專利名稱：白念珠菌減毒活菌疫苗、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體說是一種白念珠菌減毒活菌疫苗、制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
真菌大多屬條件性致病菌，臨床艾滋病的發(fā)生，侵襲性治療手段的發(fā)展及廣譜抗生素、腎上腺皮質(zhì)激素、細胞毒藥物、免疫抑制劑等長期不合理應(yīng)用導(dǎo)致了機體菌群失凋，抵抗力下降，這極大的增加了真菌感染率的發(fā)生，而深部真菌感染致死率極高。國內(nèi)外臨床統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)醫(yī)院深部真菌感染是由念珠菌引起的，其中白念珠菌構(gòu)成比最高。機體抗白念珠菌的感染是一個復(fù)雜的過程，包括非特異性免疫和特異性免疫，后者又分為細胞免疫和體液免疫。證實細胞免疫在抗白念珠菌感染中處于主導(dǎo)地位，體液免疫在抗白念珠菌感染中的作用至今仍持有不同觀點。真菌疫苗有減毒活疫苗，即由減毒的活白念珠菌組成，可在自然狀態(tài)下發(fā)生或在實驗室中通過敲除一個或多個致病力相關(guān)重要基因產(chǎn)生。它能夠模仿自然感染過程感染細胞、復(fù)制。其結(jié)構(gòu)與野毒株最相似，因此白念珠菌成分可以與自然感染相同的方式傳遞給免疫細胞并被處理。其接種過程與自然的亞臨床感染相似，通常只需要一兩次免疫，就能夠全方位調(diào)動機體的免疫應(yīng)答。人們在動物模型中已經(jīng)開展了深入的研究，研究減毒活疫苗的保護機制、研究通過基因重組技術(shù)選擇性地去除編碼毒力的基因來設(shè)計疫苗、發(fā)展新的動物模型闡明保護機制和致病性等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種白念珠菌減毒活菌疫苗、制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提出的白念珠菌減毒活菌疫苗，為含有白念珠菌GPI7全基因缺失菌株的白念珠菌活菌株，所述GPI7全基因缺失菌株通過基因工程技術(shù)將GPI7基因敲除得到。

GPI錨定蛋白是白念珠菌細胞壁的重要組成部分，白念珠菌細胞壁GPI錨定蛋白的缺失將導(dǎo)致其細胞壁不完整，從而使其毒力減弱，抗原暴露。而GPI錨定蛋白需要GPI錨的參與介導(dǎo)其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的糖基化、脂質(zhì)重塑等修飾，并轉(zhuǎn)運至細胞壁。白念珠菌GPI7是GPI錨合成通路中的重要基因之一，該基因功能主要是將磷酸乙醇胺脫水縮合至GPI錨第三個甘露糖的6位羥基上，而第三個甘露糖上的磷酸乙醇胺中的氨基是GPI錨定蛋白的結(jié)合位點。因此GPI7基因的缺失將影響磷酸乙醇胺的接入，從而影響下游GPI錨定蛋白的識別結(jié)合，使得白念珠菌細胞壁缺失，導(dǎo)致其毒力下降，并伴隨抗原暴露。通過基因工程技術(shù)將GPI7基因敲除得到沿7i7/斯i7基因缺失菌，電鏡觀察沿7i7/斯i7基因缺失菌細胞壁結(jié)構(gòu)不完整。體內(nèi)毒力實驗和主動免疫保護實驗證明，斯i7/^7i7基因缺失菌毒力下降，并能夠介導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫保護作用。本發(fā)明提出的白念珠菌減毒活菌疫苗的制備方法，具體步驟如下:
(I)用融合 PCR 方法擴增出 GPI7up-his-GPI7down，GPI7up-leu-GPI7down 片段，PCR 產(chǎn)物純化后備用；其中:GPI7 up 上:TCTATGTGGGGGAGGTCAAA，
GPI7 up 下:cacggcgcgcctagcagcggTGTGTGGATGGGTCTGAAAA，
GPI7down 上:gtcagcggccgcatccctgcGGATCTCTGAAATGAGGTTGG，
GPI7 down 下:TGGATGGTGATGGTGAAGAA，
GP17 檢測 up: GGCATCAATTATTGGGCATT,
GP17 檢測 down: CTGCTGAAGCTGCAAGAGAA,
GPI7 orfl 上:TCACCACAGGAGGTACACCA,
