專利名稱：尿激酶和血管形成的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
尿激酶是一種與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、新生血管化和其它活性有關(guān)的酶。本發(fā)明的一個目的是提供新穎化合物，其作為尿激酶抑制劑是有活性的，能被用來抑制尿激酶的活性，從而弱化其有害作用。本發(fā)明的另一個目的是提供新穎化合物，其抑制血管形成，尤其是與病理情況有關(guān)的血管形成。
背景技術(shù)：
及介紹尿型纖溶酶激活物(uPA；尿激酶)是胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶家族中的絲氨酸蛋白酶。在其生理學狀態(tài)下，發(fā)現(xiàn)uPA有三種形式單鏈前-uPA、雙鏈uPA、和低分子量uPA(缺少N-末端功能域)。通過切開K158-1159處的肽鍵，將酶原前-uPA轉(zhuǎn)化成u-PA。得到的雙鏈uPA通過二硫鍵連接，具有約50kD的分子量，和C-末端絲氨酸蛋白酶功能域。
與其受體uPAR結(jié)合后，uPA活性集中在細胞表面。uPAR是一種單鏈糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨定的膜受體。uPAR的N-末端92個氨基酸在與uPA和前-uPA結(jié)合中起到了支配作用。upA受體已定位在T-細胞、NK(細胞、單核細胞和中性粒細胞，以及血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞、角化細胞、胎盤滋養(yǎng)母細胞、肝細胞和各種腫瘤細胞上。
前-uPA轉(zhuǎn)化成uPA(主要發(fā)生在細胞表面的uPAR處)后，uPA將纖溶酶原活化纖溶酶。對于人纖溶酶原，活化發(fā)生在PGR-VV殘基處的切割后，或?qū)τ谂＠w溶酶原，在殘基SGR-Ⅳ處。由于纖溶酶原也存在于細胞表面，該活化級連將uPA和纖溶酶活性集中在細胞膜上。纖溶酶具有許多功能，包括活化其它uPA和其它酶，消化纖維蛋白，和消化胞外基質(zhì)(ECM)的成分。消化腫瘤周圍的ECM除去了作為轉(zhuǎn)移細胞物理屏障的ECM，使這些細胞能自由脫離原發(fā)瘤并侵犯第二位點。在“癌癥轉(zhuǎn)移中的尿激酶型纖溶酶激活物系統(tǒng)綜述”，Andreasen等，Int.J.Can.72:1-22(1997)中提供了對uPA/uPAR系統(tǒng)在癌癥轉(zhuǎn)移中的作用。
在某些腫瘤，尤其是乳腺癌中已注意到在uPA高水平和轉(zhuǎn)移高水平，以及預后不良之間的關(guān)聯(lián)[Quax等，細胞生物學雜質(zhì)，115:191-199(1991)；Duffy等，癌癥研究，50:6827-6829(1990)]。例如，肺腫瘤[Oka等，癌癥研究，51:3522-3525(1991)]，膀胱腫瘤[Hasui等，Int.J.Cancer 50:871-873(1992)]，胃腫瘤[Nekarda等，柳葉刀，343:117(1994)]，子宮癌[Kobayashi等，癌癥研究54:6539-6548(1994)]，卵巢腫瘤[Kuhn等，Gynecol.Oncol.55:401-409(1994)]，腎臟腫瘤[Hofmann等，癌癥78:487-492(1996)]，腦腫瘤[Bindah]等，神經(jīng)癌雜志22:101-110(1994)]，和軟組織肉瘤[Choong等，Int.J.Cancer(Pred.Oncol.)69:268-272(1996)]已顯示了高水平的uPA和/或uPA活性，以及高水平的轉(zhuǎn)移。已報道uPA的過度產(chǎn)生導致體內(nèi)前列腺癌細胞的骨骼轉(zhuǎn)移增加[Achbarou等，癌癥研究，54:2372-2377(1994)]。
已顯示抑制或降低uPA活性，或中斷/抑制uPA和其受體(uPAR)之間的相互作用，對維持胞外基質(zhì)和對轉(zhuǎn)移的抑制作用有積極效果[Ossowski和Reich，細胞35:611-619(1983)；Ossowski，細胞52:321-328(1988)；Ossowski，細胞生物學107:2437-2445(1988)；Wilhelm等，臨床實驗轉(zhuǎn)移13:296-302(1995)；Achbarou等，癌癥研究54:2372-2377(1994)；Crowley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5021-5025(1993)；Kook等，EMBO J.13:3983-3991(1994)]。這些實驗研究的結(jié)果提示，uPA催化的纖溶酶原活化是腫瘤發(fā)展、局部腫瘤侵襲和/或遠端轉(zhuǎn)移形成的限速步驟[Andreasen等，Iht.J.Canc.72:1-22(1997)]。
據(jù)認為uPA系統(tǒng)對細胞遷移和侵襲的作用是由于纖溶酶介導的胞外基質(zhì)降解的蛋白酶解作用，以及更主要的是由于uPA受體與胞外基質(zhì)成分的直接作用引起的。胞外基質(zhì)的降解使得轉(zhuǎn)移細胞能侵入基質(zhì)，而uPA受體和基質(zhì)自身的相互作用幫助了細胞的遷移。uPA/纖溶酶系統(tǒng)在細胞表面上，或轉(zhuǎn)移細胞的前沿的定位，與uPA在轉(zhuǎn)移中的假定作用是一致的[Plesner等，干細胞15:398-408(1997)]。
uPAR與玻連蛋白(一種胞外基質(zhì)的成分)的相互作用，介導細胞黏著并在uPAR被uPA結(jié)合時，能被增強。細胞表面黏著分子整聯(lián)蛋白，看來也與該黏著作用有關(guān)，尤其是β-1和β-2整聯(lián)蛋白[Paysant等，Br.J.Haematol.100:45-51(1998)；Simon等，Blood 88:3185-3194(1996)]。CD11b/CD18整聯(lián)蛋白可與uPA-uPAR復合物結(jié)合，并促進帶有這些受體的細胞，如中性粒細胞、白細胞的黏著。
uPA/uPAR系統(tǒng)還與新脈管系統(tǒng)的建立、或新血管形成有關(guān)。
新脈管系統(tǒng)的建立是維持原發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤生長所必需的。病理性新血管形成也是視網(wǎng)膜疾病、風濕性關(guān)節(jié)炎、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病、炎癥疾病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、慢性眼色素膜炎、Fuch’s異色性虹膜睫狀體炎、新生血管性青光眼、角膜或視神經(jīng)新血管形成、血管病、翼狀胬肉、青光眼手術(shù)小泡衰竭、表皮角化病、瘢痕瘤和息肉形成的特征(見EP 451,130)。不需要的血管發(fā)生也會在下列條件下發(fā)生，或是下列作用的結(jié)果:黃斑部變性、早熟視網(wǎng)膜病、角膜移植排斥、晶狀體后纖維增生、流行性角膜結(jié)膜炎、維生素A缺乏、隱性眼睛配戴過久、上緣角膜炎、翼狀胬肉角膜炎干燥、斯耶格倫病(sogrens disease)、酒糟鼻性痤瘡、phylectenulosis、梅毒、除麻風外的分枝桿菌感染、脂類降解、化學消耗、細菌或真菌潰瘍、單純皰疹或帶狀皰疹感染、原生動物感染、Kaposi’s肉瘤、角膜侵蝕性潰瘍、Terrien’s邊緣降解、邊緣性角質(zhì)層分離、外傷、風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性狼瘡、多動脈炎、Wegeners伯克氏病、鞏膜炎(sleritis)、Steven’s Jobnson病、放射狀角膜切開術(shù)、鐮狀細胞血癥、肉樣瘤、彈性假黃瘤、Pagets病、靜脈或動脈閉合、頸動脈阻塞性疾病、Eales病、Bechets病、近視、視神經(jīng)陷凹、Stargarts病、扁平部睫狀體炎、慢性視網(wǎng)膜剝離、高粘稠度綜合征、弓形體病、激光后并發(fā)癥、維管組織異常增生、血管瘤、Osler-Wever-Rendu、實體瘤、造血骨骼腫瘤(blood borne tumor)、AIDS、眼球新生血管病、骨關(guān)節(jié)炎、慢性炎癥、Crohn’s病、潰瘍性結(jié)腸炎、橫紋肌肉瘤腫瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤腫瘤、Ewing肉瘤腫瘤、神經(jīng)母細胞瘤腫瘤、骨肉瘤腫瘤、白血病、牛皮癬、動脈粥樣硬化、類天皰瘡，如美國專利號5,712,291所述的。
曾提到一種uPA/uPAR結(jié)合拮抗劑(uPA的EGF-樣功能域融合到IgG的Fc上)抑制小鼠B16黑色素瘤的新生血管生成和生長。[Min等，癌癥研究56:2428-2433(1996)]。與該發(fā)現(xiàn)一致的是，在乳癌中注意到的微脈管密度、血管侵襲和uPA水平之間的關(guān)聯(lián)[Hildenbrand等，Brit.J.Cancer 72:818-823(1995)]。還提到已知的uPA抑制劑阿米洛利抑制各種新生血管形成的病理[Glaser等，EP 451,130；Avery等，Arch.Ophthalmol.108:1474-1476(1990)]。
uPA的主要生理學上的抑制劑有兩種，PAI-1和PAI-2，它們是蛋白酶抑制劑中絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的成員。絲氨酸蛋白酶抑制劑與其對應(yīng)蛋白酶的結(jié)合涉及各蛋白質(zhì)的氨基酸之間的大量相互作用，包括在絲氨酸蛋白酶抑制劑反應(yīng)環(huán)(對于PAI-1,Ser-Ala-Arg-Met-Ala(SEQ.ID.NO.1)，對于PAI-2,Thr-Gly-Arg-Thr-Gly(SEQ.ID.NO.2))中的那些。據(jù)報道將外源PAI-2引入實驗動物中抑制了肺轉(zhuǎn)移的速率[Evans和Lin,Amer.Surg.61:692-697(1995)；Mueller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:205-209(1995)]。PAI-1的抑制轉(zhuǎn)移作用還未一貫顯示。在Loskutoff等，美國專利號4,952,512中公開了PAI-1的基因及其重組表達的方法。在Stephens等，美國專利號5,422,090中公開了重組和天然人PAI-2。
被最廣泛研究的uPA抑制劑可能在4-取代苯并[b]噻吩-2-甲脒類的抑制劑中，其中B428(4-碘-苯并[b]噻吩-2-甲脒)和B623是其成員[Towle等，癌癥研究53:2553-2559(1993)；Brodges等，Bioorg.Med.Chem.1:403-410(1993)；Bridges等，美國專利號5,340,833]。曾提到在接種腫瘤細胞的實驗大鼠中輸入B428能抑制uPA基因表達，減小原發(fā)瘤體積和減少轉(zhuǎn)移[Xing等，癌癥研究57:3585-3593(1997)]。提到用B428或B623每日腹腔內(nèi)處理患腫瘤的小鼠能阻斷向肌肉和脂肪的轉(zhuǎn)移，但不能抑制腫瘤誘導的血管形成，或降低自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移的速率。事實上，B623增強肺轉(zhuǎn)移的形成(Alonso等，乳癌研究和治療，40:209-233(1996)]。在大鼠前列腺癌同系模型中輸入B428也能導致原發(fā)瘤體積和腫瘤重量的減小，和轉(zhuǎn)移的減少[Rabbani等，Int.J.Cancer.63:840-845(1995)]。其它已知的uPA抑制劑包括對氨基芐脒，它是uPA和阿米洛利的競爭性抑制劑。己顯示兩種化合物在實驗動物中都能減小腫瘤的尺寸[Jankan等，癌癥研究57:559-563(1997)；Billstrom等，Int.J.Cancer 61:542-547(1995)]。近來，報道了在綠茶中發(fā)現(xiàn)的一種多酚，表桔兒茶素-3沒食子酸(EGCG)能與uPA結(jié)合，并抑制其活性[Janlun等，自然387:561(1997)]。那些研究人員總結(jié)出，EGCG是一種比阿米洛利弱的uPA抑制劑，但提示EGCG能以比阿米洛利高得多的劑量消耗，而沒有毒性作用。Pye等，美國專利號4,165,258中公開了一種uPA的競爭性抑制劑，α-N-芐基磺酰基-對氨基苯丙氨酸。
其它抑制uPA/uPAR系統(tǒng)的方法包括開發(fā)一種雙功能雜交分子，由uPA的uPAR結(jié)合功能域和PAI-2構(gòu)成，曾提到其在體外抑制uPA并與uPAR結(jié)合[Ballance等，歐洲生物化學雜志207:177-183(1992)]。也已研究了uPAR的拮抗劑[Doyle和Rosenberg，美國專利號5,656,726；Min等，癌癥研究56:2428-2433(1996)]，如具有和uPA互補的反義寡核苷酸[Wilhelm等，臨床實驗轉(zhuǎn)移13:296-302(1995)；Iversen和Scholar，美國專利號5,552,390]。Dano等，美國專利號5,519,120中公開了針對uPAR，并提到抑制uPA和uPAR的結(jié)合的抗體。提到的抑制尿激酶，以及各種其它絲氨酸蛋白酶的小分子，包括Abe等在美國專利號5,508,385和美國專利號5,153,176中，和Takano等，在藥物學實驗治療雜志，271:1027-1033(1994)中公開的那些。
已開發(fā)了化合物來直接抑制uPA和uPAR的結(jié)合(Crowley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5021+5025(1993)；Goodson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:7129-7133(1994)；Kobayashi等，英國癌癥雜志67:537-544(1993)，和Int.L.Cancer 57:727-733(1994)，和生物化學雜志270:8361-8366(1995)；Lu等，F(xiàn)EBS通信356:56-59(1994)和FEBS通信380:21-24(1996))。
另外，前-肝細胞生長因子(HGF)，一種細胞遷移刺激蛋白，是uPA的底物[Naldinie等，EMBO J.11:4825-4833(1992)]。還已報道了一種66kDa胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)和纖連蛋白被uPA切開，提示了uPA在促使細胞遷移中更直接的作用[Quigley等，Proc.Natl.Acad.Sci.84:2776-2780(1987)]。因此，uPA的抑制也可影響這些作用。
發(fā)明簡述本發(fā)明針對新穎肽醛和酮酰胺化合物。這些肽醛化合物在P1具有精氨酸或精氨酸擬物。酮酰胺化合物在P1具有精氨酸酮酰胺基團。這些化合物具有尿激酶的強大抑制劑活性，并從而能用于減小其有害作用。本發(fā)明的化合物對抑制血管形成，特別是與病理過程有關(guān)的血管形成是有活性的。
因此在一個方面，本發(fā)明針對式(Ⅰ)的化合物 其中(a)X選自-S(O)2-、-N(R’)-S(O)2-、-(C=O)-、-OC(=O)-、-NH-C(=O)-、-P(O)(R’)-、和直接的化學鍵，其中R’分別是氫、1到約4個碳原子的烷基、約6到14個碳原子的芳基或約7到16個碳原子的芳烷基，條件是當X是-P(O)(R’)-時，R’不是氫；(b)R1選自(1)1到約12個碳原子的烷基，其可任選的被Y1取代，(2)1到約3個碳原子的烷基，被約5到8個碳原子的環(huán)烷基(其中可任選的被Y1、Y2和/或Y3在環(huán)上單-、二-或三取代)取代，
