya-27crp-28,Mot+)產(chǎn)生的LPS，與抗B群抗體(圖2A)反應但不與抗078抗體(圖2B)反應。然而，從重組鼠傷寒沙門氏菌株MGN807、MGN868和MGN996分離的LPS與這兩種抗體均反應(圖2A、2B)，產(chǎn)生了梯級圖形不同的高分子量條帶，表明這些菌株表達了鼠傷寒沙門氏菌B群和大腸桿菌O78 O抗原(連接于沙門氏菌核心)。該重組沙門氏菌株表達了高分子量O78 LPS也表明，在質(zhì)粒pYA3255中克隆的x7122rfb區(qū)域也含有x7122的rfc基因。
在重組鼠傷寒沙門氏菌中表達的O78 LPS的平均鏈長與在同一菌株中表達的B群LPS的平均鏈長大約相同(與圖3A和3B中的MGN807、MGN868和MGN996泳道相比)，而在x7122中表達的O78的鏈長則較短(圖3B)。已知該基因的產(chǎn)物能調(diào)節(jié)LPS的鏈長，并被不同研究組分別命名為cld(Bastin等人，Mol.Microbiol.7:724-734,1993；Bastin等人，Mol.Microbiol.5:2223-2231,1991)、rol(Batchelor等人，J.Bacteriol.174:5528-5236,1992；Batchelor等人，J.Bacteril.173:5699-5704,1991)和最近被命名為wzz(Reeves等人,Trends Microbiol.4:495-503,1996)。有可能通過鼠傷寒沙門氏菌wzz基因來測定重組鼠傷寒沙門氏菌株MGN807、MGN868、和MGN996中的O78鏈長。
實施例2
本實施例說明鼠傷寒沙門氏菌株MGN996(Δcya-28::rfbO78,Δcrp-28,Mot+)在小雞中定居和保護它們抵抗野生型APEC菌株x7122攻擊的能力。
在實施例2-4所述實驗中所用的所有小雞都是從Specific Pathogen Free AvianServices(SPAFAS,Roanoke,IL)得到的無特異性病原體(SPF)雞的受精蛋孵化的白色來亨雞。在華盛頓大學(St.Louis,MO)的生物學院的Humidaire培養(yǎng)箱/孵化器中培養(yǎng)和孵化這些蛋。
在本實驗中疫苗接種禽類2次第一次在孵化日，然后再在14日齡時。在孵化日通過粗噴淋用4.6×106CFU/雞的MGN996接種小雞。將10-15只小雞置于Plexiglas噴淋箱中，用加壓到100psi的不銹鋼Sure Shot Model A噴霧器(Milwaukee Sprayer Manufacturing Co.,Inc.,Milwaukee,WI)送遞接種物進行粗噴淋疫苗接種。事先進行演習實驗以確定送遞0.3ml/雞的適合條件。用MGN966疫苗接種26只小雞，用BSG模擬疫苗接種12只小雞。孵化日接種后，將小雞轉(zhuǎn)移到Horsfall隔離器中，給予食物并任意飲水(在孵化疫苗接種后)。
在第10日，隨機從疫苗接種組選擇3只小雞，吸入CO2致死，然后立即檢驗禽體以評估(細菌)定居情況。從每只小雞采集肺、肝、脾、法氏囊和盲腸內(nèi)含物樣品，分別置于Stomacher袋中，在每個樣品中加入5ml BSG。在SewardStomacher 80 Laboratory Blender中勻漿化組織。然后將脾、肝和肺0.1ml勻漿化的樣品置于補充有1％麥芽糖的MacConkey瓊脂基底上(Difco)或?qū)⒎ㄊ夏覙悠泛兔つc內(nèi)含物的勻漿化樣品置于含有35μg/ml新生霉素的亮綠瓊脂上。37℃培養(yǎng)這些平板過夜。進一步分析每個平板的至少一個典型菌落作，以驗證玻片凝集法測定的相應LPS類型的表達。對于直接接種未獲得菌落的情況，在4.5ml Hajna肉湯中加入0.5ml勻漿化組織，42℃培養(yǎng)過夜作為二次富集。將一環(huán)Hajna-富集的培養(yǎng)物劃樣到亮綠瓊脂上，37℃培養(yǎng)過夜。在所有測試的組織樣品中發(fā)現(xiàn)了MGN996菌株。