GPI7 orfl 下:TCATCCCATGATCTCCCATT,
GPI7 orf2 上:TCTAGCCGTGATTGTGGTGT，
GPI7 orf2 下:TGCAAATGTTGGCACTAAGC，
GPI7 orf3 上:CCTGGTGGGTTGATTTCATT，
GPI7 orf3 下:ACCCCACCAAAAACACATTG ；
(2)將回收片段轉(zhuǎn)入白念珠菌SN152，通過兩次醋酸鋰法轉(zhuǎn)化，得到GPI7全基因缺失菌 株;
(3)提取基因缺失菌株基因組DNA，PCR鑒定。本發(fā)明提出的白念珠菌減毒活菌疫苗用于預(yù)防白念珠菌感染。本發(fā)明提出的白念珠菌減毒活菌疫苗具有以下優(yōu)點:一、制作工藝較簡單，只要缺失菌株構(gòu)建好后，可以大規(guī)模培養(yǎng)，成本低，周期短；二、真菌感染保護效果好、基本無毒性、安全性好。本發(fā)明采用基因工程方法構(gòu)建的GPI7全基因缺失菌株，基本無毒性，用其作為免疫抗原對C57BL/6 SPF級近交系小鼠進行免疫，并采用主動免疫保護實驗來評估該疫苗的保護性。實驗已證實該疫苗可用于抵抗不同濃度的白念珠菌系統(tǒng)性感染。


圖1表示了沿7i7/沿7i7基因缺失菌的PCR鑒定產(chǎn)物電泳圖:泳道1、9、17為marker,泳道2、3、4、5為驗證基因缺失菌的中插入的his, Ieu營養(yǎng)標記的上下游片段，長度分別為:1240bp、1522bp、1235bp和1412bp。泳道6、7、8為擴增GPI7基因開放閱讀框的片段，沿7/斯i7基因缺失菌無條帶出現(xiàn)，說明GPI7基因已被敲除。泳道10、
11、12、13為驗證親本菌株SN152的his，Ieu營養(yǎng)標記的上下游片段，其無條帶出現(xiàn)。泳道14、15、16為擴增GPI7基因開放閱讀框的片段，親本菌株SN152有條帶出現(xiàn)，長度分別為:416bp 、204bp 和 589bp。圖2表示了基因缺失菌株的體內(nèi)毒力實驗結(jié)果-.gpi7/gpi7缺失菌及親本菌SN152造成系統(tǒng)性真菌感染，結(jié)果顯示，親本菌SN152組小鼠于7天全部死亡，而沿7i7/斯i7缺失菌組小鼠30天內(nèi)沒有小鼠死亡并且狀態(tài)良好(圖2A)，腎臟荷菌量幾乎無(圖2B)。兩組動物的存活率及腎臟荷菌量均存在顯著差異(P〈0.0001)。圖3表示了斯i7/斯i7基因缺失菌株體內(nèi)毒力實驗的病理切片結(jié)果:PAS染色中，親本菌SN152組小鼠的腎臟可以清晰地看見大面積的病灶，可見白念珠菌菌絲，并伴隨明顯的中性粒細胞侵潤。而斯i7/^pi7基因缺失菌組沒有明顯的病灶結(jié)構(gòu)，也無可見菌絲。在HE染色中，親本菌SN152腎髓質(zhì)出現(xiàn)大范圍炎性病變，并伴大量中性粒細胞侵潤，炎癥反應(yīng)嚴重。而斯i7/^pi7基因缺失菌組腎組織并未出現(xiàn)異常，炎癥反應(yīng)輕微。圖4表示了沿7i7/斯i7基因缺失菌與親本菌株SN152的細胞壁電鏡比較'gpi7/斯i7基因缺失菌與親本菌SNHL相比，細胞壁不完整，細胞壁顯著變薄。圖5表示斯i7/沿7i7基因缺失菌主動免疫保護實驗結(jié)果:沿7i7/斯i7基因缺失菌和SN152紫外滅活菌組小鼠免疫一次，21天后，以白念珠菌SC5314感染小鼠，SN152組小鼠8天全部死亡，平均存活天數(shù)為5.7天。斯i7/沿7i7基因缺失菌的小鼠生存時間顯著延長，在感染后25天內(nèi)仍有80%的存活率(圖5A)。沿7i7/斯i7基因缺失菌和SN152紫外滅活菌免疫組小鼠免疫兩次后，以白念珠菌SC5314感染小鼠，SN152組小鼠平均存活天數(shù)為14天，沿7i7/沿7i7基因缺失菌組小鼠存活時間顯著延長，在50天內(nèi)能維持60%的生存率(圖5B)。圖6表示斯i7/沿7i7基因缺失菌主動免疫保護實驗小鼠的腎臟病理切片結(jié)果:在PAS染色中，對照組注射紫外滅活親本菌SN152，在白念珠菌SC5314的攻擊下腎臟出現(xiàn)白念珠菌菌絲侵襲的病灶。而免疫斯i7/斯i7基因缺失菌組小鼠沒有明顯的病灶結(jié)構(gòu)，也無可見菌絲。在HE染色中，SN152組小鼠在SC5314的攻擊下腎髓質(zhì)出現(xiàn)大范圍炎性病變，并伴大量中性粒細胞侵潤，炎癥反應(yīng)嚴重。而斯i7/^pi7基因缺失菌組腎組織并未出現(xiàn)異常。