(3)3到約15個碳原子的環(huán)烷基，其在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3可任選的單-、二-、或三取代，(4)4到約10個環(huán)上原子的雜環(huán)烷基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮、和S(O)i，其中i是0、1或2，該雜環(huán)烷基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(5)4到約10個環(huán)上原子的雜環(huán)基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中i是0、1或2，包括 其中 是5到7個成員的雜環(huán)，具有3到6個環(huán)上碳原子，而V是-CH2-、-O-、-S(=O)-、-S(O)2-或-S-，其可任選在環(huán)上碳原子上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(6)可任選的被約5到8個碳原子的環(huán)烷基取代的，2到約6個碳原子的鏈烯基，其可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(7)約6到14個碳原子的芳基，其可任選被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(8)約5到14個環(huán)上原子的雜芳基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，所述雜芳基可任選被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(9)約7到15個碳原子的芳烷基，其可任選在芳環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(10)約5到14個環(huán)上原子的雜芳烷基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，而且其可任選的在烷基鏈上被羥基或鹵素取代，可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(11)約8到16個碳原子的芳烯基，其在芳環(huán)上可任選被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(12)約5到14個環(huán)上原子的雜芳烯基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，而且該雜芳烯基可任選在環(huán)上碳原子上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代， (17)約9到15個碳原子的稠合碳環(huán)烷基；(18)二氟甲基或1到約12個碳原子的全氟烷基，(19)約6到約14個碳原子的全氟芳基，(20)約7到15個碳原子的全氟芳烷基，和(21)氫(當X是直接鍵時)；其中Y1、Y2和Y3分別是選自，而且是(ⅰ)選自鹵素、氰基、硝基、四唑基、胍基、脒基、甲基胍基、-CF3、-CF2CF3、-CH(CF3)2、-C(OH)(CF3)2、-OCF3、-OCF2H、-OCF2CF3、-OC(O)NH2、-OC(O)NHZ1、-OC(O)NZ1Z2、-NHC(O)Z1、-NHC(O)NH2、-NH(O)NZ1、-NHC(O)NZ1NZ2、-C(O)OH、-C(O)OZ1、-C(O)NH2、-C(O)NHZ1、-C(O)NZ1Z2、-P(O)3H2、-P(O)3(Z1)2、-S(O)3H、-S(O)mZ1、-Z1、-OZ1、-OH、-NH2、-NHZ1、-NZ1Z2、-N-嗎啉基、-S(CF2)qCF3、和-S(O)m(CF2)qCF3，其中m是0、1或2,q是0到5的整數(shù)，而Z1和Z2分別選自1到約12碳原子的烷基，約6到14個碳原子的芳基，約5到14個環(huán)上原子的雜芳基，約7到15個碳原子的芳烷基，和約5到14個環(huán)上原子的雜芳烷基，或(ⅱ)Y1和Y2合起來選自-O[C(Z3)(Z4)]rO-，其中r是1到4的整數(shù)，而Z3和Z4分別是選自氫、1到約12個碳原子的烷基，約6到14個碳原子的芳基，約5到14個環(huán)上原子的雜芳基，約7到15個碳原子的芳烷基和約5到14個環(huán)上原子的雜芳烷基；(c)R2選自H、-CH3、-C2H5、-(CH2)2OH、-(CH2)2OA2、-CH(R6)OH、-CH(R6)OA2和-CH2NH-X’-R6，其中A2是-C(=O)OR9或-C(=O)R9；X’是選自-S(O)2-、-S(O)2-N(R″)-、-(C=O)-、-C(=O)-O-、-C(=O)-NH-、-P(O)(R″)-、和直接鍵，其中R″是氫，1到約4個碳原子的烷基，約6到14個碳原子的芳基，或約7到16個碳原子的芳烷基，條件是當X’是-P(O)(R″)-時，R″不是氫；R6選自(1)1到約12個碳原子的烷基，可任選的被Y1取代，(2)被約5到8個碳原子的環(huán)烷基取代的，1到約3個碳原子的烷基，該烷基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(3)3到約15個碳原子的環(huán)烷基，其可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(4)4到約10個環(huán)上原子的雜環(huán)烷基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中i是0、1或2，該雜環(huán)烷基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(5)4到約10個環(huán)上原子的雜環(huán)基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中i是0、1或2，包括 其中 是5到7個成員的雜環(huán)，具有3到6個環(huán)上碳原子，而V是-CH2-、-O-、-S(=O)-、-S(O)2-、或-S-，該雜環(huán)基可任選在環(huán)上碳原子上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(6)2到約6個碳原子的烯基，其可任選被約5到8個碳原子的環(huán)烷基取代，所述環(huán)烷基可任選的在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(7)約6到14個碳原子的芳基，其可任選被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(8)約5到14個環(huán)上原子的雜芳基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，所述雜芳基可任選的被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(9)約7到15個碳原子的芳烷基，其可任選在芳環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(10)約5到14個環(huán)上原子的雜芳烷基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，其可任選在烷基鏈上被羥基或鹵素取代，可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(11)約8到15個碳原子的芳烯基，其可任選在芳環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(12)5到約14個環(huán)上原子的雜芳烯基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，而且該雜芳烯基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，和(13)氫；和R9選自(1)1到約12個碳原子的烷基，可任選的被Y1取代，(2)被約5到8個碳原子的環(huán)烷基取代的1到約3個碳原子的烷基，其可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(3)3到約15個碳原子的環(huán)烷基，其可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(4)4到約10個環(huán)上原子的雜環(huán)烷基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中i是0、1或2，環(huán)上原子可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(5)4到約10個環(huán)上原子的雜環(huán)，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中i是0、1或2，包括 其中 是5到7個成員的雜環(huán)，具有3到6個環(huán)上碳原子，而V是-CH2-、-O-、-S(=O)-、-S(O)2-、或-S-，該雜環(huán)可任選的在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(6)6到約14個碳原子的芳基，其可任選被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(7)約5到14個環(huán)上原子的雜芳基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，該雜芳基可任選的被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(8)約7到15個碳原子的芳烷基，其可任選在芳環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(9)約5到14個環(huán)上原子的雜芳烷基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，該雜芳烷基可任選在烷基鏈上被羥基或鹵素取代，可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，和(10)氫，條件是當A2是-C(=O)OR9時，R9不是氫；(d)R3選自H或甲基，或R3和R4合起來選自在(f)中列出的；(e)R4是S構(gòu)型，而且選自H、-CH2-S-CH3、-CH2OH、-CH2CN、1到約3個碳原子的低級烷基，-CH2C≡CH、-CH2CH=CH2和-CH=CH2或R3和R4選自在(f)中列出的；(f)或者，R3和R4合起來是S構(gòu)型，在P2形成選自脯氨?；⒓谆哙せ?pipecholyl)、吖丁啶-2-羰基、4-羥基脯氨?；?、3-羥基脯氨?；?,4-脫氫脯氨酰基的基團；(g)R5是選自 和 其中R7選自 和 其中d是1到3的整數(shù)，而W是-N-或-CH-；和(h)A1是-NHR8，其中R8是1到約12個碳原子的烷基，約6到14個碳原子的芳基，或約6到15個碳原子的芳烷基，所有的都可任選被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，或是氫；及其藥物學上接受的鹽。
本發(fā)明的化合物可被分為稱為P1’、P1、P2、P3和P4的部分，如下式Ⅰa和Ⅰb顯示的 其中X、R1、R2、R3、R4、R7和A1結(jié)合式(Ⅰ)定義。因此，稱為P1或P1的式(Ⅰ)化合物的部分是鏈段 或 稱為P2或P2的式(Ⅰ)化合物的部分是鏈段 稱為P3或P3的式(Ⅰ)化合物的部分是鏈段 已報道肽基精氨酸醛在水溶液中以平衡結(jié)構(gòu)存在。Bajusz,S.，等，醫(yī)學化學雜志，33:1729(1990)。如下文所示，這些結(jié)構(gòu)包括精氨酸醛、A、醛水合物，B和兩種氨基環(huán)醇形式C和D。R基團將代表本發(fā)明舉例的給定化合物的剩余部分。本發(fā)明的肽醛包括在其所有平衡形式的范圍內(nèi)。 在其它因素中，本發(fā)明基于我們對本發(fā)明新穎化合物作為尿激酶抑制劑有活性的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的化合物展現(xiàn)了抑制血管生成的活性。
在另一方面，本發(fā)明針對藥物組合物，其包含治療有效量的本發(fā)明的化合物，和藥物學上可接受的載體。
在另一方面，本發(fā)明針對使用本發(fā)明的化合物和藥物組合物，來抑制尿激酶的方法。
定義除非另外特別描述，根據(jù)本發(fā)明并在本文中所用的下列術(shù)語定義成具有下列意義術(shù)語“鏈烯基”指具有至少一個雙鍵的未飽和脂肪族基團。
術(shù)語“烷基”指飽和脂肪族基團，包括直鏈、支鏈和環(huán)狀(包括多環(huán))基團。
術(shù)語“烷基氧”和“烷氧基”指具有式R-O-的基團，其中R是烷基。
術(shù)語“烷氧基羰基”指-C(O)OR，其中R是烷基。
術(shù)語“芳烯基”指被芳基取代的鏈烯基。優(yōu)選鏈烯基具有2到約6個碳原子。
術(shù)語“芳烷基”指被芳基取代的烷基。合適的芳烷基包括芐基、苯乙基等，其中所有的都可任選被取代。優(yōu)選烷基具有1到約6個碳原子。
術(shù)語“芳基”指具有至少一個環(huán)的芳族基團，該環(huán)具有共軛的π電子系統(tǒng)，并包括碳環(huán)芳基、雜環(huán)芳基和聯(lián)芳基，其中所有的都可被任選取代。
術(shù)語“芳氧基”指具有式R-O-的基團，其中R是芳基。
術(shù)語“芳烷氧基”指具有式R-O-的基團，其中R是芳烷基。
術(shù)語“氨基酸”指D和L立體異構(gòu)體(如果它們的結(jié)構(gòu)允許這樣的立體異構(gòu)形式)的天然和非天然氨基酸，和它們的類似物。天然氨基酸包括丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天門冬酰胺(Asn)、天門冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和纈氨酸(Val)。非天然氨基酸包括但不限于吖丁啶羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-二氨基丁酸、鎖鏈賴氨素(demosine)、2,2’-二氨基庚二酸、2,3’-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天門冬酰胺、羥基賴氨酸、別羥基賴氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈素、別-異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基異亮氨酸、N-甲基纈氨酸、降纈氨酸、降賴氨酸、鳥氨酸和2-哌啶酸。氨基酸類似物包括天然和非天然氨基酸，其N-末端氨基或其側(cè)鏈基團被可逆或不可逆的化學封閉或修飾(例如甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸砜、S-(羧甲基)-半胱氨酸、S-(羧甲基)-半胱氨酸亞砜和S-(羧甲基)-半胱氨酸砜)。
術(shù)語“氨基酸類似物”指一種氨基酸，其中C-末端羧基、N-末端氨基或側(cè)鏈官能團已被化學修飾成另一種官能團。例如，天門冬氨酸-(β-甲基酯)是天門冬氨酸的氨基酸類似物；N-乙基甘氨酸是甘氨酸的氨基酸類似物；或丙氨酸羧酰胺是丙氨酸的氨基酸類似物。
術(shù)語“氨基酸殘基”指具有下列結(jié)構(gòu)的基團(1)-C(O)-R-NH-，其中R通常是-CH(R’)-，其中R’是H或含有取代基的碳；或(2) 其中p是1、2或3，分別代表吖丁啶羧酸、脯氨酸或2-哌啶酸殘基。
“聯(lián)芳基”指被本文限定的碳環(huán)或雜環(huán)芳基取代的苯基，與苯環(huán)的結(jié)合點是鄰位、間位或?qū)ξ弧?br> “鹽水”指氯化鈉的飽和水溶液。
“碳環(huán)芳基”指芳族基團，其中芳環(huán)上的環(huán)上原子是碳原子。碳環(huán)芳基包括單環(huán)碳環(huán)芳基和萘基，它們都可任選的被取代。合適的碳環(huán)芳基包括苯基和萘基。合適的取代碳環(huán)芳基包括被1到2個取代基取代的茚和苯基，這些取代基宜是低級烷基、羥基、低級烷氧基、低級烷氧基羰基、鹵素、三氟甲基、二氟甲基、硝基和氰基，取代的萘基指萘基，更優(yōu)選指被根據(jù)上文式(Ⅰ)定義的Y1,Y2和/或Y3取代的1-或2-萘基。
“環(huán)鏈烯基”指環(huán)狀鏈烯基。合適的環(huán)鏈烯基指例如環(huán)戊烯基和環(huán)己烯基。
“環(huán)烷基”指具有至少一個環(huán)的環(huán)狀烷基，并包括多環(huán)基團(包括稠合環(huán)的環(huán)狀烷基)。合適的環(huán)烷基包括例如環(huán)己基、環(huán)丙基、環(huán)戊基和環(huán)庚基。
“環(huán)己基甲基”指與CH2結(jié)合的環(huán)己基。
“稠合碳環(huán)”指稠合多環(huán)的碳環(huán)，同時具有芳族和非芳族環(huán)。合適的稠合碳環(huán)包括芴基、1,2,3,4-四氫化萘等。
“稠合碳環(huán)烷基”指被稠合碳環(huán)鏈段取代的烷基，優(yōu)選被多環(huán)稠合的碳環(huán)，同時具有芳族和非芳族基團的碳環(huán)取代。合適的稠合碳環(huán)烷基包括芴基甲基等。
術(shù)語“鹵素”指氟、氯、溴和碘。
“雜芳鏈烯基”指被雜芳基取代的鏈烯基，并包括在“化學和物理手冊”，49版，1968,R.C.Weast編；The Chemical Rubber Co.,Cleveland,OH中描述的那些雜環(huán)系統(tǒng)。特別見C部分，命名有機化合物的方法，B．基本雜環(huán)系統(tǒng)。優(yōu)選鏈烯基具有2到約6個碳原子。
“雜芳烷基”指被雜芳基，如被甲基吡啶基取代的烷基，并包括在“化學和物理手冊”，49版，1968,R.C.Weast編；The Chemical Rubber Co.,Cleveland,OH中描述的那些雜環(huán)系統(tǒng)。特別見C部分，命名有機化合物的方法，B．基本雜環(huán)系統(tǒng)。優(yōu)選烷基具有1到約6個碳原子。
“雜芳基”指具有1到14個碳原子而且剩余環(huán)上原子是雜原子的芳基，并包括在“化學和物理手冊”，49版，1968,R.C.Weast編；The Chemical RubberCo.,Cleveland,OH中描述的那些雜環(huán)系統(tǒng)。特別見C部分，命名有機化合物的方法，B．基本雜環(huán)系統(tǒng)。合適的雜原子包括氧、氮和S(O)i,其中i是0、1或2，而合適的雜環(huán)芳基包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基等。
“雜環(huán)”指包含碳、氮、氧和/或硫原子的還原雜環(huán)系統(tǒng)，并包括在“化學和物理手冊”，49版，1968,R.C.Weast編；The Chemical Rubber Co.,Cleveland,OH中描述的那些雜環(huán)系統(tǒng)。特別見C部分，命名有機化合物的方法，B．基本雜環(huán)系統(tǒng)。
“雜環(huán)烷基”指被雜環(huán)基團取代的烷基，并包括在“化學和物理手冊”，49版，1968,R.C.Weast編；The Chemical Rubber Co.，Cleveland，OH中描述的那些雜環(huán)系統(tǒng)。特別見C部分，命名有機化合物的方法，B．基本雜環(huán)系統(tǒng)。優(yōu)選烷基具有約1到6個碳原子。
本文中和有機基或基團相關(guān)的術(shù)語“低級”定義為這些基或基團具有1到并包括5個碳原子，優(yōu)選達到并包括4個碳原子，并宜是一或2個碳原子。這些基或基團可以是直鏈或支鏈的。