在第14日，用連接于1ce針筒的送藥插管以口服管飼法，以3.8×107CFUMGN996(0.2ml體積)加強接種已接種過疫苗的小雞。在第28日，通過氣管內(nèi)途徑，用7.5×107CFU大腸桿菌x7122株(0.5ml)攻擊所有小雞，四天后以吸入CO2處死，然后解剖禽體。
對解剖的禽類作APEC感染相關(guān)病損的評分。在本實驗和實施例3-4所述的實驗中，用Wilcoxon-Mann-Whitney U檢驗(Zar,J.H.,Biostatistical Analysis,Prentice-Hall,Inc.,Englewood Cliffs)進行病損評分的分析。在本實驗中，用x2分析確定兩組間的差異(根據(jù)未顯示病損的禽(病損評分為1)數(shù)目)，下表2列出了結(jié)果。
表2．用APEC菌株x71221攻擊后，接種MGN996疫苗的與未接種疫苗的小雞的病損評分平均值。
1如下進行小雞的評分1．活小雞，無病損2．活小雞，云斑(cloudy)狀肺泡3．活小雞，僅有一種類型病損(如肝周炎)4．活小雞，有多處病損5．死亡或瀕死小雞，帶有大腸桿菌病典型病損(肝周炎、心包炎、肺泡炎、嚴重脫水)。
2與b有差異(p=0.0157)此病損評分的平均值表明，與未接種疫苗的對照小雞相比，接種MGN996疫苗的小雞明顯受到保護抵抗了攻擊(x2=5.3,p=0.02)。此外，疫苗接種組顯示出總病損評分平均值明顯降低。這些結(jié)果表明由表達B群O抗原的減毒鼠傷寒沙門氏菌送遞的大腸桿菌LPS向小雞提供了顯著的抵抗野生型大腸桿菌攻擊的保護作用。
實施例3本實施例說明除去沙門氏菌O抗原的表達對疫苗菌在各種小雞組織中定居能力的影響。
為了消去重組鼠傷寒沙門氏菌疫苗菌株的B群O抗原的表達，在MGN996(Δcya::O78Δcrp；表1)和MGN431(明確的ΔcyaΔcrp缺失對照菌株，表1)的沙門氏菌rfc基因中制作了一個明確的缺失。將菌株MGN996或MGN431與實施例1中所述的MGN1142(涉及氨芐青霉素抗性的選擇)交配(表1)。MGN1142含有攜帶鼠傷寒沙門氏菌突變rfc基因的pir-依賴性自殺載體。在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB肉湯中培養(yǎng)每個交配的反偶聯(lián)物過夜，接種于補充有5％蔗糖、缺NaCl的LB瓊脂平板上，室溫培養(yǎng)48小時。用針對P22噬菌體的交叉劃樣篩選出Rfc表型的分離物。如上述，在該試驗中鼠傷寒沙門氏菌O抗原聚合酶缺陷的突變株耐P22，而表達功能性鼠傷寒沙門氏菌O抗原聚合酶的分離物對P22是敏感的。
得到幾個獨立的ΔrfcSt(表示鼠傷寒沙門氏菌rfc基因)分離物，命名為MGN1180、MGN1181、MGN1182和MGN1183(都是從MGN996衍生的)；和菌株MGN1184和MGN1185(從ΔcyaΔcrp鼠傷寒沙門氏菌株MGN431衍生的)。見表1。分離由這些菌株產(chǎn)生的LPS，并如實施例1所述用Western印跡法作B群和O78 O抗原分析，結(jié)果顯示于圖3。
如所預期的，由ΔcyaΔcrp對照菌株MGN431和其ΔrfcSt衍生物MGN1184和MGN1185產(chǎn)生的LPS與抗B群LPS抗體反應(圖4A)，而不與抗O78 LPS抗體反應(圖4B)。但用抗B群LPS抗體探測時，ΔrfcSt菌株分離出的LPS僅產(chǎn)生低分子量條帶，表明它們不表達B群全長LPS。當用抗O78 LPS抗體探測時，MGN996和其ΔrfcSt衍生菌株(MGN1180、MGN1181、MGN1182和MGN1183)產(chǎn)生的LPS得到完整O78大腸桿菌O抗原的圖形(圖4B)。菌株MGN1180的O78特異性LPS圖形(圖4B)與MGN996的B群LPS鏈長(圖4A)相似，而MGN1181的O78特異性LPS圖形與野生型O78大腸桿菌株x7122中的O78 LPS圖形(圖4B)更相似。由于這兩個菌株具有明確相同的基因型(表1)，未預計到它們在LPS圖形上的差異。選擇MGN1180、MGN1181和MGN1184株作為可能的抗大腸桿菌x7122疫苗的進一步研究。