具體實施例方式以下所列實施例，僅為幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1.缺失菌gpi7/gpi7的構(gòu)建:
(I)材料:基因組DNA抽提試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA純化試劑盒購于北京天根基因科技有限公司，rTaq、exTaq、dNTP等購于Takara公司。96weIIsPCR儀購于B10-RAD公司。(2)實驗試·劑配制:
1.PBS緩沖液
NaCl 8.0g, KCl 0.4g, Na2HPO4.1ffi2O 3.48g, KH2PO40.2g，調(diào)節(jié) PH 至 7.4，加三蒸水至IOOOml，溶解后分裝，高壓滅菌后于4°C保存?zhèn)溆谩?.沙堡葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基(SDA)
蛋白胨10g，葡萄糖40g，瓊脂18g，加三蒸水900ml充分攪拌溶解，定容至IOOOml，高壓滅菌(12rC，15min)后于4°C保存?zhèn)溆谩?.人工合成完全氛基酸培養(yǎng)基(synthetic complete medium, SC)
酵母氮源6.7g,葡萄糖20g,氨基酸混合物1(見Tablel-2.)1.05g,補充組氨酸(20 μ g/ml)、亮氨酸(60 μ g/ml)及精氨酸(40 μ g/ml)。加三蒸水900ml充分攪拌溶解，定容至1000ml，高壓滅菌(12rC，15min)后于4°C保存?zhèn)溆谩９腆w培養(yǎng)基在高壓滅菌前加入瓊脂20g，滅菌后冷卻至50°C左右于超凈臺中倒入無菌培養(yǎng)皿，冷卻凝固后于4°C保存。Tablel.缺三種氨基酸組氨酸(HIS)、亮氨酸(LEU)、精氨酸(ARG)的SC培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.一種白念珠菌減毒活菌疫苗，其特征在于為含有白念珠菌GPI7全基因缺失菌株的白念珠菌活菌株，所述GPI7全基因缺失菌株通過基因工程技術(shù)將GPI7基因敲除得到。
2.一種如權(quán)利要求I所述的白念珠菌減毒活菌疫苗的制備方法，其特征在于具體步驟如下(1)用融合PCR 方法擴增出 GP17up-hi s_GP17down，GP17up_l eu_GP17down 片段，PCR 產(chǎn)物純化后備用；其中GP17 up 上TCTATGTGGGGGAGGTCAAA， GPI7 up 下cacggcgcgcctagcagcggTGTGTGGATGGGTCTGAAAA， GPI7down 上gtcagcggccgcatccctgcGGATCTCTGAAATGAGGTTGG， GP17 down 下TGGATGGTGATGGTGAAGM， GP17 檢測 up GGCATCAATTATTGGGCATT, GP17 檢測 down CTGCTGAAGCTGCAAGAGAA, GPI7 orfl 上TCACCACAGGAGGTACACCA, GPI7 orfl 下TCATCCCATGATCTCCCATT, GPI7 orf2 上TCTAGCCGTGATTGTGGTGT， GPI7 orf2 下TGCAAATGTTGGCACTAAGC， GPI7 orf3 上CCTGGTGGGTTGATTTCATT， GPI7 orf3 下ACCCCACCAAAAACACATTG ； (2)將回收片段轉(zhuǎn)入白念珠菌SN152，通過兩次醋酸鋰法轉(zhuǎn)化，得到GPI7全基因缺失菌株; (3)提取基因缺失菌株基因組DNA，PCR鑒定。
3.—種如權(quán)利要求I所述的白念珠菌減毒活菌疫苗用于預(yù)防白念珠菌感染。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防白念珠菌感染的白念珠菌減毒活菌疫苗、制備方法及其應(yīng)用，該疫苗為含有白念珠菌GPI7全基因功能缺失的白念珠菌菌株，能夠有效預(yù)防白念珠菌感染，并延長白念珠菌感染存活率，故可用于制備預(yù)防白念珠菌感染的減毒活菌疫苗。
文檔編號A61K39/02GK103251939SQ20131017683
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月14日
發(fā)明者安毛毛, 陳思敏, 劉偉, 慎慧, 張石群, 黃鑫, 徐國彤, 姜遠英 申請人:同濟大學(xué)