“全氟烷基”指每個氫都被氟取代的烷基。
“全氟芳基”指每個氫都被氟取代的芳基。
“全氟芳烷基”指一個芳烷基，其中在芳基鏈段上的每個氫都被氟取代。
“藥物學上可接受的鹽”包括本發(fā)明化合物的鹽，衍生自這些化合物與一種有機或無機酸化合。在實施中，鹽形式的用量折合為堿形式的用量。本發(fā)明的化合物作為游離堿和鹽的形式都是有用的，將兩種形式都視為本發(fā)明范圍內(nèi)。
術(shù)語“Arg-al”指L-精氨醛的殘基，具有式 術(shù)語“Arg-ol”指L-精氨醇的殘基，具有式 “(S)-Ng-硝基精氨醇鹽酸鹽”指具有下式的化合物 術(shù)語“N--叔丁氧基羰基-Ng-硝基-L-精氨酸”指具有下式的化合物 術(shù)語“L-Ng-硝基精氨醛乙基環(huán)醇”指具有下述的基團 還見美國專利號5,514,777。
“Bn”指芐基。
“Boc”指叔丁氧基羰基。
“BzlSO2”指芐基磺酰基。
“Cbz”或“CBz”指芐氧基羰基。
“DCA”指二氯乙酸。
“DCC”指N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺。
“DCM”指二氯甲烷。
“DMF”指N,N-二甲基甲酰胺。
“DMSO”指二甲基亞砜。
“DMAP”指4-N,N-二甲基氨基吡啶。
“EDC”指1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亞胺鹽酸鹽。
“Et3N”指三乙基胺。
“EtOH”指乙醇。
“HBTU”指六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲酯。
“HCl”指鹽酸。
“HOAc”指乙酸。
“HPLC”指高效液相層析。
“HOBt”指1-羥基苯并三唑一水合物。
“i-BuOCOCl”指氯甲酸異丁酯。
“LiAlH4”指氫化鉀鋁。
“LiAlH2(OEt)2”指二乙氧基氫化鉀鋁。
“Me”指甲基。
“NMM”指N-甲基嗎啉。
“PhB(OH)2”指苯基硼酸。
“PhBOP”指六氟磷酸苯并三唑氧基-三吡咯烷基鏻。
“TFA”指三氟乙酸。
“THF”指四氫呋喃。
“TLC”指薄層層析。
附圖簡述

圖1描述了合成用于固相合成本發(fā)明化合物，在P1具有精氨醛基的中間物的反應(yīng)流程。在該圖中，“ⅰ”到“ⅶ”定義為ⅰ)無水乙腈中的4-甲基嗎啉、EDC、和1-羥基苯并三唑；室溫攪拌16小時，后處理后回收率為78％；(ⅱ)-78℃氮氣下氫化鉀鋁/四氫呋喃1小時，溫至室溫，冷卻到-78℃，用硫酸氫鈉淬滅，后產(chǎn)率為76％；ⅲ)乙腈中的6-羥基己酸乙酯，HCL水溶液；用乙酸酐和吡啶封端過量的6-羥基己酸乙酯，后處理后產(chǎn)率為93.7％；ⅳ)乙醇/水/乙酸(4∶1∶1)，10％鈀碳，40psi H216小時，后處理后產(chǎn)率為94.4％；v)DCM,1NNaOH,pH11-13，氯甲酸烯丙酯，后處理后產(chǎn)率為80％；ⅵ)乙醇，3N LiOH，用1N HCl到pH2-3，后處理后產(chǎn)率為83％；和ⅶ)氨基甲基化的聚苯乙烯樹脂(“AM樹脂”)，DMF中的PyBOP，二異丙基乙基胺，用Kaiser試驗測定偶聯(lián)；用DMF/乙酸/三乙胺(8∶1∶1)封端，后處理后產(chǎn)率為92％。也見實施例1到7。
圖2描述了用樹脂1-9(見圖1)固相合成本發(fā)明的化合物的反應(yīng)流程。在該圖中，“ⅰ”到“ⅶ”定義為ⅰ)DCM、TFA、和硫代苯甲醚；ⅱ)Fmoc-丙氨酸、1-羥基苯并三唑、TBTU和DMF中的二異丙基乙基胺，99.5％偶聯(lián)效率；ⅲ)50％DMF中的哌啶；ⅳ)DMF、N-α-Fmoc-D-絲氨酸(O-叔丁基)、1-羥基苯并三唑、TBTU、二異丙基乙基胺；ⅴ)DMF中的50％哌啶；ⅵ)DMF中的氯甲酸異丁酯、二異丙基乙基胺；ⅶ)甲基亞砜、四氫呋喃、1N HCl、嗎啉、四-三苯基膦合鈀；和ⅷ)TFA/DCM/H2O(6∶3∶1)，用半制備級反相HPLC純化。也見實施例8。
圖3描述了用L-Ng-硝基精氨醛乙基環(huán)醇中間物液相合成本發(fā)明在P1具有精氨醛基的化合物的反應(yīng)流程?；衔?-1是N-α-Cbz-D-絲氨酸(O-叔丁基)，化合物3-2是丙氨酸甲酯，鹽酸鹽。在該圖中“ⅰ”到“ⅶ”如下定義ⅰ)EDC、1-羥基苯并三唑和乙腈，二異丙基乙基胺，得到Cbz-D-絲氨酸(O-叔丁基)-Ala-OMe；(ⅱ)乙醇/乙酸/水(4∶1∶1)，10％鈀碳，45psi H22小時，后處理后95％產(chǎn)率；ⅲ)乙腈，苯磺酰氯，二異丙基乙基胺，后處理后43％產(chǎn)率；ⅳ)甲醇，1.0M氫氧化鋰，在DOWEX離子交換樹脂上酸化，用甲醇/水洗脫，后處理后產(chǎn)率為95％；ⅴ)1-羥基苯并三唑，乙腈，二異丙基乙基胺，后處理后95％產(chǎn)率；ⅵ)在10％鈀碳上在乙醇/乙酸/水(4∶1∶1)中以50psi氫化，分離芐基磺?；?D-絲氨酸(O-叔丁基)-L-Ala-L-精氨醛乙基環(huán)醇；和ⅶ)攪拌，用6MHCl,6.5M乙酸銨調(diào)節(jié)到pH4，用制備級反相HPLC純化，三個步驟(ⅴ-ⅶ)產(chǎn)率為15％。也見實施例17到20。
圖4描述了合成本發(fā)明在P1處具有精氨酸酮酰胺的化合物的反應(yīng)流程。在該圖中“ⅰ”如下定義ⅰ)苯乙基胺，BOP和1-羥基苯并三唑、DMF、4-甲基嗎啉，后處理后89％產(chǎn)率；ⅱ)乙酸乙酯中的HCl，得到Ng-硝基Arg-COH-苯乙基酰胺鹽酸鹽；ⅲ)叔丁氧基羰基-Ala-OH、EDC、1-羥基苯并三唑和乙腈、二異丙基乙基胺，后處理后95％產(chǎn)率；ⅳ)乙酸乙酯中的HCl，后處理后98％產(chǎn)率；ⅴ)叔丁氧基羰基絲氨酸芐基醚EDC和1-羥基苯并三唑、乙腈、二異丙基乙基胺、后處理后產(chǎn)率為92％；ⅵ)乙酸乙酯中的HCl、后處理后98％產(chǎn)率；ⅶ)乙腈，氯甲酸異丁酯、二異丙基乙基胺，后處理后85％產(chǎn)率ⅷ)EDC、甲基亞砜和二氯乙酸，后處理后68％產(chǎn)率；ⅸ)-20℃，苯甲醚，HF，后處理后26％產(chǎn)率，并用制備級反相HPLC純化。也見實施例27到34。
圖5描述了另一種用來制備化合物1(圖2描述的化合物)，一種L-Ng-硝基精氨醛乙基環(huán)醇中間物的液相合成途徑的反應(yīng)流程。在該圖中，“ⅰ”到“ⅵ”如下定義ⅰ)氯甲酸異丁酯、碳酸鈉、水，后處理后99.5％產(chǎn)率；ⅱ)丙氨酸叔丁酯，鹽酸鹽，EDC，和乙腈中的羥基苯并三唑；二異丙基乙基胺、后處理后定量級產(chǎn)率；ⅲ)TFA、DCM、后處理后定量產(chǎn)率；ⅳ)Ng-硝基精氨醛乙基環(huán)醇、HCl鹽、EDC、和乙腈中的羥基苯并三唑；二異丙基乙基胺，后處理后50％產(chǎn)率；ⅴ)乙醇/乙酸/水(4∶1∶1)，10％鈀碳，50psi的H2,4小時；ⅵ)3.0MHCl；制備級反相HPLC；兩步(ⅴ和ⅵ)步驟化合物1的產(chǎn)率為62％。也見實施例54到59。
圖6描述了在固相合成本發(fā)明在P1處具有精氨醛的化合物中使用的保護的精氨醛亞肼基羰基氨基甲基化的聚苯乙烯樹脂合成的反應(yīng)流程?；衔?-1是N-α-芴基甲氧基羰基-ω、ω-二-N-叔丁氧基羰基-精氨酸。在該圖中，“ⅰ”到“ⅳ”如下定義∶ⅰ)乙腈、碳酸鉀、碘甲烷、50℃、乙酸乙酯；ⅱ)THF和甲醇、氯化鈣、冰浴、硼氫化鈉、攪拌、后處理后71％產(chǎn)率；ⅲ)甲基亞砜和甲苯、冰浴、EDC和二氯乙酸；和ⅳ)DCM、HCAM樹脂、環(huán)境溫度16到24小時。也見實施例41到45。
圖7描述了固相合成本發(fā)明在P1處具有精氨醛的化合物，并使用圖6中間物的反應(yīng)流程。在該圖中，“ⅰ”到“ⅸ”如下定義ⅰ)30％哌啶/DMF；ⅱ)N-α-Fmoc-吖丁啶-2-羧酸、1-羥基苯并三唑、TBTU、和DMF中的二異丙基乙基胺；ⅲ)30％哌啶/DMF；ⅳ)N-α-Fmoc-D-絲氨酸-叔丁基醚、1-羥基苯并三唑、TBTU、和DMF中的二異丙基乙基胺；ⅴ)雙重偶聯(lián)N-α-Fmoc-絲氨酸-o-叔丁基醚、1-羥基苯并三唑、TBTU和DMF中的二異丙基乙基胺，后處理后97％偶聯(lián)效率；ⅵ)30％哌啶/DMF；ⅶ)苯磺酰氯和DMF中的二異丙基乙基胺；ⅷ)雙重偶聯(lián)苯磺酰氯和DMF中的二異丙基乙基胺，后處理后96％偶聯(lián)效率；和ⅸ)TFA/水(9∶1)，半制備級反相HPLC純化后26％產(chǎn)率。也見實施例46到53。
圖8描述了制備用于合成本發(fā)明在P1處具有3-哌啶基-(N-胍基)精氨醛的化合物的中間物的反應(yīng)流程。在該圖中，“ⅰ”到“ⅵ”如下定義ⅰ)亞硫酰氯，甲醇；ⅱ)焦碳酸二叔丁酯，pH7到8；ⅲ)氫氣、乙醇中的氧化鉑，水和乙酸；ⅳ)雙-芐氧基羰基S-甲基異硫脲、堿、四氫呋喃；ⅴ)氯化鈣、四氫呋喃中的氫硼化鈉和乙醇；ⅵ)HCl、乙酸乙酯。“*”表明不對稱碳原子的位置。也見實施例60到64。
圖9描述了制備中間物，用于合成本發(fā)明在P1處具有3-脒基苯基丙氨醛的化合物的反應(yīng)流程。在該圖中，“ⅰ”到“ⅹⅰ”定義如下ⅰ)碘化鉀、二噁烷；2.5M乙醇中的乙氧基鈉，氬氣，回流6小時；后處理后產(chǎn)率為60％；ⅱ)吡啶、三乙胺；H2S(g)，室溫攪拌16小時，后處理后產(chǎn)率為98％；ⅲ)丙酮，碘甲烷、回流30分鐘，過濾，甲醇；ⅳ)乙酸銨、回流1小時，過濾并干燥；ⅴ)濃鹽酸、回流3小時，后處理后產(chǎn)率為30％；ⅵ)二噁烷、碳酸氫鈉、焦碳酸二叔丁酯、室溫攪拌18小時；ⅶ)4℃,4.0N NaOH調(diào)節(jié)到pH12；二噁烷中的4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰氯；1.0N HCl調(diào)節(jié)到pH7到8、水、后處理后產(chǎn)率為68％，ⅷ)O,N-二甲基羥基胺鹽酸鹽，羥基苯并三唑水合物，4-甲基嗎啉、THF、攪拌2小時，后處理后產(chǎn)率為69％；ⅸ)LiAlH4、THF、-78℃；硫酸氫鉀水溶液，后處理后產(chǎn)率為86％；ⅹ)4-二苯甲基氨基脲三氟乙酸鹽(實施例65的化合物)，乙醇中的三水合乙酸鈉，回流，后處理后產(chǎn)率為89％；和ⅹⅰ)50％TFA/DCM，加到乙醚中，后處理后產(chǎn)率為79％。也見實施例65到72。
圖10描述了制備-種中間物，用于合成本發(fā)明在P1處具有4-哌啶基-(N-胍基)丙氨醛的化合物的反應(yīng)流程。在該圖中，“ⅰ”到“ⅵ”定義如下ⅰ)亞硫酰氯、甲醇；ⅱ)焦碳酸二叔丁酯，pH7到8；ⅲ)氫氣、乙醇中的氧化鉑、水和乙酸；ⅳ)四氫呋喃中的雙芐氧基羰基S-甲基異硫脲堿、THF；ⅴ)氯化鈣、THF和乙醇中的硼氫化鈉；和ⅵ)乙酸乙酯中的HCl?！?”表明非對稱碳原子的位置。見實施例73。
圖11描述了用圖8的8-6等中間物，合成本發(fā)明在P1處具有3-胍基-哌啶醛基的化合物的反應(yīng)流程。在該圖中，“ⅰ”到“ⅸ”如下定義ⅰ)氯甲酸異丁酯、碳酸氫鈉、二噁烷水溶液；ⅱ)丙氨酸叔丁酯、EDC、HOBt、NMM；ⅲ)H2、Pd/C；ⅳ)吡啶、氯甲酸苯酯；ⅴ)TFA/DCM；ⅵ)EDC、HOBt、NMM；ⅶ)H2、Pd/C；ⅷ)EDC、DCA、DMSO、甲苯；和ⅸ)H2O,pH7；制備級反相HPLC。見實施例74。
圖12描述了使用圖9的9-10等中間物合成本發(fā)明在P1處具有脒基-苯基丙氨醛的化合物的反應(yīng)流程。在該圖中，“ⅰ”到“ⅲ”如下定義ⅰ)EDC、HOBt、NMM；ⅱ)HF、苯甲醚；和ⅲ)90％TFA水溶液；制備級反相HPLC。見實施例75。
圖13描述了使用中間物13-1(圖5的5-5(實施例57))合成本發(fā)明化合物，其中R2是-CH2OA2和A2是-C(=O)R9的反應(yīng)流程。在該圖中，“ⅰ”到“?！比缦露xⅰ)吡啶、R9COCl；ⅱ)H2、10％Pd/C、EtOH、H2O；ⅲ)HPF6水溶液、乙腈。
發(fā)明詳述1．優(yōu)選化合物本發(fā)明的化合物具有式 其中(a)X選自-S(O)2-、-N(R’)-S(O)2-、-(C=O)-、-OC(=O)-、-NH-C(=O)-、-P(O)(R’)-、和直接的化學鍵，其中R’分別是氫、1到約4個碳原子的烷基、約6到14個碳原子的芳基或約7到16個碳原子的芳烷基，條件是當X是-P(O)(R’)-時，R’不是氫。
(b)R1選自(1)1到約12個碳原子的烷基，其可任選的被Y1取代，(2)1到約3個碳原子的烷基，被約5到8個碳原子的環(huán)烷基取代，該環(huán)烷基可任選的被Y1、Y2和/或Y3在環(huán)上單-、二-或三取代，(3)3到約15個碳原子的環(huán)烷基，其在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3可任選的單-、二-、或三取代，(4)4到約10個環(huán)上原子的雜環(huán)烷基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮、和S(O)i，其中i是0、1或2，所述雜環(huán)烷基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(5)4到約10個環(huán)上原子的雜環(huán)基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中i是0、1或2，包括 其中 是5到7個成員的雜環(huán)，具有3到6個環(huán)上碳原子，而V是-CH2-、-O-、-S(=O)-、-S(O)2-或-S-，該雜環(huán)基可任選在環(huán)上碳原子上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(6)2到約6個碳原子的鏈烯基，其可任選的被約5到8個碳原子的環(huán)烷基取代，該鏈烯基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，
(7)約6到14個碳原子的芳基，其可任選被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(8)約5到14個環(huán)上原子的雜芳基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，該雜芳基可任選的被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(9)約7到15個碳原子的芳烷基，其可任選的在芳環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(10)約5到14個環(huán)上原子的雜芳烷基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，該雜芳烷基可任選的在烷基鏈上被羥基和鹵素取代，可任選的在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(11)約8到16個碳原子的芳烯基，其在芳環(huán)上可任選被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(12)約5到14個環(huán)上原子的雜芳烯基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，該雜芳烯基可任選在環(huán)上碳原子上被Y1、Y2/或Y3單-、二-、或三取代，