在孵化日，通過口腔管飼法用MGN996(6.9×107CFU/雞)、MGN1180(4.0×107CFU/雞)、MGN1181(2.4×107CFU/雞)、MGN1184(1.3×107CFU/雞)、或MGN431(7.8×107CFU/雞)接種小雞，每種菌株接種10只小雞。將接種疫苗的小雞置于隔離器中，如上述在第10日解剖禽體。如實施例2所述，收集肺、肝、脾、法氏囊和盲腸內(nèi)含物的樣品，加工并作細菌定居分析，下表3列出了結(jié)果。
表3．重組ΔcyaΔcrpΔrfc鼠傷寒沙門氏菌候選疫苗和對照菌株在小雞中的定居(％小雞陽性)
這些結(jié)果表明所有測試的ΔrfecSt菌株(除MGN1184外)都能大百分比的定居于禽類的肺、脾、肝、法氏囊和盲腸中。發(fā)現(xiàn)像對照菌株MGN431和MGN996一樣，菌株MGN1180和MGN1181能定居在100％疫苗接種過的禽類的脾中。由于Δrfc突變菌株MGN1184為半粗糙表型。已有報導說LPS缺陷型鼠傷寒沙門氏菌株表現(xiàn)出在小雞中定居降低(Craven等人，Avian Dis.38:401-408,1994)。不能承受禽類與禽類間的變化，本試驗得到的結(jié)果與MGN1184的定居受到嚴重破壞的事實相一致，證實了完整LPS O抗原在定居中的作用。但在Rfc背景(MGN1180和MGN1181)中，與MGN1184相比，O78大腸桿菌O抗原的表達導致該菌在禽類中定居百分比的明顯增加，表明其可用于提高這些菌株抗大腸桿菌攻擊的保護能力。
實施例4本實施例說明表達O78大腸桿菌O抗原但不表達B群O抗原的重組鼠傷寒沙門氏菌株，對保護小雞抵抗O78 APEC菌株x7122感染所致疾病的有效性。
在孵化日，通過口腔管飼法用6.5×107CFU MGN996(Δcya-28::rfbO78Δcrp-28,Mot+)或7.7×107CFU MGN1180(Δcya-28::rfbO78Δcrp-28Δrfc,Mot+)，接種小雞，每種菌株接種35只小雞。用BSG模擬接種20只小雞。在第10日如實施例2所述，解剖每個接種組的5只小雞，作細菌定居評估。定居結(jié)果與實施例2中的類似(未顯示數(shù)據(jù))。在第14日，用7.4×107CFU MGN996加強免疫先前用MGN996接種的小雞，用6.4×107CFU MGN1180加強免疫先前用MGN1180接種的小雞。在第24日將所有禽類作腿部繃帶標記。為了評估疫苗接種后血清抗體應答，在第27日翅靜脈穿刺采集半數(shù)小雞的血清，在第28日收集另一半小雞的血清。第30日攻擊每組一半小雞，第31日攻擊其余一半小雞。攻擊的劑量為9.6×107CFU大腸桿菌株x7122。采血前死去了兩只對照小雞，因此只有18只對照小雞可采血和攻擊。攻擊后4天如實施例2所述，進行全部小雞解剖評估x7122的定居，還收集心血。在所有小雞中均分離到攻擊菌株，但用MGN996或MGN1180疫苗接種的小雞中僅在盲腸中發(fā)現(xiàn)攻擊菌株。將兩天小雞解剖得到的病損評分數(shù)據(jù)合并分析，下表4顯示了結(jié)果。
表4．用APEC菌株x7122攻擊后，用鼠傷寒沙門氏菌株MGN996、MGN1180疫苗接種的小雞或未疫苗接種的小雞的平均病損評分。
如表2所述確定病損評分。
1與b的差異，p=0.0064與c的差異，p＜0.0001這些結(jié)果證實菌株MGN996的有效性，表明MGN1180可能是一種優(yōu)秀的大腸桿菌疫苗，因為用MGN1180疫苗接種的小雞的平均病損評分比用MGN996疫苗接種的小雞平均病損評分低，雖然這兩者的差異不明顯(p=0.08)。