(17)約9到15個碳原子的稠合碳環(huán)烷基；(18)二氟甲基或1到約12個碳原子的全氟烷基，(19)約6到約14個碳原子的全氟芳基，(20)約7到15個碳原子的全氟芳烷基，和(21)氫，當X是直接鍵；其中Y1、Y2和Y3分別是選自，而且是(ⅰ)選自鹵素、氰基、硝基、四唑基、胍基、脒基、甲基胍基、-CF3、-CF3(CF3)2、-C(OH)(CF3)2、-OCF3、-OCF2H、-OCF2CF3、-OC(O)NH2、-OC(O)NHZ1、-OC(O)NZ1Z2、-NHC(O)Z1、-NHC(O)NH2、-NH(O)NZ1、-NHC(O)NZ1NZ2、-C(O)OH、-C(O)OZ1、-C(O)NH2、-C(O)NHZ1、-C(O)NZ1Z2、-P(O)3H2、-P(O)3(Z1)2、-S(O)3H、-S(O)mZ1、-Z1、-OZ1、-OH、-NH2、-NHZ1、-NZ1Z2、-N-嗎啉基、-S(CF2)qCF3、和-S(O)m(CF2)qCF3、其中m是0、1或2,q是0到5的整數(shù)，而Z1和Z2分別選自1到約12碳原子的烷基，約6到14個碳原子的芳基，約5到14個環(huán)上原子的雜芳基，約7到15個碳原子的芳烷基，和約5到14個環(huán)上原子的雜芳烷基，或(ⅱ)Y1和Y2合起來選自-O[C(Z3)(Z4)]rO-，其中r是1到4的整數(shù)，而Z3和Z4分別是選自氫、1到約12個碳原子的烷基，約6到14個碳原子的芳基，約5到14個環(huán)上原子的雜芳基，約7到15個碳原子的芳烷基和約5到14個環(huán)上原子的雜芳烷基；(c)R2選自H、-CH3、-C2H5、-(CH2)2OH、-(CH2)2OA2、-CH(R6)OH、-CH(R6)OA2和-CH2NH-X’-R6，其中A2是-C(=O)OR9或-C(=O)R9；X’是選自-S(O)2-、-S(O)2-N(R″)-、-(C=O)-、-C(=O)-O-、-C(=O)-NH-、-P(O)(R″)-、和直接鍵，其中R″是氫，1到約4個碳原子的烷基，約6到14個碳原子的芳基，或約7到16個碳原子的芳烷基，條件是當X’是-P(O)(R″)-時，R″不是氫；R6選自(1)可任選的被Y1取代的1到約12個碳原子的烷基，(2)被約5到8個碳原子的環(huán)烷基取代的1到約3個碳原子的烷基，該環(huán)烷基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(3)3到約15個碳原子的環(huán)烷基，其可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(4)4到約10個碳原子的雜環(huán)烷基，環(huán)上運轉(zhuǎn)選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中i是0、1或2，該雜環(huán)烷基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(5)4到約10個環(huán)上原子的雜環(huán)基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中i是0、1或2，包括 其中 是5到7個成員的雜環(huán)，具有3到6個環(huán)上碳原子，而V是-CH2-、-O-、-S(=O)-、-S(O)2-、或-S-，該雜環(huán)烷基可任選在環(huán)上碳原子上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(6)2到約6個碳原子的烯基，其可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(7)約6到14個碳原子的芳基，其可任選被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(8)約5到14個環(huán)上原子的雜芳基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，該雜芳基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(9)約7到15個碳原子的芳烷基，其可任選在芳環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(10)約5到14個環(huán)上原子的雜芳烷基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，該雜環(huán)烷基可任選在烷基鏈上被羥基和鹵素取代，在環(huán)上可任選的被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(11)約8到15個碳原子的芳烯基，其可任選的在芳環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(12)5到約14個環(huán)上原子的雜芳烯基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，該雜芳烯基可任選在環(huán)上碳原子上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，和(13)氫；和R9選自(1)可任選的被Y1取代的1到約12個碳原子的烷基，(2)被約5到8個碳原子的環(huán)烷基取代的，1到約3個碳原子的烷基，該環(huán)烷基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(3)3到約15個碳原子的環(huán)烷基，其可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(4)4到約10個環(huán)上原子的雜環(huán)烷基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中i是0、1或2，該雜環(huán)烷基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(5)4到約10個環(huán)上原子的雜環(huán)基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中i是0、1或2，包括 其中 是5到7個成員的雜環(huán)，具有3到6個環(huán)上碳原子，而V是-CH2-、-O-、-S(=O)-、-S(O)2-、或-S-，該雜環(huán)基可任選的在環(huán)上碳原子上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(6)6到約14個碳原子的芳基，其可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(7)約5到14個環(huán)上原子的雜芳基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，該雜芳基可任選的被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(8)約7到15個碳原子的芳烷基，其可任選在芳環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(9)約5到14個環(huán)上原子的雜芳烷基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，該雜芳烷基在烷基鏈上可任選的被羥基或鹵素取代，可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，和(10)氫，條件是當A2是-C(=O)OR9時，R9不是氫；(d)R3選自H或甲基，或R3和R4合起來選自在(f)中列出的；(e)R4是S構(gòu)型，而且選自H、-CH2-S-CH3、-CH2OH、-CH2CN、1到約3個碳原子的低級烷基，-CH2C≡CH、-CH2CH=CH2和-CH=CH2或R3和R4合起來選自在(f)中列出的；(f)另外，R3和R4都是S構(gòu)型，在P2形成選自脯氨酰基、甲基哌啶基、吖丁啶-2-羰基、4-羥基脯氨酰基、3-羥基脯氨?；?,4-脫氫脯氨?；?；(g)R5是選自 和 其中R7選自 和 其中d是1到3的整數(shù)，而W是-N-或-CH-；和(h)A1是-NHR8，其中R8是1到約12個碳原子的烷基，約6到14個碳原子的芳基，或約6到15個碳原子的芳烷基，所有可任選被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，或是氫；及其藥物學上接受的鹽。
優(yōu)選X基團包括-S(O)2-、-OC(=O)-、-NH-C(=O)-、和直接鍵。尤其優(yōu)選是-S(O)2-和-OC(=O)-。
優(yōu)選R1基團包括烷基、尤其是異丁基、2-乙基己基、甲基、丁基、異丙基、環(huán)己基甲基和環(huán)己基丙基；環(huán)烷基，尤其是(-)薄荷基、(+)薄荷基和環(huán)己基；芳基，尤其是萘基和苯基；芳烷基，尤其是芐基、3-苯基丙基和2-苯基乙基；和稠合的碳環(huán)烷基，尤其是芴基甲基。尤其優(yōu)選的R1基團包括苯基、芐基、2-苯基乙基、異丁基和3-苯基丙基。
優(yōu)選R1-X-的組合包括苯基-S(O)2-、芐基-S(O)2-、2-苯基乙基-S(O)2-、3-苯基丙基-S(O)2-、芐基-OC(=O)-、和異丁基-OC(=O)-。
優(yōu)選R2基團包括H、-CH3、-C2H5、-CH2NH-X’-R6和-CH(R6)OH，其中R6是氫、烷基，尤其是甲基或芳烷基。優(yōu)選α碳的手性是R。當手性時，優(yōu)選β碳的手性是R。優(yōu)選R2基團是那些限定P3位置是甘氨酸，d-絲氨酰(-CH(R6)OH，其中R6是H),(R,R)D-別蘇氨?；?-CH(R6)OH，其中R6是甲基)、D-2-氨基丁?；-β-甲氧基羰基-d-2,3-二氨基丙?；?-CH2NH-X’-R6，其中R6是CH3而X是(-C=O)O-)、N-D-(2-苯基乙基羰基)-d-2,3-二氨基丙?；?-CH2NH-X’-R6，其中R6是2-苯基乙基而X’是-(C=O)-)、和N-β-芐氧基羰基-d-2,3-二氨基丙?；?-CH2NH-X’-R6，其中R6是芐基而X’是-(C=O)O-)。尤其優(yōu)選的R2基團是那些限定P3是d-絲氨?；?R6是H)或(R,R)d-別蘇氨?；?R6是甲基)。
另外優(yōu)選的R2基團包括-(CH2)OA2和-CH(R6)OA2，更優(yōu)選-CH(R6)OA2；優(yōu)選R6是H。更優(yōu)選R2使得P3定義為酰基或d-絲氨酰的碳酸酯。R2是-(CH2)2OA2或-CH(R6)OA2的化合物可作為藥物前體。
當R3和R4不合起來選擇時，優(yōu)選R3基團是氫。當R3和R4不合起來選擇時，優(yōu)選R4基團是甲基或炔丙基。當R3和R4合起來選擇時，優(yōu)選P2處的基團是脯氨?；?、4-順-羥基脯氨?；?,4-脫氫脯氨?；瓦苟∴?2-羰基-。
優(yōu)選R5基團是-CH((CH2)3NHC(=NH)NH2)CHO，以在P1處產(chǎn)生精氨酸醛。
在所要求的化合物中，在化合物的該位置具有限定d-絲氨酸或d-異蘇氨酸的R2部分，以及，在R5有一精氨酸醛的化合物是優(yōu)選的。尤其優(yōu)選的是還具有ⅰ)R3處的氫和R4處的甲基(P2是丙氨酸)，或ⅱ)具有合起來選擇的R3和R4，從而P2是脯氨?；⑦苟∴?2-羰基，或3,4-脫氫脯氨?；倪@些化合物。
本發(fā)明的優(yōu)選化合物包括 和 優(yōu)選化合物的制備圖1到12描述了制備某些本發(fā)明優(yōu)選化合物的合成流程。
圖1描述了合成N-α-叔丁氧基羰基-N-ω-烯丙氧基羰基-精氨醛(6-己?；?氨基-甲基化的聚苯乙烯樹脂)環(huán)醇，它用于固相合成本發(fā)明P1出具有精氨酸醛的化合物。實施例1到7詳細描述了該合成。
圖2描述了用圖7描述的樹脂固相合成本發(fā)明化合物。在實施例8中進一步描述了該合成。
圖3描述了用L-Ng-硝基精氨醛乙基環(huán)醇中間物液相合成本發(fā)明化合物。也見實施例17到21和22到26。
圖4描述了本發(fā)明P1處具有精氨酸酮酰胺基團的化合物的合成流程。實施例27到34進一步描述了這些化合物的合成。
實施例35到40描述了用L-Ng-硝基精氨醛乙基環(huán)醇中間物液相合成本發(fā)明優(yōu)選化合物。
圖5描述了用液相合成和L-Ng-硝基精氨醛乙基環(huán)醇中間物制備圖2描述的化合物的另一種合成途徑。也見實施例54到59。
圖6描述了一種合成流程，而實施例41到45進一步描述了精氨醛-亞肼基羰基氨基甲基化的樹脂的合成，可用它制備本發(fā)明的化合物。
圖7描述了用實施例45的樹脂固相制備本發(fā)明化合物的合成流程。實施例46到53進一步描述了這些固相合成。
圖8描述了制備用于合成本發(fā)明在P1處具有3-哌啶基-(N-胍基)-丙氨醛基團的化合物的中間物的合成流程。實施例60到64更詳細描述了其制備。
圖9描述了制備一種中間物的反應(yīng)流程，其可用于合成本發(fā)明在P1處具有3-脒基苯基丙氨醛基團的化合物。可根據(jù)圖9描述的和實施例65到72描述的反應(yīng)流程，用合適的α-溴-對甲苯腈起始材料制備用于制備式(Ⅰ)P1處具有4-脒基苯基丙氨醛基的化合物的中間物。
圖10描述了制備中間物的反應(yīng)流程，它用于合成本發(fā)明在P1處具有4-哌啶基-(N-胍基)丙氨醛基團的化合物。用與實施例60到64中描述的相似的程序，并使用合適起始材料制備了該中間物。
圖11描述了用圖8的8-6等中間物，制備本發(fā)明在P1處具有3-哌啶基-(N-胍基)丙氨醛基團的反應(yīng)流程。
圖12描述了用圖9的9-10等中間物制備本發(fā)明在P1處3-脒基苯基丙氨醛基團的化合物的反應(yīng)流程。
圖13描述了制備本發(fā)明在P3處具有酯化d羥基的化合物的反應(yīng)流程。
化學偶聯(lián)(例如酰氨基鍵合功能)的優(yōu)選方法包括用本領(lǐng)域已知的常規(guī)偶聯(lián)試劑形成肽鍵。見Bodanszky,N.肽化學，pp.55-73,Springer-Verlag,NewYork(1988)和其中引用的文獻?？赏ㄟ^一步或兩步偶聯(lián)進行化學偶聯(lián)。在一步偶聯(lián)中，兩個偶聯(lián)配體直接偶聯(lián)。一步偶聯(lián)的優(yōu)選偶聯(lián)試劑包括DCC和HOBt、EDC和HOBt、EDC和HOAt、HBTU或TBTU。在兩步偶聯(lián)中，先在一種偶聯(lián)配體的C-末端羧基形成活化酯或酸酐，然后與另一種配體偶聯(lián)。
為了制備某些具有氫化敏感性取代基團的化合物，優(yōu)選避免使用氫氣和鈀碳。另一種制備本發(fā)明含有氫化敏感性基團，如被鹵素、氰基、硝基或-S-Z1取代的鏈烯基或芳基鏈段的優(yōu)選方法是，用三(三氟乙酸)硼，B(OCOCF3)3，來切開精氨酸基團的Ng-硝基。通過使BBr3和CF3COOH在二氯甲烷中0℃反應(yīng)制備該試劑。試劑也可商業(yè)購得。通常，Ng-硝基化合物在三氟乙酸中在0℃用三(三氟乙酸)硼處理。例如，F(xiàn)iese,M.和Fieser,L.F.，有機合成的試劑，p.46，John Wiley& Sons,New York(1974)；Pless,J.，和Bauer，W.Angew.Chem.,Internat.Ed.,12,147(1973)。
另外，另一個用于選擇性切開硝基的優(yōu)選試劑是三氯化鈦。該試劑可商業(yè)購得。用三氯化鈦在含有乙酸銨緩沖液的甲醇水溶液中處理Ng硝基化合物，然后將反應(yīng)混合物暴露在空氣或二甲基亞砜中。見例如，F(xiàn)reidinger,R.M.,Hirschmann,R.，和Veber,D.F.，有機化學雜志，43,4800(1978)。
另一種用于合成這些具有L-精氨醛鏈段的化合物的優(yōu)選方法是，將二-N-叔丁氧基羰基保護基團用于L-精氨醛鏈段的與鈀碳氫化不相容的基團。例如，將α-N-芐氧基羰基-ω、ω’-二-N-叔丁氧基羰基精氨酸溶解于乙腈，并用羥基苯并三唑和1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亞胺鹽酸鹽處理，形成α-N-芐氧基羰基-ω、ω’-二-N-叔丁氧基羰基-L-精氨酸內(nèi)酰胺。通過用THF中的LiAlH4在-70℃處理來還原內(nèi)酰胺，提供α-N-芐氧基羰基-ω,ω’-二-N-叔丁氧基羰基-L-精氨醛。通過用乙醇和HCl處理，作為二乙基縮醛保護了該醛。通過用氫氣和鈀碳處理除去N-芐氧基羰基保護基，產(chǎn)生ω,ω’-二-N-叔丁氧基羰基-L-精氨醛二乙基縮醛，鹽酸鹽。然后可通過用N-羥基苯并三唑和1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亞胺鹽酸鹽處理，將該保護的L-精氨醛鏈段與所要的羧酸偶聯(lián)。通過0℃用乙腈中的六氟磷酸處理，除去二乙基縮醛和二-Boc保護基團。通過加入2.5M乙酸鈉水溶液直到pH4來淬滅反應(yīng)混合物。將混合物濾過2微米濾膜。用0.1％CF3COOH在10-40％乙腈水溶液中進行制備級HPLC，提供了所要的取代的L-精氨醛化合物的三氟乙酸鹽。
圖13描述了合成本發(fā)明的化合物(其中R2是-CH2OA2和A2是-C(=O)R9)的反應(yīng)流程。使13-1(實施例57)的中間物與酰氯R9COCl在吡啶等堿的存在下反應(yīng)。氫化中間物13-2(H2、乙醇水乙酸中10％Pd/C)，然后用HPF6水溶液和乙腈處理，除去保護性基團，而不水解R2處的酯。通過使合適的對應(yīng)13-1的中間物和合適的酰氯衍生物，R9COCl，優(yōu)選在吡啶等堿的存在下反應(yīng)，可方便的制備R2是-(CH2)2OA2或-CH(R6)OA2，其中A2是-C(=O)R9的化合物。在制備R5是精氨醛基的化合物時，然后氫化產(chǎn)物，用HPF2水溶液和乙腈處理，得到產(chǎn)物精氨醛，而不水解R2處的酯。
可通過用合適的氯甲酸酯衍生物處理R2是-(CH2)2OH或-CH(R6)OH的對應(yīng)化合物，可方便的制備R2是-(CH2)2OA2或-CH(R6)OA2，其中A2是-C(=O)OR9的化合物。在制備P1是精氨醛的化合物中，優(yōu)選用碳酸酯基團封端，然后使精氨酸側(cè)鏈去保護。因此，優(yōu)選用氯甲酸酯衍生物處理對應(yīng)的Ng-硝基精氨醛-乙基環(huán)醇中間物(見例如實施例76)。然后氫化產(chǎn)物，在水解條件下處理，得到產(chǎn)物精氨醛(見例如實施例77到78)。
3．優(yōu)選化合物的選擇根據(jù)本發(fā)明的一個方面，選擇本發(fā)明優(yōu)選化合物抑制絲氨酸蛋白酶，尤其是尿激酶的的能力和選擇性。這些評估在體外常規(guī)進行，根據(jù)實施例A中列出的程序。如所述，和公知的，在允許蛋白酶及其底物反應(yīng)的試驗條件下使靶絲氨酸蛋白酶與其底物混合。在不存在測試化合物，和存在遞增濃度的測試化合物的條件下進行試驗。絲氨酸蛋白酶活性50％被測試化合物抑制的測試化合物濃度是IC50值(抑制濃度)或該化合物的EC50(有效濃度)值。在一系列或組測試化合物中，將那些具有較低IC50或EC50值的化合物視為是比具有較高IC50或EC50值的化合物更強的絲氨酸蛋白酶抑制劑。IC50測量常用于更簡單化的試驗，而EC50常用于更復雜的試驗，如那些使用細胞的試驗。
根據(jù)本發(fā)明的該方面，優(yōu)選化合物具有如在尿激酶活性抑制的體外試驗中測量的，100nM或更低的IC50值。尤其優(yōu)選的化合物具有小于30nM的IC50值。
還評估了測試化合物對絲氨酸蛋白酶的選擇性。如實施例中所述和公知的，試驗測試化合物對一套絲氨酸蛋白酶和其它酶的能力，對于各試驗系統(tǒng)中的各測試化合物，測定了IC50值或EC50值。將對靶酶，例如尿激酶具有較低的IC50或EC50值，而對于測試組中的其它酶(如組織纖溶酶原激活物、纖維蛋白酶、凝血因子Xa)，具有較高的IC50或EC50值的化合物視為對靶酶具有選擇性。一般，認為如果一種化合物在靶酶試驗中的IC50值或EC50值比酶選擇性組中測量的第二最小的IC50或EC50值至少小一個數(shù)量級，該化合物是選擇性的。
本發(fā)明的優(yōu)選化合物如在尿激酶活性抑制的體外試驗中測量的，具有100nM或更小的IC50值。尤其優(yōu)選的化合物在體外尿激酶抑制試驗中具有比體外tPA抑制試驗中測量的IC50值至少小一個數(shù)量級的IC50值。尤其優(yōu)選的是具有大于100的IC50tPA試驗IC50尿激酶試驗選擇性比的化合物。
還評估了本發(fā)明的化合物的體內(nèi)活性。所選用于評估測試化合物的試驗類型由要用該化合物治療或預防的病理情況，以及要評估測試化合物的施用途徑?jīng)Q定。