用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)評估每只小雞的血清對大腸桿菌O78LPS和鼠傷寒沙門氏菌LPS的抗體應答。37℃用100μl的大腸桿菌LPS(Sigma)或鼠傷寒沙門氏菌LPS(Sigma)(用0.2％TCA(三氯乙酸；Sigma)配成2.5μg/ml)包被Immulon-Ⅰ平底板孔2小時(Hardy,1994)。包被后，用TBS(Tris緩沖鹽水)/0.1％Tween20溶液洗滌板3次。將稀釋的血清(1∶100)加入到一式二孔中，37℃培育板1小時。然后再用TBS/0.1％Tween20溶液洗滌板3次。加入1∶30,000稀釋的山羊抗雞IgG HRP偶聯(lián)抗體(KPL)檢測結(jié)合的IgG。用TBS/0.1％Tween20再次洗滌板以除去未結(jié)合的檢測抗體。洗滌后用溶于過硼酸鈉的磷酸-檸檬酸緩沖液中的OPD(二氫氯鄰苯二胺)片劑(Sigma)顯色。37℃15分鐘后，加入3N HCl終止反應。用BT2000 Microkinetics讀數(shù)儀(FisherBiotech)在490nm對板讀數(shù)。為了檢測結(jié)合的IgM和IgA，首先用1∶5稀釋的正常兔血清封閉板37℃45分鐘，然后用TBS/0.1％Tween20洗滌3次。封閉后，每孔中加入1∶5000稀釋的山羊抗雞IgM或IgA(Immunovision),37℃培育板45分鐘。用TBS/0.1％Tween 20洗滌3次除去了未結(jié)合的抗體，再每孔加入1∶5000稀釋的兔抗山羊IgG堿性磷酸偶聯(lián)抗體(Sigma)。37℃培育板45分鐘。除去未結(jié)合的偶聯(lián)抗體后，每孔中加入檢測步驟用的p-NPP(二乙醇胺配的P-硝基苯磷酸；Sigma底物溶液，37℃培育板30分鐘。然后加入3M NaOH終止反應，在405nm讀數(shù)。如果觀察到比0.2大的OD值，則認為該小雞為血清陽性。對照為事先從12只小雞采集的血樣和僅含偶聯(lián)抗體的孔。下表5和6列出了結(jié)果。
表5．攻擊之前和攻擊之后，078LPS血清陽性的百分比
表6．攻擊之前和攻擊之后，B群LPS血清陽性的百分比
攻擊前約50％用MGN996疫苗接種的小雞為O78特異性IgM抗體血清陽性，而只有20-30％小雞為特異性IgG和IgA抗體陽性。相反，攻擊前80％用RfcSt-菌株MGN1180疫苗接種的小雞為O78特異性IgM抗體陽性，57％和70％小雞分別為IgG和IgA O78特異性抗體血清陽性。這些結(jié)果表明用MGN1180疫苗接種比用RfcSt-菌株MGN996，產(chǎn)生的體液免疫應答更成熟。雖然攻擊之后兩組間血清轉(zhuǎn)化相似，用MGN1180疫苗接種小雞的IgA血清OD405陽性的值為85％(22/26)，比用MGN996疫苗接種小雞(僅42％,11/26)高0.5。模擬疫苗接種小雞的抗O78IgM血清陽性高百分比可能是因為記憶B細胞(能對O78 LPS制劑中存在的普通大腸桿菌抗原如LPS核心起反應)的重刺激造成的。如預期的那樣，MGN996疫苗接種比MGN1180疫苗接種，產(chǎn)生了對鼠傷寒沙門氏菌LPS更強的體液抗體應答，因為MGN1180產(chǎn)生的鼠傷寒沙門氏菌LPS僅有O抗原的一個單糖單元，其可能被O78 LPS掩蔽。這種推測的根據(jù)是觀察到，存在B群特異性抗血清時菌株MGN1180不凝集，而菌株MGN1184(ΔcyaΔcrpΔrfc)則凝集，雖然比表達完整LPS O抗原的鼠傷寒沙門氏菌株更弱。
總而言之，攻擊之前的強抗體應答與低病損評分之間強相關(guān)，雖然少數(shù)禽類沒有發(fā)動可檢測的攻擊之前的抗體應答(被保護的)，少數(shù)禽類發(fā)動了可推測的攻擊之前抗體應答，但作為未被保護記分。大多數(shù)接種MGN1180疫苗的小雞在攻擊之前為O78抗體血清陽性(24/30)，而MGN996組的少數(shù)小雞為血清陽性(17/30)。
實施例5本實施例說明用含有Asd+載體的重組疫苗鼠傷寒沙門氏菌株疫苗接種小雞，所述的Asd+載體可用于表達其它異源基因產(chǎn)物。