例如，為了評估本發(fā)明化合物通過抑制尿激酶減弱腫瘤生長的活性，可使用Jankun等[癌癥研究57:559-563,1997]評估PAI-1的程序。簡單說，將表達高水平的uPA的ATCC細胞系DU145和不表達uPA的LnCap注射入SCID小鼠。建立腫瘤后，根據(jù)化合物體外特性確定的施劑方案施給小鼠測試化合物。Jankun等化合物是水中施用的。每周兩次測量腫瘤體積，進行約5周。如果施用該化合物的動物與接受合適的對照化合物的動物比較，顯示腫瘤體積減小，認為該化合物是活性的。另外，在用DU145細胞注射的動物與用LnCaP細胞注射的動物中，比較化合物的作用，可表明化合物的效果是由于抑制尿激酶還是其它原因。
Billstrm等描述了另一種設(shè)計以評估對氨基苯甲脒，一種可能的尿激酶抑制劑化合物減小腫瘤體積作用的體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ蚚Int.J.Cancer 61:542-547,1995]。
為了評估本發(fā)明的化合物降低轉(zhuǎn)移的發(fā)生或抑制轉(zhuǎn)移的能力，可使用Kobayashi等描述的程序[Int.J.Canc.57:727-733d,1994]。簡單說，將用于選擇高肺部占據(jù)能力的小鼠異種移植體注射入C57B1/6小鼠靜脈內(nèi)(實驗轉(zhuǎn)移)或皮下，進入腹腔壁(自發(fā)轉(zhuǎn)移)?？蓪⒏鞣N濃度的要測試的化合物與腫瘤細胞在Matrigel中混合，然后注射。在腫瘤接種后，1-6日或7-13日每日胃腸內(nèi)注射測試化合物。腫瘤接種3或4周后殺死動物，計算肺部腫瘤集落。對得到數(shù)據(jù)的評估可用于測量實驗化合物的效力、最佳劑量和施用途徑。
可在Rabbani等[Int.J.Canc63:840-845,1995]描述的，用于評估其抑制劑的模型中評估本發(fā)明化合物對減小腫瘤體積和轉(zhuǎn)移的活性。在此，將過度表達uPA的Mat LyLu腫瘤細胞注射入Copenhagen大鼠的肋部。然后將滲透性小型真空泵植入動物體內(nèi)，來連續(xù)施用各種劑量的測試化合物，達3周。在實驗期間評估了實驗和對照動物的腫瘤質(zhì)量和體積，以及轉(zhuǎn)移生長。對得到數(shù)據(jù)的評估可用于測量實驗化合物的效力、最佳劑量和施用途徑。這些作者中的一些在Xing等[癌癥研究57:3585-3593,1997]中描述了一種相關(guān)的方案。
為了評估本發(fā)明的化合物對新生血管形成的抑制劑活性，可使用兔角膜新生血管模型。Avery等[Arch.Ophthalmol 108:1474-1475,1990]描述了麻醉New Zealand白兔，然后進行中央角膜切割，并形成放射狀的角膜囊。將一緩釋前列素片放在囊中，以誘導新生血管形成。胃腸內(nèi)施用測試化合物5日，在該時間殺死動物。通過復查對角膜緣間斷拍攝的照片(可用來計算新生血管反應(yīng)的面積和從而計算邊緣新生血管形成)來評估測試化合物的效果。與合適的對照比較，減小的新生血管面積表明，測試化合物對減少或抑制新生血管形成是有效的。
Min等描述了一種用于評估測試化合物防止血管形成的血管形成模型[癌癥研究56:2428-2433,1996]。C57BL6小鼠接受了含有bFGF(作為血管形成誘導劑)和有或無測試化合物的Matrigel混合物的皮下注射。5日后，殺死動物，對Matrigel栓拍照(在Matrigel栓中可見到新生血管形成)。接受Matrigel和有效量的測試化合物的實驗動物將比對照動物，或接受較少或無效劑量的化合物的動物，顯示較低的新生血管形成。
Crowley等描述了一種設(shè)計為測試化合物限制原發(fā)瘤擴散能力的體內(nèi)系統(tǒng)[Proc.Natl.Acd.Sci.90:5021-5025,1993]。用工程改造，表達CAT(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)的腫瘤細胞(PC3)注射裸鼠。該細胞分泌大量uPA，并顯示飽和量的uPA結(jié)合細胞表面上的uPAR的活性。將要測試減小腫瘤大小和/或轉(zhuǎn)移生長的化合物施給該動物，然后測量腫瘤大小和/或轉(zhuǎn)移生長。另外，不同器官中檢測到的CAT水平提供了測試化合物抑制轉(zhuǎn)移的活性指標；在處理過的動物中，相對于對照動物檢測到組織中較少的CAT，表明較少表達CAT的細胞轉(zhuǎn)移到該組織。
Alonso等描述了設(shè)計以使用據(jù)說是高侵染性的腫瘤細胞系F3II，來評估實驗化合物的尿激酶抑制性能的體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ蚚乳癌研究和治療40:209-223,1996]。該研究小組描述了毒性測定、腫瘤生長、侵襲力、自發(fā)轉(zhuǎn)移、實驗性肺轉(zhuǎn)移的體內(nèi)研究，和血管形成試驗。
首先由L.Ossowski于1998描述的CAM模型(雞胚絨毛尿囊膜模型)[細胞生物學雜志107:2437-2445,1988]，提供了另一種評估測試化合物尿激酶抑制活性的方法。在CAM模型中，腫瘤細胞通過絨毛尿囊膜侵襲是由催化活性uPA的存在決定的。在尿激酶抑制劑存在下，使CAM和腫瘤細胞接觸，導致較少或無腫瘤細胞過膜侵襲。因此，在有和無各種濃度的測試化合物的情況下，用CAM和腫瘤細胞進行CAM試驗。在這些條件下測量腫瘤細胞的侵襲力，以提供化合物尿激酶抑制劑活性的指標。具有尿激酶抑制劑活性的化合物伴有較低的腫瘤侵襲。
也在血管形成的標準試驗(即，對新血管形成的作用)(Brooks,P.C.；Montogamery,A.M.P.；和Cheresh,D.A.，分子生物學方法129:257-269(1999))中使用了CAM模型。根據(jù)該模型，將含有血管形成誘導劑，如堿性成纖維細胞生長因子的濾紙片放在CAM上。該細胞因子擴散入CAM，誘導了局部血管形成，這可用數(shù)種方法，如對直接在濾紙片下的CAM血管分枝點計數(shù)來測量。可用該模型測試本發(fā)明的化合物抑制細胞因子誘導的血管形成的活性?？蓪y試化合物加到含有血管形成誘導劑的濾紙片，然后直接放在膜上，或全身施用。有和/或無測試化合物時的新血管形成程度可用該模型比較。測試化合物存在時較少新血管的形成將指示抗-血管形成活性。由于本發(fā)明的某些化合物作為尿激酶的抑制劑是活性的，這些化合物的抗-血管形成活性可提示尿激酶在血管形成中起了重要作用。
4．藥物學組合物在另一個方面，本發(fā)明包含制備以供儲藏或施用的藥物組合物，其包含在藥物學上可接受的載體中的治療有效量的本發(fā)明化合物。
本發(fā)明化合物的治療有效量將視施藥途徑、要治療的哺乳動物種類，和考慮的特定哺乳動物的生理特性而定。這些因素及其與確定該量的關(guān)系是醫(yī)藥領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的?？尚薷脑摿亢褪┯梅椒?，來實現(xiàn)最佳效果，但將由這些因素，如重量、飲食、配伍藥物狀況和其它醫(yī)學領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到的因素而定。
本發(fā)明化合物的治療有效量將廣泛變化，由所需效果和治療指標決定。通常，劑量將在約0.01mg/kg和100mg/kg體重之間，優(yōu)選約0.01和10mg/kg體重之間。
治療用藥物學上可接受的載體是藥物學領(lǐng)域熟知的，而且在例如Remington’s藥物科學，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中描述。例如，可用生理pH下的無菌鹽水和磷酸緩沖鹽水。可在藥物組合物中提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和甚至調(diào)味劑。例如，可加入作為防腐劑的苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸酯。同上，1449。另外，可用抗氧化劑和懸浮劑。同上。
可配制和使用作為片劑、膠囊或酏劑，用于口腔施藥；栓劑，用于直腸施藥；無菌溶液和懸浮液，用于注射施藥等的本發(fā)明的藥物學組合物。可修改施藥的劑量和方法，來實現(xiàn)最佳效果，但將由這些因素，如重量、飲食、目前藥物狀況和其它醫(yī)學領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到的因素而定。
當施藥是腸道外，如每日靜脈內(nèi)的，可用制備常規(guī)形式的溶液或懸液、適用于在注射前溶解或懸浮在液體中的固體形式，或乳劑形式的可注射藥物組合物。合適的賦形劑是例如水、鹽水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸鈉等。另外如需要，可注射藥物組合物可含有微量無毒性輔助物質(zhì)，如濕潤劑、pH緩沖劑等。如需要，可利用吸收增強制劑(如脂質(zhì)體)。
實用性可為許多用途在體內(nèi)或體外使用本發(fā)明具有尿激酶抑制劑活性和/或減少或抑制血管形成，包括血管形成和新生血管形成的活性的化合物，將在下文描述這些用途中的一些。
本發(fā)明化合物具有尿激酶抑制劑活性，并特異性結(jié)合尿激酶。因此可體外使用這些含有適合連接在固體/凝膠載體上的位點的化合物，進行親和層析，使用常規(guī)親和層析程序從樣品中純化尿激酶或從樣品中除去尿激酶。使用常規(guī)方法，使這些化合物直接或通過合適的連接基載體吸附或偶聯(lián)在親和層析上。見例如，蛋白質(zhì)科學的目前方法，John Wiley&Sons(J.E.Coligan等編，1997)和蛋白純化方案，Humana Press(S.Doonan編，1966)及其中的文獻。
可在體外試驗中用本發(fā)明具有尿激酶抑制劑活性的化合物，測量樣品中的tPA活性。在測量血樣中總纖溶酶原活化活性的試驗中，本發(fā)明具有尿激酶抑制劑活性的化合物將剔除歸因于uPA的纖溶酶原活化部分，其將可計算由于tPA活性的總纖溶酶原活化部分，以及由于uPA活性的部分。用這些試驗監(jiān)測tPA活性，在接受tPA的病人中將更好的控制劑量。還能用這些試驗監(jiān)測組織樣品，如來自活體檢查中的uPA活性水平，或監(jiān)測其中測量纖溶酶原活化活性有幫助的任何臨床情況中的uPA/tPA活性。還可用這些試驗來監(jiān)測纖溶酶原激活物活性，其中病人已用具有纖溶酶原激活物活性的非內(nèi)源化合物，如鏈激酶和葡萄激酶治療。
本發(fā)明化合物可用于體內(nèi)治療將通過降低尿激酶活性改善的病理情況。例如，這些化合物將抑制滑液中uPA-纖溶酶級連的金屬蛋白酶的活化，因而可用于治療關(guān)節(jié)炎。
據(jù)信這些化合物將可用于降低或抑制轉(zhuǎn)移、新生血管形成和腫瘤及其它新生物的胞外基質(zhì)降解。這些化合物將用作治療劑，以治療諸如視網(wǎng)膜疾病、視網(wǎng)膜病和其它情況，包括本文發(fā)明背景和介紹中所述的情況等，以病理性新生血管形成為特征的情況。
本發(fā)明具有尿激酶抑制劑活性的化合物的另一種用途是，作為解毒劑，如果對病人出于某種目的，如溶解血栓，施用了太多的尿激酶。
本發(fā)明化合物由于其對尿激酶抑制引起的抗炎癥效果，從而干涉了細胞黏著或遷移的介導物，可用于治療特征為炎癥的情況。這些抗炎癥用途包括治療中風和器官移植的并發(fā)癥。
本發(fā)明包括預防或治療哺乳動物的一種情況的方法，該哺乳動物被懷疑具有可通過抑制尿激酶活性予以弱化的情況，該方法包含施給所述哺乳動物治療有效量的本發(fā)明的化合物或藥物組合物。
體內(nèi)施用本發(fā)明化合物或藥物組合物，一般在哺乳動物內(nèi)，優(yōu)選是人。體內(nèi)使用時，可用各種方法將該化合物或藥物組合物施給哺乳動物，包括口腔、胃腸內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、直腸內(nèi)、鼻內(nèi)或腹膜內(nèi)，使用各種劑量形式。施藥優(yōu)選口腔，如通過每日服用片劑、膠囊或酏劑。
在實施本發(fā)明的方法中，可單獨或彼此聯(lián)合，或聯(lián)合其它治療性或體內(nèi)診斷劑施用本發(fā)明的化合物。
醫(yī)藥領(lǐng)域技術(shù)人員將明確，本發(fā)明“治療有效量”的化合物或藥物組合物將變化，視年齡、重量和治療的哺乳動物物種、使用的具體化合物、施藥的具體模式和所要的效果和治療指標而定。因為在醫(yī)學領(lǐng)域中這些因素及其與確定該量的聯(lián)系是熟知的，治療有效量水平的確定、實現(xiàn)所要抑制uPA活性的結(jié)果所需的劑量，將在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。通常，本發(fā)明化合物或藥物組合物的施用從較低劑量水平開始，增加劑量，直到達到所要抑制uPA活性的程度的效果，這就確定為治療有效量。對于單獨或作為藥物組合物部分的本發(fā)明化合物，這些劑量是約0.01mg/kg和100mg/kg體重之間，優(yōu)選約0.01和10mg/kg體重之間。
為了幫助理解，現(xiàn)在將進一步用下列實施例說明本發(fā)明。這些關(guān)聯(lián)于本發(fā)明的實施例將當然不會要特別限定本發(fā)明，而且本發(fā)明的這些現(xiàn)在已知或?qū)黹_發(fā)的(在本領(lǐng)域技術(shù)人員的預見范圍內(nèi))的變體，將在本說明書所述和權(quán)利要求的范圍內(nèi)。實施例A．起始材料的制備(見圖1)實施例1N-α-叔丁氧基羰基-Ng-硝基精氨?；?N-甲氧基-N-甲基酰胺的制備 將4-甲基嗎啉(41.2g,407mmol,1.3當量)加到N-α-叔丁氧基羰基-Ng-硝基精氨酸(100克,313毫摩爾)、N,O-二甲基羥基胺鹽酸鹽(61.2克，626毫摩爾，2當量)、EDC(77.9克，407毫摩爾，1.3當量)、和1-羥基苯并三唑(55.1克，407毫摩爾，1.3當量)的無水乙腈(523毫升)溶液中。室溫攪拌反應(yīng)混合物16小時，真空除去溶劑。在乙酸乙酯和水之間分配殘余物。用乙酸乙酯重復萃取水相(2X)。用1N HCl(1X)、水(1X)、飽和碳酸氫鈉(1X)、水(1X)洗滌合并的有機層，然后干燥(硫酸鎂)，過濾并真空濃縮。獲得78％質(zhì)量回收率的白色泡沫狀標題化合物，并不經(jīng)進一步純化使用。產(chǎn)物TLC分析表明了令人滿意的純度。Rf=0.21(10％甲醇/二氯甲烷)。MS(M+H+)=363.0，計算值(MW)=362.2。
1H NMR(400MHz,CDCl3):d1.47(s,9H),1.55-1.68(m,2H),1.71-1.83(br,2H),3.23(s,3H),3.25-3.35(m,1H),3.55-3.68(m,1H),3.75-3.80(s,3H),4.66(t,1H),5.63(d,1H)。
實施例2N-α-叔丁氧基羰基-Ng-硝基精氨醛的制備 在1升3頸圓底燒瓶中的實施例1化合物(25克，68.9毫摩爾，1當量)的無水四氫呋喃(300毫升)溶液中，-78℃,30分鐘在氮氣下滴加1M氫化鉀鋁/四氫呋喃(100毫升，1.45當量)。將反應(yīng)混合物置于-78℃攪拌1小時，然后在室溫下攪拌20到30分鐘。觀察到一層厚漿液。再次將反應(yīng)混合物冷卻到-78℃，緩慢用2M硫酸氫鉀(100毫升)淬滅。濾出沉淀，用四氫呋喃(200毫升)洗滌。真空濃縮合并濾液。用乙酸乙酯和水分配粗殘余物。用0.5N HCl、飽和碳酸氫鈉和鹽水洗滌有機相。用硫酸鎂干燥殘余物并過濾。蒸發(fā)濾液，得到15.9克(76％產(chǎn)率)的白色固體狀標題化合物。Rf=0.13(50％己烷/乙酸乙酯)用TLC判斷所要產(chǎn)物的純度。MS:(M+H+)=304.0，計算值(MW)=303.1。1H NMR(400MHz,CDCl3):d1.47(s,9H),1.55-1.68(m,2H),1.71-1.83(m,2H),3.19-3.35(m,2H),4.41-4.48(m,1H),5.82(s,1H)。
另外，可根據(jù)美國專利號5,731,413的實施例2列出的程序制備標題化合物。實施例3N-α-叔丁氧基羰基-Ng-硝基精氨醛(6-己酸乙酯)環(huán)醇的制備 在實施例2的化合物(32.7克，107.9毫摩爾，1當量)和6-羥基己酸乙酯(86.5克，539.6毫摩爾，5當量)的乙腈(20毫升)的攪拌溶液中加入3N HCl(260微升)。所有反應(yīng)物在室溫下15分鐘后加入溶液。然后攪拌混合物24小時以后，取出一小部分用于TLC和質(zhì)譜，來確定完成度。然后，在反應(yīng)物中加入乙酸酐(55.1克，539.6毫摩爾，5當量)和吡啶(42.7克，539.6毫摩爾，5當量)，來封閉過量的羥基酯接頭。繼續(xù)反應(yīng)過夜。蒸發(fā)殘余物。將殘余物溶于乙酸乙酯中，用1N HCl(1X)，水(1X)，飽和碳酸氫鈉(1X)，水(1X)洗滌，并干燥(硫酸鎂)，過濾并濃縮。用硅膠快速層析純化殘余物，使用25-33％己烷/乙酸乙酯梯度，并得到45.0克粘性油狀的標題化合物(93.7％)。Rf=0.24(50％己烷/乙酸乙酯)。MS(M+H+)=446.0，計算值(MW)=445.2。1H NMR(400MHz,CDCl3):d1.25(t,3H),1.31-1.38(m,2H),1.45(s,9H),1.50-1.83(m,8H；aliph.,b,g),2.25-2.35(m,2H),3.30-3.45(m,2H),3.55-3.65(br,5H),3.75-3.83(br,1H),4.05-4.15(m,2H),4.85(d,1H),5.60(s,1H)。實施例4N-α-叔丁氧基羰基-精氨醛(6-己酸乙酯)環(huán)醇，乙酸鹽的制備 在實施例3的化合物(45.8克，103.0毫摩爾，1當量)的乙醇/水/乙酸(4∶1∶1)(200毫升)溶液中加入10％鈀碳(9.2克，20％重量)。40psi下氫化混合物16小時。過濾溶液，真空蒸發(fā)濾液。將殘余物置于水中，用乙醚(3X)洗滌。用水重新抽提有機層(1X)。合并水相，凍干得到標題化合物(44.7克，94.4％產(chǎn)率)。Rf=0.18(二氯甲烷/甲醇/濃氫氧化銨；25∶5∶1)。MS(M+H+)=401.0，計算值(MW)=4002.2。1H NMR(400MHz,CDCl3):d1.25(t,3H),1.31-1.38(m,2H),1.45(s,9H),1.50-1.83(m,8H；aliph.,b,g),2.25-2.35(m,2H),3.05-3.28(m,1.5H),3.32-3.48(m,2H),3.55-3.61(br,.5H),3.63-3.73(m,1H),4.08-4.15(m,2H),4.89(d,1H),5.14(d,1H)。