用電穿孔法將Asd+載體pYA292(表1)引入到MGN1717(表1)中，產(chǎn)生菌株MGN1718[(Δcya-28::rfbO78Δcrp-28ΔrfclΔasd∷xylE729)/pYA292,Mot+]。本實施例所用的小雞都是從Sunrise Farms(Catskill,NY)得到的無特異性病原體(SPF)雞的受精蛋孵化的。用BSG模擬疫苗接種20只小雞，通過上述的口腔管飼法在孵化日用5.6×107CFU MGN1718疫苗接種29只小雞。第14日，以口腔管飼法，用5.2×107CFU MGN1718加強免疫接種過疫苗的小雞，第28日如上述用5×107CFU x7122攻擊所有小雞。四天后，如上述處死小雞、解剖、并對病損評分，但用更靈敏的評分系統(tǒng)(在下表7中列出)，下表8列出了用該評分系統(tǒng)得到的平均病損評分。
表7對病損評分的方法肺泡(胸)正常 0輕度云斑和增厚 1中度云斑和增厚、伴有血清滲出和纖維蛋白斑點 2廣泛云斑和增厚伴有粘液或纖維蛋白化膿性滲出物 3心臟和心包正常 0混濁、心包腔中存在過量液體 1急性心包炎 2肝正常 0脫色和/或少量纖維素性滲出物 1
明顯的肝周炎 2細菌檢驗大腸桿菌重分離物將肺泡拭子樣品在BHI中培養(yǎng)后 1肺泡直接劃樣 2將心包液或心臟拭子樣品在BHI中培養(yǎng)后 1心包或心臟樣品直接劃樣 2肝拭子樣品在BHI中培養(yǎng)后 1肝直接劃樣 2每只小雞可能的最高分=13。
表8．x7122攻擊的平均病損評分
為了評估鼠傷寒沙門氏菌載體菌株是否提供抵抗APEC菌株攻擊的保護作用，用MGN1175(表1)進行了十分類似的實驗，從遺傳角度而言MGN1175與MGN1718十分類似，但缺少O78 rfb基因簇。下表9列出了用7.5×107CFU x7122攻擊后，模擬接種的對照或疫苗接種的小雞的平均病損評分。
表9 x7122攻擊的平均病損評分
疫苗接種小雞的平均病損評分與模擬疫苗接種對照小雞的沒有明顯差異。這一結(jié)果表明重組鼠傷寒沙門氏菌疫苗株MGN1718和MGN1180菌株提供的抵抗APEC x7122的保護作用是由于表達了O78大腸桿菌的O-抗原。
實施例6本實施例說明了還表達O1:K1:H7 APEC菌株的菌毛操縱子的O78疫苗菌株的構(gòu)建及其效力。
菌毛操縱子是與PAEC菌株毒力相關(guān)的細胞表面結(jié)構(gòu)(Dozios等人，Infect.Immun.60:2648-2656,1992；Dozios等人,Avian Dis,38:231-239,1994；Wooley等人，Av.Dis,36:679-684,1992)，具體地說，已顯示了Ⅰ型菌毛對禽致病性大腸桿菌(APEC)菌株定居于禽類氣管上皮細胞的重要性(Gyimah等人，Avian Dis,32:74-78,1988)。已從O1:K1:H7 APEC分離物中克隆了參與形成Ⅰ型菌毛的基因，并將其插入到Asd+質(zhì)粒載體(pYA292)中，并組成型表達。圖4顯示了所得質(zhì)粒pMEG287的遺傳學圖。將質(zhì)粒pMEG287引入到重組鼠傷寒沙門氏菌MGN1717(表1)中得到MGN1720([Δcya-28:rfb O78Δcrp-28ΔrfclΔasd::xylE729]/pYA292,Mot+)。以酵母凝集試驗(Korhonen,TK.,FEMS Microbiol,Lett.6:421-425,1979),37℃通氣培養(yǎng)過夜，證明在MGN1720菌株中有Ⅰ型菌毛的表達。如預計的Ⅰ型菌毛的凝集是甘露糖敏感性的，而對照菌株MGN1718不能凝集酵母細胞。雖然野生型鼠傷寒沙門氏菌株表達Ⅰ型菌毛，菌株MGN1718得到的結(jié)果與Ⅰ型菌毛的表達受ΔcyaΔcrp調(diào)節(jié)的事實相一致，因此在Cya-Crp-菌株中表達很差(Saier等人，J.Bacteriol.134:356-358,1978)且37℃僅在靜置培養(yǎng)的兩天后表達。
如上述，用5×107CFU劑量攻擊，評估小雞中MGN1718和MGN1720菌株的效力，表10列出了實驗結(jié)果。
表10．x7122攻擊的平均病損評分
p＜0.00011與b有差異(p＜0.0001)這些結(jié)果顯示雖然統(tǒng)計學顯著性不大，但添加Ⅰ型菌毛導致較低的病損評分。雖然將Ⅰ型菌毛添加到疫苗菌株中不能提高抵抗O78攻擊的保護作用，但可提供抗其它APEC血清型的交叉保護作用。