實旆例5N-α-叔丁氧基羰基-N-ω-烯丙氧基羰基-精氨醛(6-己酸乙酯)環(huán)醇的制備 在實施例4的化合物(44.7克，97.3毫摩爾，1當量)的二氯甲烷(292毫升)懸液中0℃分步加入1N氫氧化鈉(291.9毫升，291.9毫摩爾，3當量)溶液，來維持pH=11-13。以3部分將氯甲酸烯丙酯(15.3克，126.5毫摩爾，1.3當量)加到反應(yīng)物中。在用TLC和MS監(jiān)測1小時后，用二氯甲烷(3X)萃取混合物，干燥(硫酸鎂)，過濾并蒸發(fā)。立即用硅膠快速層析純化粗產(chǎn)物，使用己烷和乙酸乙酯作為洗脫液。獲得(88％產(chǎn)率)粘性油狀的標題化合物(41.5克)。Rf=0.30(50％己烷/乙酸乙酯)。MS(M+H+)=485.0，計算值(MW)=484.2。1HNMR(400MHz,CDCl3):d1.24(t,3H),1.31-1.38(m,2H),1.45(s,9H),1.50-1.83(m,8H；aliph.,b,g),2.25-2.35(m,2H),2.90-3.12(m,1.5H),3.30-3.45(m,2H),3.55-3.65(br,5H),3.75-3.83(br,1H),4.05-4.15(m,2H),4.57(d,2H),4.83(s,1H),5.25(q,2H),5.90-6.05(m,1H)。
實施例6N-α-叔丁氧基羰基-N-ω-烯丙氧基羰基-精氨醛(6-己酸)環(huán)醇的制備 在實施例5的化合物(40.3克，83.2毫摩爾)的乙醇溶液(83.2毫升)中加入3N氫氧化鋰(55.5毫升、166.4毫摩爾、2當量)。室溫下攪拌21/2小時后，真空濃縮反應(yīng)物。將殘余物溶解在水中，用乙醚(3X)洗滌。將水相用1N HCl酸化到pH=2-3，用二氯甲烷萃取。干燥溶液(硫酸鎂)，過濾，并蒸發(fā)，得到31.5克白色玻璃狀泡沫的標題化合物(83.0％產(chǎn)率)。Rf=0.33(乙酸乙酯)。MS(M+H+)=457.1，計算值(MW)=456.2。1H NMR(400MHz,CDCl3):d1.45(s,9H),1.52-1.87(m,10H；aliph.,b,g),2.32-2.43(m,2H),3.05-3.28(m,1.5H),3.37-3.55(m,2H),3.83(s,1H),4.57-4.65(m,2H),4.88(d,1H),5.31(s,1H),5.90-6.05(m,1H)。
實施例7N-α-叔丁氧基羰基-N-ω-烯丙氧基羰基-精氨醛(6-己?；?氨基甲基化的聚苯乙烯樹脂)環(huán)醇的制備 室溫下，在氨基甲基化的聚苯乙烯樹脂(22.6克，26.2毫摩爾，1當量)中加入溶于二甲基甲酰胺(214毫升)實施例6的化合物(15.5克，34.0毫摩爾，1.3當量)和PyBOP(17.7克，34.0毫摩爾，1.3當量)，然后加入二異丙基乙基胺(4.4克，34.0毫摩爾，1.3當量)。在圓底燒瓶中緩慢攪拌混合物過夜。用大量二氯甲烷和甲醇洗滌樹脂。真空干燥樹脂(取出3毫克干燥樹脂樣品，用于Kaiser試驗)，并用二甲基甲酰胺/乙酸酐/三乙基胺(8∶1∶1)在環(huán)境溫度中乙?；?0分鐘。再次用有機溶劑(二氯甲烷和甲醇)連續(xù)洗滌樹脂，并真空干燥，得到標題化合物(40.8克；92.0％產(chǎn)率重量)。Kaiser試驗(O.D:99％偶聯(lián))；樹脂取代度(約0.75毫摩爾/克)。
B．固相制備較少量化合物的通用程序固相合成可用于生產(chǎn)小量本發(fā)明的某種化合物。如肽的常規(guī)固相合成，用于固相合成肽基精氨醛的反應(yīng)器是由一種至少一個表面對溶劑和溶解的試劑可滲透，但對所選篩尺寸的合成樹脂不可滲透的容器構(gòu)成的。這些反應(yīng)器包括有一個砂芯玻璃燒結(jié)的玻璃固相反應(yīng)容器，具有燒料的聚丙烯管或柱，或由Irori Inc.,San Diego CA制造的反應(yīng)器KansTM。所選反應(yīng)器的類型由所需固相樹脂的體積決定，可在合成的不同階段使用不同反應(yīng)器類型。
實施例8描述了固相合成少量本發(fā)明化合物的通用程序。見圖2。實施例9到15描述了修改該過程得到本發(fā)明其它化合物。實施例8異丁氧基羰基-D-絲氨?；?L-丙氨酰基-精氨醛(化合物1)的固相合成 步驟1N-ω-烯丙氧基羰基-精氨醛(6-己?；?氨基甲基化的苯乙烯樹脂)環(huán)醇的制備 在60毫升固相反應(yīng)容器中加入2.0克實施例7的化合物(0.6-0.7meq/g取代度)和二氯甲烷(12毫升)、三氟乙酸(6毫升)和硫代苯甲醚(2毫升)的混合物。冒泡通氮氣15分鐘。從樹脂中抽出反應(yīng)物，連續(xù)用二氯甲烷(2×20毫升)、二異丙基乙基胺(20毫升)、二氯甲烷(2×20毫升)、二異丙基乙基胺(20毫升)、二氯甲烷(2×20毫升)、二異丙基乙基胺(2×20毫升)、和乙醚(2×20毫升)洗滌樹脂。真空儲藏標題化合物。樹脂的水合茚三酮測試顯示除去t-叔丁氧基羰基基團產(chǎn)生的游離胺的暗藍色特征。
步驟2N-α-Fmoc-N-ω-烯丙氧基羰基-精氨醛(6-己?；?氨基甲基化的聚苯乙烯樹脂)環(huán)醇的制備 將步驟1的化合物(2.1克)置于固相反應(yīng)容器中，在其中加入Fmoc-丙氨酸(1克，3.2毫摩爾)、1-羥基苯并三唑(0.5克，3.2mmol)、TBTU(1.024克，3.2mmol)和二異丙基乙基胺(600微升，3.4毫摩爾)的二甲基甲酰胺溶液(15-20毫升)。室溫氮氣冒泡通過反應(yīng)器2小時。從樹脂中排干試劑，連續(xù)用二甲基甲酰胺(2×20毫升)、二氯甲烷(2×20毫升)、二甲基甲酰胺(2×20毫升)、二氯甲烷(2×20毫升)和乙醚(2×20毫升)洗滌樹脂。真空干燥樹脂，取出小量用于水合茚三酮比色分析，其顯示產(chǎn)生標題化合物中99.5％的偶聯(lián)效率。
步驟3丙氨?；?N-ω-烯丙氧基羰基-精氨醛(6-己?；?氨基甲基化的聚苯乙烯樹脂)環(huán)醇的制備 在室溫下，用氮氣攪動，用50％哌啶的二甲基甲酰胺(20毫升)處理步驟2的化合物30分鐘。如上洗滌樹脂，真空干燥，得到標題化合物。對小量進行水合茚三酮試驗，得到暗藍色樹脂和溶液，顯示高去保護產(chǎn)率。
步驟4N-α-Fmoc-D-絲氨?；?O-叔丁基)-丙氨?；?N-ω-烯丙氧基羰基-精氨醛(6-己?；?氨基甲基化的聚苯乙烯樹脂)環(huán)醇的制備 將步驟3的化合物(100毫克)置于Irori KanTM反應(yīng)容器中。將容器置于含有二甲基甲酰胺(4毫升)、N-α-Fmoc-D-絲氨酸(O-叔丁基)(184毫克，0.48毫摩爾)、1-羥基苯并三唑(73毫克，0.48毫摩爾)、TBTU(154毫克、0.48毫摩爾)和二異丙基乙基胺(84微升，0.48毫摩爾)的20毫升小瓶中。在搖床上搖動反應(yīng)器3小時。排干反應(yīng)器，連續(xù)用二甲基甲酰胺(2×3毫升)、二氯甲烷(2×3毫升)、二甲基甲酰胺(2×3毫升)、二氯甲烷(2×3毫升)、異丙醇(2×3毫升)、二氯甲烷(2×3毫升)、異丙醇(2×3毫升)和乙醚(2×3毫升)洗滌。真空干燥樹脂，得到標題化合物。
步驟5D-絲氨酰基(O-叔丁基)-丙氨?；?N-ω-烯丙氧基羰基-精氨醛(6-己?；?氨基甲基化的聚苯乙烯樹脂)環(huán)醇的制備 用50％哌啶的二甲基甲酰胺(5毫升)溶液在20毫升試管中室溫處理含有步驟4的化合物的容器45分鐘，一面在搖床上搖動。如上洗滌樹脂，真空干燥，得到步驟5的化合物。對小量進行水合茚三酮試驗，得到暗藍色樹脂和溶液，顯示高去保護產(chǎn)率。
步驟6D-絲氨?；?O-叔丁基)丙氨?；?N-ω-烯丙氧基羰基-精氨醛(6-己?；?氨基甲基化的聚苯乙烯樹脂)環(huán)醇的氨基甲酸酯類似物的制備。如 將含有步驟5的化合物的容器，以及其它含有相關(guān)樹脂結(jié)合類似物(見實施例9到14，下文)的容器，分別放置在含有0.12M各種氯甲酸酯(包括氯甲酸異丁酯)的二甲基甲酰胺(5-10毫升)溶液的20毫升試管中。加入二異丙基乙基胺(105-210微升，0.6-1.2毫摩爾)，振搖試管2.5小時。排干所有試管，連續(xù)用二甲基甲酰胺(2×3毫升)、二氯甲烷(2×3毫升)、二甲基甲酰胺(2×3毫升)、二氯甲烷(2×3毫升)、異丙醇(2×3毫升)、二氯甲烷(2×3毫升)、異丙醇(2×3毫升)和乙醚(2×3毫升)。真空干燥KansTM，包括含有異丁氧基羰基-D-絲氨酰基(O-叔丁基)丙氨?；?N-ω-烯丙氧基羰基-精氨醛(6-己酰基-氨基甲?；木郾揭蚁渲?環(huán)醇的樹脂。
步驟7:D-絲氨?；?O-叔丁基)-丙氨?；比?6-己?；?氨基甲基化的聚苯乙烯樹脂)環(huán)醇的制備，如 對于本發(fā)明的幾種化合物，通過將38個容器的集合置于250毫升聚丙烯瓶中，加入甲基亞砜(10毫升)、四氫呋喃(10毫升)、1N HCl(2.5毫升)和嗎啉(25毫升)的混合物，同時從步驟5的產(chǎn)物上除去烯丙氧基保護基團。然后加入四-三苯基膦合鈀(0.87克)，室溫振搖瓶子4小時。排干容器，包括含有異丁氧基羰基-D-絲氨酰基(O-叔丁基)-丙氨?；比?6-己?；?氨基甲基化的聚苯乙烯樹脂)環(huán)醇的，連續(xù)用二甲基甲酰胺(2×3毫升)、二氯甲烷(2×3毫升)、二甲基甲酰胺(2×3毫升)、二氯甲烷(2×3毫升)、異丙醇(2×3毫升)、二氯甲烷(2×3毫升)、異丙醇(2×3毫升)和乙醚(2×3毫升)洗滌，真空干燥，分別得到容器中的標題化合物。
步驟8異丁氧基羰基-D-絲氨?；?丙氨酰基-精氨醛的制備 將含有異丁氧基羰基-D-絲氨?；?O-叔丁基)-丙氨酰基精氨醛(6-己?；?氨基甲基化的聚苯乙烯樹脂)環(huán)醇的容器倒到含有三氟乙酸/二氯甲烷/水(1.5毫升6∶3∶1的混合物)的Whatman聚丙烯微型柱上。室溫振搖該柱4小時。將反應(yīng)溶液排到試管中，用二氯甲烷和水洗滌樹脂。將洗滌混合物和反應(yīng)混合物收集在同一試管中，攪動混合物，然后使其分成兩相。取出水層，過濾。用半制備級反相HPLC純化標題化合物(化合物1)，凍干，稱重，并用HPLC和質(zhì)譜分析。在實施例36到43中提供了另一種合成化合物1的途徑。
實施例9芐氧基羰基-D-絲氨酰基-丙氨?；?精氨醛的固相合成(化合物2)
按照實施例8的步驟1到4和7到8制備了芐氧羰基-D-絲氨酰基-丙氨?；?精氨醛(化合物2)，在步驟4中用Cbz-D-絲氨酸(O-叔丁基)代替Fmoc-D-絲氨酸(O-叔丁基)。
實施例10化合物3到9和35到40的固相合成根據(jù)實施例8的步驟1到8制備了下列化合物，用標出的代替步驟6中的氯甲酸異丁酯
實施例11芴基甲氧基羰基-D-絲氨?；?丙氨?；?精氨醛(化合物10)的固相合成
根據(jù)實施例8的步驟1到4和步驟7和8制備了芴基甲氧基羰基-D-絲氨?；?丙氨酰基-精氨醛(化合物10)。
實施例12化合物11到18的固相合成根據(jù)實施例8的步驟1-4和7-8制備了化合物11-18，用Cbz-D-絲氨酸(O-叔丁基)代替步驟4中的Fmoc-D-絲氨酸(O-叔丁基)，和用標出的代替物在步驟2中代替Fmoc-丙氨酸。
實施例13化合物19到23的固相合成根據(jù)實施例8的步驟1-4和7-8制備了化合物19-23，用標出的代替物代替步驟4中的Fmoc-D-絲氨酸(O-叔丁基)。
實施例14化合物24、25和33的固相合成根據(jù)實施例8的步驟1-4和7-8制備了化合物24、25和33，用Cbz-D-異蘇氨酸(O-叔丁基)代替步驟4中的Fmoc-D-絲氨酸(O-叔丁基)，和標出的代替物代替步驟2中的Fmoc-丙氨酸。
實施例15化合物26到27的固相含成根據(jù)實施例8的步驟1-4和7-8制備了化合物26和27，用Fmoc-脯氨酸代替步驟2中的Fmoc-丙氨酸，和標出的代替物代替步驟3中的Fmoc-D-絲氨酸(O-叔丁基)。
實施例16化合物41到43的固相合成根據(jù)實施例8的步驟1-4和7-8制備了化合物41到43，用N-α-Cbz-N-β-Fmoc-D-2,3-二氨基丙酸代替步驟4中的Fmoc-D-絲氨酸(O-叔丁基)，和標出的代替物代替步驟6中的各氯甲酸酯
C．某些化合物的其它合成途徑(ⅰ)實施例17到21描述了苯磺?；?D-Ser-L-Ala-L-Arg-al，三氟乙酸鹽(化合物28)的制備。見圖3。
實施例17D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe，乙酸鹽的合成
合并N-α-Cbz-D-絲氨酸(Bachem,4.97克，16.8毫摩爾)，丙氨酸甲酯，鹽酸鹽(Novabiochem,4.7克，33.7毫摩爾)、EDC(6.5克，33.7毫摩爾)，和1-羥基苯并三唑(2.6克，16.8毫摩爾)，并加入乙腈(67毫升)。然后攪拌漿液10分鐘，加入二異丙基乙基胺(14.4毫升，84毫摩爾)，再攪拌得到的澄清混合物18小時。減壓除去溶劑，將殘余物懸浮在乙酸乙酯(500ml)中。用0.5MHCl(2×100毫升)、飽和碳酸氫鈉(2×100毫升)和鹽水(100毫升)洗滌溶液。然后用硫酸鈉干燥有機層。真空除去溶劑，得到定量產(chǎn)率的Cbz-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe，作為反相(C18)HPLC的單峰(tR=16.9,0.1％三氟乙酸在5-75％乙腈水溶液中，20分鐘以上)。然后將Cbz-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe溶解在乙醇/乙酸/水(150毫升的4∶1∶1混合物)。用氮氣充滿燒瓶，加入10％鈀碳(1.5克)。45psi氫化該混合物2小時。濾去鈀碳催化劑，減壓除去溶劑，得到4.58克95％產(chǎn)率的標題化合物，作為反相(C18)HPLC的單峰(tR=8.0分鐘，0.1％三氟乙酸在5-75％乙腈水溶液中，20分鐘以上)，MS(M+H=247.2)。實施例18苯磺?；?D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe的合成 在實施例17的化合物(1.0克，3.3毫升)的乙腈(13毫升)攪拌漿液中加入苯磺酰氯(0.87克，4.9毫摩爾)。在該混合物中以5部分用1小時加入二異丙基乙基胺(1.67毫升，9.8毫摩爾)。將混合物再攪拌1小時。減壓除去溶劑，將殘余物懸浮在乙酸乙酯(100毫升)中。用0.5M HCl(2×10ml)、飽和碳酸氫鈉(2×10毫升)和鹽水(1×10毫升)洗滌溶液。然后用硫酸鎂干燥，減壓除去溶劑。用快速層析，用50％己烷/乙酸乙酯洗脫，純化殘余物，得到0.54克，1.4毫摩爾產(chǎn)率為43％的產(chǎn)物。產(chǎn)物是反相(C18)HPLC的單峰(tR=20.2分鐘，0.1％三氟乙酸于5-75％乙腈水溶液中，20分鐘以上)。1H NMR(CD3OD):7.5-7.9ppm(m,5H),4.3ppm(q,1H),3.9ppm(t,1H),3.7(s,3H),3.4ppm(m,1H),3.5ppm(m,1H),1.3ppm(d,3H),1.05ppm(s,9H)。
實施例19苯磺?；?D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OH的合成 在實施例18化合物(0.53克，1.4毫摩爾)的甲醇溶液(9毫升)中加入1.0M氫氧化鋰(3.0毫升，3毫摩爾)。攪拌18小時后，將反應(yīng)混合物倒到10毫升DOWEX(50×8-400)離子交換樹脂柱上，用甲醇/水(60毫升1∶1混合物)洗脫。減壓泵去甲醇，凍干剩余水，得到0.49克，1.3毫摩爾(95％)標題化合物，作為反相(C18)HPLC的單峰(tR=13.5分鐘，0.1％三氟乙酸于5-75％乙腈水溶液中，20分鐘以上)。1H NMR(CD3OD):7.9ppm(d,2H),7.6ppm(t,1H),7.5ppm(t,2H),4.25ppm(q,1H),3.9(t,1H),3.5ppm(m,1H),3.4ppm(m,1H),1.3ppm(d,3H),1.075ppm(s,9H)。
實施例20苯磺酰基-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-Ng-硝基精氨醛乙基環(huán)醇的合成 混合實施例19的化合物(0.48克，1.3毫摩爾)、L-Ng-硝基精氨醛乙基環(huán)醇，鹽酸鹽(0.41克，1.5毫摩爾)、EDC(0.37克，1.9毫摩爾)，和1-羥基苯并三唑(0.20克，1.3毫摩爾)并加入乙腈(5毫升)。攪拌得到的漿液10分鐘后，加入二異丙基乙基胺(1.10毫升，84毫摩爾)，將得到的澄清混合物再攪拌18小時。減壓除去溶劑，將殘余物懸浮在乙酸乙酯(100毫升)中。用0.5MHCl(2×10ml)、飽和碳酸氫鈉(2×10毫升)和鹽水(1×10毫升)洗滌溶液。用硫酸鎂干燥有機層，真空除去溶劑，得到產(chǎn)率為95％的0.72克標題化合物。產(chǎn)物是反相(C18)HPLC的單峰(tR=15.2分鐘，0.1％三氟乙酸于5-75％乙腈水溶液中，20分鐘以上)，MS(M+H=371)。