其它可用的菌毛是P型菌毛，包括F11，其與APEC菌株相關(guān)(van den Bosch,等人，Infect.Immun.61:800-806,1993)。
實施例7本實施例說明還表達大腸桿菌鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白的O78疫苗菌株的構(gòu)建。
清除鐵的能力是對病原體的一種重要的存活性狀，因為在動物宿主環(huán)境中鐵的獲得是有限的(Litwin等人,Clin.Microbiol.Rev.6:509-518,1993；Peighambari等人，Avian Dis.39:116-124,1995)。一些鐵應答性基因編碼外膜蛋白(OMPs)，其中大部分作為細菌或宿主產(chǎn)生的鐵螯合化合物的受體(Bagg等人，Microbiol.Rev.51:509-518,1987)。
鐵調(diào)節(jié)OMPs是抗原性的并且在健康人、兔、小鼠和豚鼠中已測到是抗大腸桿菌鐵調(diào)節(jié)OMPs的抗體(Griffiths等人，Infect.Immun.47:808-813,1985)。產(chǎn)生的抗大腸桿菌鐵調(diào)節(jié)OMPs的抗體，能被動地保護火雞抵抗禽致病性O78大腸桿菌的攻擊(Bolin等人，Infect.Immun.55:1239-1242,1987)，表明這些蛋白是保護性抗原。
鐵應答性78-kDa OMP IutA是一優(yōu)良的候選疫苗抗原。IutA是氣桿菌素(aerobactin)和陰溝桿菌素(cloacin)的受體(Bagg等人，Microbiol.Rev.51:509-518,1987)。氣桿菌素的合成直接與人和哺乳動物(Litwin等人，Clin.Microbiol.Rev.6:509-518,1993；Payne,S.M.,Cdt,Rev.Microbiol.16:81-111,1988)以及家禽(Dho等人，Avian Dis.28:1016-1025,1984；Emery等人，Avian Dis.36:504-511,1992；Lafont等人，Infect.Immun.55:193-197,1987,Linggood等人，J.Gen.Microbil.133:835-842,1987；Wooley等人,Av.Dis,36:679-684,1992)中的大腸桿菌毒力相關(guān)。氣桿菌素是高親和性鐵攝取系統(tǒng)一個的成分(Bagg等人，Microbiol.Rev.51:509-518,1987)，可能是它在致病微生物中流行的原因。大量禽類大腸桿菌分離物的研究發(fā)現(xiàn)了80％以上病原性分離物能產(chǎn)生氣桿菌素(Dho等人，同上；Emery等人，同上；Lafont等人，同上；Yokoyama等人，同上)，而在非病原性菌株中則非常少見。合成氣桿菌素的基因最常見于ColV質(zhì)粒，并因此與大腸桿菌素V的產(chǎn)生密切相關(guān)(Bagg等人，同上)。
將得到的pColV-K30的一個IutA克隆作為質(zhì)粒pFS8(Krone等人，J.Bacteriol.153:716-721,1983)。將iutA基因從pFS8亞克隆到Asd+質(zhì)粒載體pYA292中，產(chǎn)生pMEG055(圖5)，并引入到鼠傷寒沙門氏菌株MGN055的Δasd衍生物中(圖5)。Western印跡的結(jié)果表明組成型表達了IutA蛋白質(zhì)，且該表達在L肉湯50次傳代中是穩(wěn)定的。
也可表達其它外膜蛋白，包括鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白、FepA、FecA、FhuA、FeeA和參與血清抗性的蛋白質(zhì)、Iss。
本說明書以上和以下引用的所有參考文獻全部納入作為參考。本文參考文獻中的討論都是總結(jié)它們的作者的見解，不保證參考文獻的準確性或恰當性，或任何參考文獻的專利性。
權(quán)利要求
1．一種用于疫苗接種禽類以抵抗禽致病性革蘭氏陰性(APG-N)微生物的疫苗，其特征在于，所述的疫苗包含表達APG-N微生物O抗原的重組沙門氏菌株的活細胞，所述的重組沙門氏菌株具有穩(wěn)定整合入沙門氏菌染色體的APG-N微生物的rfb/rfc基因簇，且在沙門氏菌的rfb基因簇或沙門氏菌rfc基因中有突變，所述的突變使沙門氏菌O抗原的表達失活，所述的重組沙門氏菌株是毒性沙門氏菌株的減毒突變株。
2．如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的APG-N微生物是禽致病性大腸桿菌(APEC)菌株。
3．如權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述的整合的APEC rfb/rfc基因簇包括沙門氏菌基因中的減毒突變，所述的基因選自pab、pur、aro、asd、dap、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cdt、cya、crp、phoP、phoQ、rfc、poxA和galU。
4．如權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述的減毒突變是沙門氏菌cya基因中明確的缺失/插入突變。
5．如權(quán)利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的重組沙門氏菌株在沙門氏菌crp基因中還有減毒突變。
6．如權(quán)利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述的APEC菌株為O1、O2、O35或O78血清型。
7．如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的重組沙門氏菌株還具有編碼所需基因產(chǎn)物的重組多核苷酸。
8．如權(quán)利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述的所需基因產(chǎn)物是禽致病性微生物的抗原。
9．如權(quán)利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述的禽致病性微生物是禽致病性大腸桿菌(APEC)菌株，所述的抗原是APEC菌株的菌毛或鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白質(zhì)。
10．一種免疫接種禽類以抵抗禽致病性革蘭氏陰性(APG-N)微生物的方法，其特征在于，所述的方法包括給予禽類免疫有效劑量的疫苗，所述的疫苗包含表達APG-N微生物O抗原的重組沙門氏菌株的活細胞，所述的重組沙門氏菌株具有穩(wěn)定整合入沙門氏菌染色體的APG-N微生物的rfb/rfc基因簇，且在該沙門氏菌的rfb基因簇或沙門氏菌rfc基因中有突變，所述的突變使沙門氏菌O抗原的表達失活，所述的重組沙門氏菌株是毒性沙門氏菌株的減毒突變株。
11．如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述的APG-N微生物是禽致病性大腸桿(APEC)菌株。
12．如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述的整合的APEC rfb/rfc基因簇包括在沙門氏菌的基因中的減毒突變，所述的基因選自pab、pur、aro、asd、dap、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cdt、cya、crp、phoP、phoQ、rfc、poxA和galU。
13．如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述的減毒突變是在沙門氏菌cya基因中明確的缺失/插入突變。
14．如權(quán)利要求13所述的疫苗，其特征在于，所述的重組沙門氏菌株在沙門氏菌crp基因中還有減毒突變。
15．如權(quán)利要求14所述的疫苗，其特征在于，所述的APEC菌株為O1、O2、O35或O78血清型。