實施例21苯磺酰基-D-Ser-L-Ala-L-Arg-al，三氟乙酸鹽(化合物28)的合成 在乙醇/乙酸/水(24.5毫升4∶1∶1的混合物)中的10％鈀碳(250毫克)上以50psi氫化實施例20的化合物(0.72克，1.23毫摩爾)18小時。過濾催化劑，從濾液真空除去溶劑，得到定量產(chǎn)率的芐基磺?；?D-Ser(O-t-Bu)-L-Ala-L-精氨醛乙基環(huán)醇，攪拌1小時，作為反相(C18)HPLC的單峰(tR=12.8分鐘，0.1％三氟乙酸于5-75％乙腈水溶液中，20分鐘以上)，和MS(M+H=541)。用6MHCl(12.25ml)處理芐基磺酰基-D-Ser(O-t-Bu)-L-Ala-L-精氨醛乙基環(huán)醇，攪拌1小時，然后用6.5M乙酸銨中和到pH4。將該材料直接荷載到制備級HPLC柱上，用0-20％乙腈水溶液梯度洗脫，凍干后得到88毫克15％產(chǎn)率的標題化合物。標題化合物具有反相(C18)HPLC的三個峰(tR=8.2分鐘，9.2分鐘和9.5分鐘，0.1％三氟乙酸于5-50％乙腈水溶液中，20分鐘以上)，MS(M+H=457)。
(ⅱ)實施例22到26描述了芐基磺酰基-D-Ser-L-Ala-L-Arg-al，三氟乙酸鹽(化合物29)的合成。 實施例22芐基磺酰基-D-Ser(O-t-Bu)-OMe的合成 在D-絲氨酸(O-t-Bu)甲酯，鹽酸鹽(2.07克，9.8毫摩爾)的乙腈(39毫升)攪拌溶液中，加入α-甲苯磺酰氯(1.86克，9.8毫摩爾)。在該混合物中分5部分在1小時中加入二異丙基乙基胺(3.7毫升，21.5毫摩爾)。再攪拌混合物1小時。減壓除去溶劑，將殘余物懸浮在乙酸乙酯(100毫升)中。用0.5MHCl(2×10ml)、飽和碳酸氫鈉(2×10ml)、和鹽水(1×10ml)洗滌溶液。用硫酸鈉干燥有機層，真空除去溶劑，得到產(chǎn)率為88％的標題化合物2.84克。Rf=0.4(4∶1乙酸乙酯∶己烷)。
實施例23芐基磺?；?D-Ser(O-t-Bu)-OH的合成 在實施例22的化合物的(2.66克，8.1毫摩爾)的攪拌甲醇(54毫升)溶液中加入1.0M氫氧化鋰(17.8毫升，17.8毫摩爾)。攪拌反應(yīng)混合物18小時，然后倒到10毫升DOWEX(50×8-400)離子交換柱上，用甲醇∶水(60毫升的1∶1混合物)洗脫。減壓除去甲醇，凍干剩余水溶液，得到2.47克97％產(chǎn)率的標題化合物。tR=14.8分鐘(0.1％三氟乙酸的5-75％乙腈水溶液，20分鐘)。實施例24芐基磺?；?D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe的合成 混合實施例23的化合物(1.0克，3.2毫摩爾)、丙氨酸甲酯、鹽酸鹽(Novabiochem,0.89克，6.3毫摩爾)、EDC(1.22克，6.3毫摩爾)、和1-羥基苯并三唑(0.49克，3.2毫摩爾)，并加入乙腈(13毫升)。攪拌得到的漿液10分鐘后，加入二異丙基乙基胺(2.71ml,15.8mmol)，再攪拌得到的澄清混合物18小時。減壓除去溶劑，將殘余物懸浮在乙酸乙酯(100毫升)中。用0.5MHCl(2×10毫升)、飽和碳酸氫鈉(2×10毫升)和鹽水(1×10毫升)洗滌溶液。然后用硫酸鈉干燥有機層，真空除去溶劑，得到1.22克產(chǎn)率為97％的標題化合物。tR=16.2分鐘(0.1％三氟甲酸的5-75％乙腈水溶液，20分鐘)。
實施例25芐基磺?；?D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OH的合成 在實施例24的化合物(1.22克、3.1毫摩爾)的甲醇(22毫升)溶液中，加入1M氫氧化鋰(7.2毫升，7.2毫摩爾)。攪拌18小時后，將反應(yīng)混合物倒到10毫升DOWEX(50×8-400)離子交換樹脂柱上，用甲醇∶水(60毫升的1∶1混合物)洗脫。減壓除去甲醇，凍干水溶液，得到1.16克產(chǎn)率為91％的標題化合物。tR=13.2分鐘(0.1％三氟甲酸的5-75％乙腈水溶液，20分鐘)。
實施例26芐基磺?；?D-Ser-Ala-Arg-al，三氟乙酸鹽(化合物29)的合成 從實施例25的化合物根據(jù)實施例20和21的程序，在實施例20描述的程序中用實施例25的化合物代替實施例19的化合物，制備了標題化合物。
(ⅲ)實施例27到34描述了異丁氧基羰基-D-Ser-Ala-Arg-CO-苯乙基酰胺，三氟乙酸鹽(化合物30)的合成。見圖4。 實施例27N-α-叔丁氧基羰基-Ng-硝基Arg-COH苯乙基酰胺的合成 混合N-α-叔丁氧基羰基-Ng-硝基Arg-COH-COOH(1.079,3mmol)(根據(jù)美國專利號5,371,072，實施例2到5中的程序制備)、苯乙基胺(38毫升，3毫摩爾)、BOP(1.35克，3毫摩爾)和1-羥基苯并三唑(0.23克，1.5毫摩爾)，加入二甲基甲酰胺(122毫升)。攪拌該混合物10分鐘，然后加入4-甲基嗎啉(2.01毫升，18毫摩爾)，再攪拌得到的混合物18小時。減壓除去溶劑，將殘余物懸浮在100毫升乙酸乙酯中。溶液用0.5M HCL(2×10ml)、飽和碳酸氫鈉(2×10毫升)、和鹽水(1×10ml)洗滌。然后用硫酸鈉干燥有機層，減壓除去溶劑。用快速層析純化殘余物，用乙酸乙酯∶己烷(4∶1)洗脫，得到1.22克產(chǎn)率為89％的標題化合物。tR=13.2分鐘和14.1分鐘(0.1％三氟甲酸的5-75％乙腈水溶液，20分鐘)。
實施例28叔丁氧基羰基-Ala-Ng-硝基Arg-COH苯乙基酰胺的合成 在攪拌的實施例27的化合物(1.229,2.7mmol)乙酸乙酯溶液(10毫升)中加入5MHCl的乙酸乙酯溶液(10毫升)。2小時后，濾出形成的固體，干燥，得到定量產(chǎn)率的Ng-硝基Arg-COH-苯乙基胺，鹽酸鹽，它與叔丁氧基羰基-Ala-OH(Novabiochem,0.77克，4.1毫摩爾)、EDC(2.4克，5.4毫摩爾)和1-羥基苯并三唑(0.42克，2.7毫摩爾)；然后加入乙腈(11毫升)。攪拌該漿液狀混合物10分鐘，然后加入二異丙基乙基胺(2.3毫升，13.55毫摩爾)。再攪拌得到的澄清混合物18小時。減壓除去溶劑，將殘余物懸浮在100毫升乙酸乙酯中。溶液用0.5M HCL(2×10ml)、飽和碳酸氫鈉(2×10毫升)、和鹽水(1×10ml)洗滌。然后用硫酸鈉干燥有機層，真空除去溶劑，得到1.34克產(chǎn)率為95％的標題化合物。tR=13.0分鐘和13.6分鐘(0.1％三氟甲酸的5-75％乙腈水溶液，20分鐘)。實施例29HCl-Ala-Ng-硝基Arg-COH-苯乙基酰胺的合成 將實施例28的化合物(1.34克，2.6毫摩爾)溶于10毫升乙酸乙酯中。在該混合物中加入10毫升5M鹽酸的乙酸乙酯溶液，攪拌得到的混合物。2小時后，濾出形成的固體，干燥，得到1.188克98％產(chǎn)率的標題化合物。
實旅例30叔丁氧基羰基-D-Ser(OBn)-Ala-Ng-硝基Arg-COH-苯乙基酰胺的合成 混合實施例29的化合物(1.18克，2.4毫摩爾)、叔丁氧基羰基-D-絲氨酸芐酯(Novabiochem,1.089,3.6mmol)、EDC(2.15克，4.9毫摩爾)，和1-羥基苯并三唑(0.37克，2.4毫摩爾)，加入乙腈。在該漿液中以10分鐘加入二異丙基乙基胺(2.1毫升，15毫摩爾)，攪拌得到的澄清混合物18小時。減壓除去溶劑，將殘余物懸浮在100毫升乙酸乙酯中。溶液用0.5M HCL(2×10ml)、飽和碳酸氫鈉(2×10毫升)、和鹽水(1×10ml)洗滌。然后用硫酸鈉干燥有機層，真空除去溶劑，得到1.56克產(chǎn)率為92％的標題化合物。tR=16.0分鐘和16.5分鐘(0.1％三氟甲酸的5-75％乙腈水溶液，20分鐘)。
實施例31HCl-D-Ser(OBn)-Ala-Ng-硝基Arg-COH-苯乙基酰胺的合成 在實施例30的化合物(1.5克，2.1毫摩爾)的乙酸乙酯(10毫升)溶液中加入5MHCl的乙酸乙酯(10毫升)溶液。攪拌2小時后，濾出形成的固體，干燥，得到1.31克產(chǎn)率為98％的標題化合物。tR=11.8分鐘和12.3分鐘(0.1％三氟甲酸的5-75％乙腈水溶液，20分鐘)。
實施例32異丁氧基羰基-D-Ser(OBn)-Ala-Ng-硝基Arg-COH-苯乙基酰胺的合成 在實施例31化合物(1.0克，1.6毫摩爾)的攪拌乙腈(6毫升)溶液中，加入氯甲酸異丁酯(0.225毫升，1.8毫摩爾)、二異丙基乙基胺(0.81毫升，4.74毫摩爾)；攪拌該混合物2小時。減壓除去溶劑，將剩余物懸浮在乙酸乙酯(100毫升)中。用0.5M HCL(2×10ml)、飽和碳酸氫鈉(2×10毫升)、和鹽水(1×10ml)洗滌溶液。然后用硫酸鈉干燥有機層，減壓除去溶劑，殘留物用快速層析純化，用乙酸乙酯/己烷(4∶1)洗脫，得到0.94克產(chǎn)率為85％的標題化合物。tR=20.2分鐘和21.2分鐘(0.1％三氟甲酸的25-45％乙腈水溶液，20分鐘)。
實施例33異丁氧基-D-Ser(OBn)-Ala-Ng-硝基Arg-CO-苯乙基酰胺的制備
將實施例32的化合物(0.1克，0.143毫摩爾)溶于DMSO(1.4毫升)。加入EDC(0.14克，0.714毫摩爾)和二氯乙酸(0.12毫升，1.43毫摩爾)，攪拌混合物1小時。然后將反應(yīng)混合物倒入乙酸乙酯(50毫升)，用0.5M HCL(2×10ml)、飽和碳酸氫鈉(2×10毫升)、和鹽水(1×10ml)洗滌。然后用硫酸鈉干燥有機層，減壓除去溶劑。用快速層析純化殘余物，用乙酸乙酯/己烷(4∶1)洗脫，得到68毫克68％產(chǎn)率的標題化合物。Rf=0.32(4∶1乙酸乙酯/己烷)實施例34異丁氧基羰基-D-Ser-Ala-Arg-CO-苯乙基酰胺，三氟乙酸鹽的制備 將實施例33的化合物(68毫克，0.1毫摩爾)和苯甲醚(1毫升)加到HF容器中。用HF(10毫升)-20℃處理混合物并攪拌。30分鐘后，蒸發(fā)HF。將殘余物懸浮在20％乙酸中，用乙醚洗滌(3X)。凍干水層。用反相制備級HPLC純化粗凍干物(0.1％三氟甲酸的0-40％乙腈水溶液，C-18反相)，凍干，得到14.4g標題化合物，產(chǎn)率26％。tR=12.5分鐘(0.1％三氟乙酸的5-75％乙腈水溶液，20分鐘)和MS(M+H=564.5)。
(ⅳ)實施例35到40描述了另一種制備化合物1的合成途徑。
實施例35異丁氧基羰基-D-Ser(O-t-Bu)-OMe的合成 在HCl-D-Ser(O-t-Bu)-OMe(15g,71mmol,Bachem)的四氫呋喃(200毫升)攪拌均勻溶液中加入飽和碳酸氫鈉(80毫升)、氯甲酸異丁酯(19.45克，142毫摩爾)。分層，用乙酸乙酯(50毫升)洗滌水層。合并有機相，減壓除去溶劑。將殘余物懸浮在乙酸乙酯(100毫升)中，用1MHCL(100ml)、飽和碳酸氫鈉(100毫升)、和鹽水(100ml)洗滌。用硫酸鎂干燥有機層，用脫色碳處理(如以商品名Darco出售的)，過濾，減壓除去溶劑，得到定量產(chǎn)率的標題化合物。Rf=0.3(20％乙酸乙酯/己烷)。
實施例36異丁氧基羰基-D-Ser(O-t-Bu)-OH的合成 在實施例35的化合物(19.51克，70毫摩爾)的四氫呋喃(78毫升)攪拌溶液中加入氫氧化鋰(78毫摩爾，3.28克)。劇烈攪拌反應(yīng)混合物3小時，直到用TLC(20％乙酸乙酯/己烷)觀察不到起始材料。用濃鹽酸酸化溶液至ph~2，減壓除去溶劑。將粗產(chǎn)物懸浮在乙酸乙酯中，用飽和碳酸氫鈉抽提(2X,75毫升)。用6M HCl酸化合并的碳酸氫鈉洗液，用乙酸乙酯(2×100ml)萃取分離的油。用硫酸鎂干燥合并的有機層，用Darco處理，過濾，減壓除去溶劑，得到定量產(chǎn)率的標題化合物。Rf=0.01(20％乙酸乙酯溶于己烷)。實施例37異丁氧基羰基-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe的合成 在實施例36的化合物(16.5克，63毫摩爾)、HCl-Ala-OMe(10.6克，85毫摩爾)、1-羥基苯并三唑(10.2克，76mmol)和EDC(16.33克，85mmol)的乙腈(280毫升)0℃溶液中，加入4-甲基嗎啉(35毫升，315毫摩爾)。0℃攪拌該混合物1小時，然后在環(huán)境溫度下攪拌72小時。減壓除去溶劑，將得到的殘余物懸浮在乙酸乙酯(300毫升)和1MHCl(350毫升)中。分離水層，用乙酸乙酯(300毫升)洗滌。合并合并的乙酸乙酯層，用1M HCL(300ml)、飽和碳酸氫鈉(400毫升)、和鹽水(200ml)洗滌。用硫酸鎂干燥有機層，用Darco處理，過濾，減壓除去溶劑，得到21.48克標題化合物(產(chǎn)率98％)。
實施例38異丁氧基羰基-D-Ser-Ala-OH的合成 將實施例37的化合物(21克，58毫摩爾)溶于三氟乙酸(110毫升)；攪拌得到的混合物35分鐘。在冰浴上冷卻溶液，加入飽和碳酸氫鈉(630毫升)，然后用45分鐘加入固體碳酸氫鈉(7克)，直到得到pH=7。用乙酸乙酯(3×250ml)萃取水層，合并有機萃取液，用硫酸鎂干燥，用Darco處理，過濾，真空除去溶劑，得到定量產(chǎn)率的異丁氧基羰基-D-Ser-Ala-OMe。
在粗殘余物的四氫呋喃(68毫升)攪拌溶液中，加入氫氧化鋰(2.7克，64毫摩爾，1.1當量)水溶液(17毫升)。劇烈攪拌反應(yīng)混合物0.5小時，直到用TLC(9∶1二氯甲烷/異丙醇)觀察不到起始材料。用6M HCl(13ml)酸化溶液至pH~2，減壓除去溶劑。將粗產(chǎn)物懸浮在乙酸乙酯(400毫升)和水(50毫升)中。用乙酸乙酯(200毫升)萃取水層。用硫酸鎂干燥合并的有機層，過濾，真空除去溶劑，得到13.94克標題化合物(86％產(chǎn)率)。Rf=0.3(90∶30∶5氯仿/甲醇/乙酸)。
實施例39異丁氧基羰基-D-Ser-Ala-Ng-硝基Arg-O(乙基環(huán)醇)的合成 在2,6-二甲基吡啶(30.5毫升，272毫摩爾)的乙腈(520毫升)的機械攪拌的溶液中，在0℃加入L-Ng-硝基精氨醛乙基環(huán)醇，鹽酸鹽(16.44克，61毫摩爾)。在該混合物中，加入實施例39的化合物(13.94克，50.5毫摩爾)的乙腈(200毫升)溶液，然后加入1-羥基苯并三唑(8.32克，33毫摩爾)?？焖贁嚢璧玫降幕旌衔铩Ｒ?5分鐘分小部分加入EDC(12.9克，67毫摩爾)。除去冰浴，再攪拌混合物69小時。減壓濃縮溶液，將殘余物溶于乙酸乙酯(300毫升)和6MHCl(200毫升)中。濾出得到的沉淀并干燥，得到批號Ⅰ。分離濾液各層，用1MHCL(200ml)洗滌有機層。用NaCl飽和合并的水層，用乙酸乙酯萃取(300毫升)。用飽和碳酸氫鈉(300毫升)和鹽水(150毫升)洗滌合并有機層，用硫酸鎂干燥，減壓除去溶劑，得到批號Ⅱ。用20％異丙醇的二氯甲烷溶液(2×150ml)萃取碳酸氫鈉洗液。用硫酸鎂干燥合并的有機層，減壓除去溶劑，得到批號Ⅲ。分別將批號Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ溶解在最小量熱乙腈中，冷卻過夜。過濾得到的固體并干燥，得到批號Ⅰ(4.15g)、批號Ⅱ(6.63g)、和批號Ⅲ(0.3克)。用TLC和1NMR鑒定批號Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。標題化合物的合并產(chǎn)率是11.08克(45％產(chǎn)率)。實施例40異丁氧基羰基-D-Ser-Ala-Arg-al，三氟乙酸鹽(化合物1)的合成 在實施例39的化合物的乙醇/乙酸(230毫升的1∶1混合物)溶液中加入10％鈀碳(5.74克)；加熱混合物至48℃。45分鐘后，加入甲酸銨(8.82克，140毫摩爾)的水(9毫升)溶液。攪拌混合物3小時，冷卻并過濾。用乙醇洗滌殘余物，減壓除去溶劑。將殘余物溶于水(250毫升)并凍干，得到定量產(chǎn)率的異丁氧基羰基-D-Ser-Ala-L-精氨醛環(huán)醇。tR=12分鐘，0.1％三氟甲酸的15-25％乙腈水溶液，20分鐘。
在0℃的異丁氧基羰基-D-Ser-Ala-L-精氨醛乙基環(huán)醇中，加入冷的6MHCl(115毫升)。攪拌該混合物50分鐘。除去冰浴，在環(huán)境溫度下攪拌反應(yīng)混合物2小時。此后，重新在冰浴上冷卻溶液，加入乙酸鈉(100克)的水(200毫升)溶液。過濾溶液，用制備級HPLC(用0.1％三氟甲酸分步梯度為10,18,30,50％乙腈水溶液，C-18反相柱)純化，得到三批標題化合物LotⅠ(1.41克，14％,99％純度)、lotⅡ(1.52克，16％，98％純度)、和lotⅢ(3.13克，32％,95％純度)。tR=9.46分鐘，12.82分鐘和13.87分鐘(反相HPLC,C-18,0.1％三氟甲酸的10-20％乙腈水溶液，20分鐘)，MS(M+H=417.5)。
(ⅴ)實施例4l到45描述了用于合成本發(fā)明化合物的精氨醛-亞肼基羰基-氨基甲基化的聚苯乙烯樹脂的合成。見圖6。
實施例41叔丁氧羰基-肼基-羰基-氨基甲基化聚苯乙烯樹脂的制備 在1,1-羰基二咪唑(29.19克，180毫摩爾，6當量)的二甲基甲酰胺(300毫升)懸液中分部加入肼基甲酸叔丁酯(23.76克，180毫摩爾，6當量)，一邊在環(huán)境溫度下在氮氣下攪拌。加完后，室溫攪拌反應(yīng)混合物2 1/2小時，然后倒到肽合成燒瓶中的氨基甲基化聚苯乙烯樹脂(30克，1meq/g，Advance Chemtech)。用氮氣凈化該懸液3小時。濾出樹脂，用3×350毫升二氯甲烷洗滌。Kaiser試驗(溶液和珠；淡藍色，澄清)。進行雙重偶聯(lián)，確保定量反應(yīng)；然而，雙重偶聯(lián)是可任選的。因此，在環(huán)境溫度下攪拌1,1-羰基二咪唑(14.60克，90毫摩爾，3當量)和肼基甲酸叔丁酯(11.88克，90毫摩爾，3當量)的150二甲基甲酰胺溶液30分鐘，然后倒到前面制備的樹脂上。用氮氣凈化1小時后，濾出樹脂，用各6×350毫升的二氯甲烷、甲醇、二氯甲烷、甲醇、二氯甲烷和甲醇洗滌。Kaiser試驗(溶液和珠；淡藍色，澄清)。真空干燥樹脂，用DMF/乙酸酐/Et3N(8∶1∶l；約300毫升)環(huán)境溫度下乙?；?0分鐘。連續(xù)用各種溶劑(二氯甲烷和甲醇)洗滌3次樹脂，真空干燥，得到定量產(chǎn)率的產(chǎn)物。
實施例42肼基羰基-氨基甲基加聚苯乙烯樹脂的制備 將DCM/TFA(1∶1)(300ml)和硫代苯甲醚(10毫升)加到實施例41的樹脂(30克)中，來去保護。在肽合成器燒瓶中，環(huán)境溫度下用氮氣緩慢凈化混合物30分鐘。濾出去保護的樹脂，用DCM(2X)、DCM/DIEA(2X)、DCM(2X)和另選的用溶劑(二氯甲烷、甲醇)洗滌。真空干燥得到的標題化合物。Kaiser試驗(溶液和珠；淡藍色，沙色)；該合成得到總產(chǎn)率為30.64克的樹脂(約0.85meq氨基脲/克)。