16．如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述的重組沙門氏菌還具有一個編碼所需基因產(chǎn)物的重組多核苷酸。
17．如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述的禽類是雞或火雞。
18．如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述的疫苗是在孵化日以粗噴淋給予的。
19．如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括口服給予禽類加強量的疫苗。
20．如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述的加強量疫苗是在孵化日后的第13、14或15天給予的。
21．一種用于疫苗接種禽類以抵抗至少兩種禽致病性革蘭氏陰性(APG-N)微生物的疫苗，其特征在于，所述的疫苗包含兩種重組沙門氏菌株的活細胞混合液，第一種重組沙門氏菌株具有整合入沙門氏菌染色體的第一種APG-N微生物的rfb/rfc基因簇，并表達第一種APG-N微生物的O-抗原，第二種重組沙門氏菌株具有整合入沙門氏菌染色體的第二種APG-N微生物的rfb/rfc基因簇，并表達第二種APG-N微生物的O-抗原，其中所述的第一和第二種重組沙門氏菌株在沙門氏菌rfb基因簇中或沙門氏菌rfc基因中有突變，從而使沙門氏菌O-抗原的表達失活，且所述的第一和第二種重組沙門氏菌株都是毒性沙門氏菌株的減毒突變株。
22．一種用于疫苗接種禽類以抵抗至少兩種禽致病性革蘭氏陰性(APG-N)微生物的疫苗，其特征在于，所述的疫苗包含表達每種APG-N微生物O抗原的重組沙門氏菌株的活細胞，所述的重組沙門氏菌株具有穩(wěn)定整合入沙門氏菌染色體的每種APG-N微生物的rfb/rfc基因簇，且在該沙門氏菌的rfb基因簇或沙門氏菌rfc基因中有突變，所述的突變使沙門氏菌O抗原的表達失活，所述的重組沙門氏菌株是毒性沙門氏菌株的減毒突變株。
23．一種制造用于免疫接種禽類以抵抗禽致病性革蘭氏陰性(APG-N)微生物的疫苗的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)選擇能在禽類中定居的沙門氏菌；(b)將APG-N微生物的rfb/rfc基因簇整合入沙門氏菌的染色體中；(c)在沙門氏菌rfb基因簇和/或沙門氏菌rfc基因中引入突變；和(d)分離出表達APEC菌株特征性O-抗原但不表達沙門氏菌O-抗原的重組沙門氏菌，其中步驟(b)和(c)可以任何順序進行。
24．如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述選定的沙門氏菌株是毒性沙門氏菌株的減毒突變株。
25．如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述選定的沙門氏菌株是毒性沙門氏菌株，所述的方法還包括在該毒性沙門氏菌株的基因中引入減毒突變，所述的基因選自pab、pur、aro、asd、dap、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cdt、cya、crp、phoP、phoQ、rfc、poxA和galU，然后將分離出與毒性沙門氏菌株相比的減毒突變株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種保護家禽抵抗禽致病性革蘭氏陰性微生物感染的疫苗。這種疫苗是一種重組沙門氏菌株,其表達對家禽是致病的,禽致病性革蘭氏陰性微生物如大腸桿菌的O抗原。這種重組沙門氏菌株不表達沙門氏菌O抗原。還公開了用這種疫苗對禽類疫苗接種的方法。
文檔編號A61P31/00GK1315871SQ99810045
公開日2001年10月3日 申請日期1999年7月13日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月24日
發(fā)明者K·L·羅蘭 申請人:梅根保健股份有限公司