另外，如下制備標題樹脂在氨基甲基化聚苯乙烯樹脂(1.0克，1.0毫摩爾，Advanced Chemtech)的N,N-二甲基甲酰胺(12毫升)中加入1,1-羰基二咪唑(3.89克，24.0毫摩爾，24當量)。室溫振搖懸液5小時，然后濾入肽合成器燒瓶。用大量二氯甲烷洗滌樹脂。Kaiser試驗(溶液和珠；淡藍色，白色)。在樹脂中加入2M肼的N,N-二甲基甲酰胺(12毫升)溶液，環(huán)境溫度下振搖過夜。濾出樹脂，另外用有機溶劑(二氯甲烷和甲醇)洗滌，真空干燥，得到標題化合物1.06克(約0.94mmol/g)。
實施例43N-α-芴基甲氧基羰基-ω,ω’-二-N-叔丁氧基羰基-精氨酸甲酯的制備 在N-α-芴基甲氧基羰基-ω,ω’-二-N-叔丁氧基羰基-精氨酸(4.97克，8.329毫摩爾，Advanced Chemtech)的乙腈(82毫升)溶液中加入碳酸鉀(1.38克，10毫摩爾)和碘甲烷(1.037毫升，16.66毫摩爾)。加熱混合物至50℃。50℃攪拌4.5小時后，將反應(yīng)混合物倒到乙酸乙酯(500毫升)中，連續(xù)用水(1×50毫升)、飽和碳酸氫鈉(1×50毫升)和鹽水(1×50毫升)洗滌。用硫酸鈉干燥有機相，減壓除去溶劑，得到4.7克標題化合物。
實施例44N-α-芴基甲氧基羰基-ω,ω’-二-N-叔丁氧基羰基-精氨醛的制備 在實施例43的化合物(5.675克，9.29毫摩爾)的四氫呋喃(15.5毫升)和甲醇(93毫升)的溶液中加入氯化鈣(2.06克，18.58毫摩爾)。在冰浴中冷卻混合物。分部緩慢將硼氫化鈉(1.4克，37.17毫摩爾)加到攪拌冷卻的溶液中。1.5小時后，減壓除去溶劑。將殘余物懸浮在乙酸乙酯(500毫升)和水(300毫升)中。分離相，連續(xù)用0.5MHCL(200ml)和鹽水(200毫升)洗滌有機層。用乙酸乙酯回萃取合并的水層。合并乙酸乙酯層，加入二氧化硅(30克)，減壓除去溶劑。將二氧化硅荷載到150×80mm二氧化硅快速層析柱上，用50％乙酸乙酯/己烷洗脫產(chǎn)物，得到3.855克(71％產(chǎn)率)的標題化合物?；厥?.938克(17％產(chǎn)率)實施例43的化合物(起始材料)。Rf=0.30(50％乙酸乙酯/己烷)。1H NMR(CDCl3):8.35ppm(bs,1H),7.75ppm(m,2H),7.6ppm(m,2H),7.38ppm(m,2H),7.3ppm(m,2H),5.45ppm(m,1H),4.4ppm(d,2H),4.2ppm(m,1H),3.7ppm(m,2H),3.57ppm(m,1H),3.45ppm(m,1H),2.15ppm(m,1H),1.6ppm(m,4H),1.45ppm(d,18H)。
實施例45N-α-芴基甲氧基羰基-ω,ω’-二-N-叔丁氧基羰基精氨醛亞肼基羰基氨基甲基化聚苯乙烯樹脂的制備 在實施例44的化合物(3.62克，6.21毫摩爾)的甲基亞砜(31毫升)和甲苯(31毫升)在冰浴上冷卻的溶液中，加入EDC(11.93克，62.1毫摩爾)和二氯乙酸(2.56毫升，31.06毫摩爾)。攪拌反應(yīng)混合物40分鐘，直到用TLC(50％乙酸乙酯/己烷)觀察不到起始材料。加入水(150毫升)和乙酸乙酯(500毫升)，分離相。然后連續(xù)用0.5M HCl(100ml)、飽和碳酸氫鈉(2×100ml)和鹽水(100毫升)洗滌有機層。用硫酸鈉干燥有機層，減壓除去溶劑。然后將該殘余物溶于二氯甲烷(45毫升)，加到實施例42的化合物(3.65克，3.1毫摩爾)中，在封閉試管來回倒著攪拌過夜。濾出樹脂，用二氯甲烷(3×50毫升)、二甲基甲酰胺(3×50毫升)和甲醇(3×50毫升)洗滌，然后在高真空下干燥。得到標題化合物4.3克。加樣的哌啶富烯確定顯示0.37mmol/g(60％偶聯(lián))。
(ⅵ)實施例46描述了苯磺?；?D-絲氨酰基-吖丁啶基-精氨醛，三氟乙酸鹽(化合物31)的合成。見圖7。實施例46苯磺?；?D-絲氨?；?吖丁啶酰基-精氨醛，三氟乙酸鹽的制備 步驟1ω,ω’-二二-N-叔丁氧基羰基-精氨醛亞肼基羰基氨基甲基化聚苯乙烯樹脂的制備 用30％哌啶/二甲基甲酰胺(1.5毫升)在4毫升聚丙烯柱中處理實施例45的樹脂產(chǎn)物(125毫克)。30分鐘后，排干樹脂，用二氯甲烷(2×3毫升)和甲醇(2×3毫升)連續(xù)洗滌樹脂，真空干燥得到標題化合物。對小量進行的茚三酮試驗得到暗藍色樹脂和溶液，顯示高去保護產(chǎn)率。
步驟2N-α-Fmoc-吖丁啶-2-羰基-ω,ω’-二-N-叔丁氧基羰基-精氨醛亞肼基羰基氨基甲基化聚苯乙烯樹脂的制備 在4毫升聚丙烯柱中的步驟1的化合物(0.12克)中加入N-α-Fmoc-吖丁啶-2-羧酸(110毫克，0.34毫摩爾)、1-羥基苯并三唑(7.7毫克，0.057毫摩爾)、TBTU(37毫克，0.11毫摩爾)和二異丙基乙基胺(29.8微升，0.17毫摩爾)的二甲基甲酰胺(95微升)溶液。室溫振搖反應(yīng)混合物過夜。從樹脂中排干試劑，用二氯甲烷(2×3毫升)和甲醇(2×3毫升)連續(xù)洗滌樹脂。真空干燥樹脂，取出小量用于茚三酮顯色分析，其顯示生產(chǎn)標題化合物中97％的偶聯(lián)效率。
步驟3吖丁啶-2-羰基-ω,ω’-二-N-叔丁氧基羰基-精氨醛亞肼基羰基氨基甲基化聚苯乙烯樹脂的制備 用30％哌啶/二甲基甲酰胺(1.5毫升)在4毫升聚丙烯柱中處理步驟2的化合物。30分鐘后，排干樹脂，用二氯甲烷(2×3毫升)和甲醇(2×3毫升)連續(xù)洗滌樹脂，真空干燥得到標題化合物。對小量進行的茚三酮試驗得到暗藍色樹脂和溶液，顯示高去保護產(chǎn)率。
步驟4N-α-Fmoc-絲氨?；?O-叔丁基)-吖丁啶-2-羰基-N-ω,ω’-二-N-叔丁氧基羰基-精氨醛亞肼基羰基氨基甲基化聚苯乙烯樹脂的制備
在4毫升聚丙烯柱中的步驟3的化合物(0.12克)中加入N-α-Fmoc-D-絲氨酸叔丁基醚(43毫克，0.11毫摩爾)、1-羥基苯并三唑(7.7毫克，0.057毫摩爾)、TBTU(37毫克，0.11毫摩爾)和二異丙基乙基胺(29.8微升，0.17毫摩爾)的二甲基甲酰胺(95微升)溶液。室溫振搖反應(yīng)混合物4小時。從樹脂中排干試劑；用二氯甲烷(2×3毫升)和甲醇(2×3毫升)連續(xù)洗滌樹脂。真空干燥樹脂，然后用N-α-Fmoc-絲氨酸O-叔丁基醚(43毫克，0.11毫摩爾)、1-羥基苯并三唑(7.7毫克，0.057毫摩爾)、TBTU(37毫克，0.11毫摩爾)和二異丙基乙基胺(29.8微升，0.17毫摩爾)的二甲基甲酰胺(95微升)溶液雙重偶聯(lián)。室溫振搖反應(yīng)混合物2小時。從樹脂中排干試劑；用二氯甲烷(2×3毫升)和甲醇(2×3毫升)連續(xù)洗滌樹脂。真空干燥樹脂，取出小量用于茚三酮顯色分析，其顯示生產(chǎn)標題化合物中97.4％的偶聯(lián)效率。
步驟5絲氨?；?O-叔丁基)-吖丁啶-2-羰基-ω,ω’-二-N-叔丁氧基羰基-精氨醛亞肼基羰基氨基甲基化聚苯乙烯樹脂的制備 用30％哌啶/二甲基甲酰胺(1.5毫升)在4毫升聚丙烯柱中處理步驟4的化合物。30分鐘后，排干樹脂，用二氯甲烷(2×3毫升)和甲醇(2×3毫升)連續(xù)洗滌樹脂，真空干燥得到標題化合物。對小量進行的茚三酮試驗得到暗藍色樹脂和溶液，顯示高去保護產(chǎn)率。
步驟6N-α-苯磺?；?D-絲氨?；?O-叔丁基)-吖丁啶-2-羰基-ω,ω’-二-叔丁氧基羰基精氨醛亞肼基羰基氨基甲基化聚苯乙烯樹脂的制備 在4毫升聚丙烯柱中的步驟5的化合物(0.12克)中加入苯磺酰氯(17微升，0.133毫摩爾)、二異丙基乙基胺(46.3微升，0.27毫摩爾)的二甲基甲酰胺(888微升)溶液。室溫振搖反應(yīng)混合物過夜。從樹脂中排干試劑，用二氯甲烷(2×3毫升)和甲醇(2×3毫升)連續(xù)洗滌樹脂。真空干燥樹脂，然后用苯磺酰氯(17微升，0.133毫摩爾)和二異丙基乙基胺(46.3微升，0.27毫摩爾)的二甲基甲酰胺(888微升)溶液雙重偶聯(lián)。室溫振搖反應(yīng)混合物2小時。從樹脂中排干試劑；用二氯甲烷(2×3毫升)和甲醇(2×3毫升)連續(xù)洗滌樹脂。真空干燥樹脂，取出小量用于茚三酮顯色分析，其顯示生產(chǎn)標題化合物中96％的偶聯(lián)效率。步驟7苯磺?；?D-絲氨?；?吖丁啶-2-羰基-精氨醛，三氟乙酸鹽的制備 用三氟乙酸/水(0.5毫升的9∶1混合物)在4毫升聚丙烯柱中處理步驟6的化合物(45毫克)。室溫下振搖柱1.5小時。將反應(yīng)溶液排到試管中，用水洗滌樹脂，到濾液總體積為5.2毫升。用半制備級反相HPLC(0.1％三氟甲酸的0-40％乙腈水溶液，C-18反相)純化標題化合物，凍干，得到14.4克26％產(chǎn)率的標題化合物。合并HPLC分析的純組分，凍干得到標題化合物(2.1毫克)。MS(M+H=469)。 (ⅶ)實施例47到50描述了N-α-(3-苯基丙基)-D-絲氨?；?丙氨酰基-精氨醛，三氟乙酸鹽(化合物32)。
實施例47N-α-(3-苯基丙基)-D-絲氨?；?叔丁基醚甲酯的制備 使絲氨酸O-叔丁基醚甲酯(1.50克，7.1毫摩爾)，氫化肉桂醛(1.40毫升，10.6毫摩爾)，和三乙基胺(1.18毫升，8.5毫摩爾)在四氫呋喃(70毫升)中回流4小時。使溶液冷卻至室溫后，分兩部分將氫硼化鈉(0.46克，12毫摩爾)加到攪拌溶液中。在環(huán)境溫度下攪拌反應(yīng)混合物30分鐘；減壓濃縮溶液。在乙酸乙酯和1.0M HCl之間分配殘余物。用1.0N HCl洗滌有機層。用40％NaOH將水層堿化到pH10，然后用乙酸乙酯(2X)萃取。用硫酸鈉干燥合并有機層；真空除去溶劑。用硅膠快速層析(1×6英寸柱)純化殘余物，用10-30％乙酸乙酯/己烷洗脫，得到150毫克(7％產(chǎn)率)的標題化合物。Rf=0.60(50％乙酸乙酯/己烷)。
實施例48N-α-叔丁氧基羰基-N-O-(3-苯基丙基)-D-絲氨酸二叔丁基醚甲酯的制備 室溫下，在四氫呋喃(2毫升)中攪拌實施例47的化合物(150毫克，0.51毫摩爾)、焦碳酸二-叔丁酯(167毫克，0.77毫摩爾)和二異丙基乙基胺(0.13毫升，0.77毫摩爾)過夜。減壓濃縮反應(yīng)混合物。用乙酸乙酯(20毫升)稀釋殘余物，連續(xù)用1.0N HCl(2X)、飽和碳酸氫鈉(2X)、和鹽水(1X)洗滌。真空除去溶劑，得到206毫克定量產(chǎn)率的標題化合物。Rf=0.74(50％乙酸乙酯/己烷)。
實施例49N-α-叔丁氧基-N-α-(3-苯基丙基)-D-絲氨酸-叔丁醚的制備 在實施例48化合物(206毫克，0.52毫摩爾)的甲醇(3.5毫升)溶液中滴加1.0N LiOH(0.63毫升，0.63毫摩爾)。溶液變混濁，然后5分鐘后變均勻。在環(huán)境溫度下攪拌反應(yīng)混合物過夜。再加入1.0N LiOH(1.47毫升)。2小時后，再加入1.0N LiOH(1.0毫升)。用TLC(50％乙酸乙酯/己烷)觀察不到起始材料后，用DOWEX(50×8-400)離子交換樹脂將反應(yīng)混合物酸化到pH4。過濾溶液，用甲醇，然后用水漂洗。減壓濃縮溶液，然后凍干，得到189毫克產(chǎn)率為95％的黃色油狀標題化合物。Rf=0.04(50％乙酸乙酯/己烷)。
實施例50N-α-(3-苯基丙基)-D-絲氨酰基-丙氨?；?精氨醛，三氟乙酸鹽(化合物32)的制備 根據(jù)實施例46步驟1到4和步驟7，用N-α-Fmoc-丙氨酸取代步驟2中的N-α-Fmoc-吖丁啶，用實施例49的化合物取代步驟4中的N-α-Fmoc-D-絲氨酸O-叔丁基醚，來制備標題化合物。
(ⅷ)實施例51到53描述了本發(fā)明某些化合物的固相合成。
實施例51化合物44、47和48的固相合成根據(jù)實施例46的步驟1到4和步驟7，用標出的代替物代替步驟4中的Fmoc-D-絲氨酸(O-叔丁基)
對于2-苯基乙基磺?；?D-絲氨酸-O-叔丁基，根據(jù)實施例22和23的程序，在實施例22中有兩個代替。用2苯基乙基磺酰氯或3-苯基丙基磺酰氯代替了α-甲苯磺酰氯，用4-甲基嗎啉代替二異丙基乙基胺。
實施例52化含物45、46和49到51的固相合成根據(jù)實施例46的步驟1到4和步驟7，用Cbz-D-絲氨酸(O-叔丁基)代替步驟4中的Fmoc-D-絲氨酸(O-叔丁基)，并用標出的代替物代替步驟2中的Fmoc-L-吖丁啶-2-羧酸
實施例53反-β-苯乙烯磺?；?D-絲氨?；?L-丙氨?；?精氨醛的固相合成(化合物53)
根據(jù)實施例46的步驟1到7，用Fmoc-L-丙氨酸代替步驟2中的NαFmoc-吖丁啶-2-羧酸，用反-β-苯乙烯磺酰氯代替步驟6中的苯磺酰氯，來制備標題化合物。
(ⅸ)實施例54到59描述了化合物1的另一種合成方法。見圖5。
實施例54異丁氧基羰基-D-Ser(O-叔丁基)-OH的制備
在D-絲氨酸-O-叔丁基醚(10.5克，65.3毫摩爾)水溶液(51毫升)中加入碳酸鈉(20.1克，196.2毫摩爾)，然后加入氯甲酸異丁酯(9.8毫升，75.2毫摩爾)。3小時后，該混合物變混濁，再攪拌3小時。6小時后，用6M HCl(~50m1)酸化溶液。然后用乙酸乙酯(3×200毫升)萃取反應(yīng)混合物。萃取一次后，用氯化鈉飽和水層，用乙酸乙酯(2×200毫升)萃取。合并乙酸乙酯層，用硫酸鈉干燥，然后真空除去溶劑，得到17.0克(99.5％產(chǎn)率)白色固體狀標題化合物。HPLCt=18.5分鐘，5％-75％乙腈梯度，溶于0.1％TFA緩沖液，在4.6×250mm,5微米顆粒上，100?？?，C18柱，流速為1ml/min。NMR(CDCl3):5.5ppm(m,1H)，4.45ppm(bs,1H),3.82-3.95ppm(m,3H),3.52-3.6ppm(m,1H),1.85-1.97ppm(m,1H),1.2ppm(s,9H),0.9ppm(d,6H)。
實施例55異丁氧基羰基-D-Ser(叔丁基)-L-Ala-O-叔丁基的制備 室溫下攪拌實施例54的化合物(10克，38.3毫摩爾)，L-丙氨酸叔丁酯，HCl鹽(10.43克，57.4毫摩爾)，EDC(11.05克，57毫摩爾)，和羥基苯并三唑(5.85克，38.3毫摩爾)的乙腈(153毫升)溶液15分鐘。加入二異丙基乙基胺(32.7毫升，191毫摩爾)，攪拌反應(yīng)混合物18小時。減壓除去溶劑；將得到的殘余物重新懸浮在乙酸乙酯(1000毫升)和1M HCl(100毫升)中。用0.5M HCl(100ml)洗滌乙酸乙酯層，用碳酸氫鈉(2×100毫升)和鹽水(100毫升)洗滌。用硫酸鈉干燥乙酸乙酯層，真空除去溶劑，得到定量產(chǎn)率的標題化合物。HPLC:tr=18.7分鐘，于5％-90％乙腈梯度，溶于0.1％TFA緩沖液中，在4.6×250mm，5微米顆粒，100?？祝珻18柱上，流速為1ml/min。NMR(CDCl3):7.15ppm(bs,1H),5.6ppm(bs,1H),4.4-4.5ppm(m,1H),4.2(bs,1H),3.87-3.95ppm(m,3H),3.3-3.4ppm(m,1H),1.85-1.95ppm(m,1H),1.45ppm(s,9H),1.39ppm(d,3H),1.2ppm(s,9H),0.9ppm(d,6H)。
實施例56異丁氧基羰基-D-Ser-L-Ala-OH制備 在實施例55化合物(7.15克，18.4毫摩爾)的二氯甲烷(35毫升)溶液中加入三氟乙酸(35毫升)。攪拌該混合物2小時，然后減壓除去溶劑。加入甲苯，真空除去溶劑，來除去三氟乙酸。然后用得到的定量產(chǎn)率的粘性黃色油狀標題化合物進行下一步。tr=10.5分鐘，于5％-90％乙腈梯度，0.1％TFA緩沖液中，在4.6×250mm柱上，5微米顆粒，100孔，C18柱，流速1ml/min。
實施例57異丁氧基羰基-D-Ser-L-Ala-Ng-硝基精氨醛-乙基環(huán)醇的制備 在環(huán)境溫度下，攪拌實施例56的化合物(5.09克，18.4毫摩爾)、Ng-硝基精氨醛乙基環(huán)醇、HCl鹽(6.4克，23.9毫摩爾)、EDC(5.31克，27.6毫摩爾)、和羥基苯并三唑(2.82克，18.4毫摩爾)的乙腈(74毫升)溶液15分鐘。加入二異丙基乙基胺(15.7毫升，92毫摩爾)，攪拌反應(yīng)混合物18小時。減壓除去溶劑，將得到的殘余物重新懸浮在乙酸乙酯(1000毫升)和0.5m HCl(100毫升)。用0.5M HCl(100毫升)、飽和碳酸氫鈉(2×100毫升)和鹽水(100毫升)洗滌乙酸乙酯層，然后用硫酸鈉干燥。減壓除去溶劑，到約25毫升體積，得到白色沉淀。然后將反應(yīng)混合物置于4℃過夜。然后過濾并干燥沉淀，得到4.6克(50％產(chǎn)率)的標題化合物，作為HPLC:t=11.5分鐘，于0.1％TFA緩沖液中的5％-90％乙腈梯度，在4.6×250mm,5微米顆粒，100?？?，C18柱于1ml/分鐘流速的單峰。
實施例58異丁氧基羰基-D-Ser-L-Ala-精氨醛-乙基環(huán)醇的制備 用氮氣對實施例57的化合物(4.55克，9.3毫摩爾)的乙醇∶水∶乙酸(55毫升的4∶1∶1混合物)的溶液通氣，然后加入鈀碳(1.15克，10％鈀，50％水)。在50psi下，氫化該混合物18小時。然后過濾反應(yīng)混合物，以除去鈀，真空除去溶劑，得到定量產(chǎn)率的標題化合物。HPLC:tr=14.2分鐘，于0.1％TFA緩沖液中的5-50％乙腈梯度，5微米顆粒，100孔，C18柱，流速為1ml/分鐘。實施例59異丁氧基羰基-D-Ser-L-Ala-精氨醛(化合物1)的制備 攪拌實施例58的化合物(9.3毫摩爾)的3M HCl溶液3小時。然后直接將該材料分3批荷載到50×300mm,15微米顆粒，100?？?，C18柱上，流速為80ml/min。合并并凍干含有產(chǎn)物的組分，得到2.38克(61％產(chǎn)率)標題化合物，用分析級HPLC分析，純度是97％。HPLC:t=16.4分鐘和19.6分鐘，于0.1％TFA緩沖液中的5％-25％乙腈梯度中，在4.6×250mm，5微米顆粒，100?？?，C18柱于1ml/分鐘流速。NMR(D2O):5.4ppm(s,1H),4.25-4.37ppm(m,1H),4.1-4.25ppm(m,1H),3.75-3.95ppm(m,5H),3.42-3.52ppm(m,1H),3.2-3.3ppm(m,1H),1.58-1.98ppm(m,5H),1.35ppm(d,3H),0.85ppm(d,6H)。
(ⅹ)實施例60到72描述了在合成本發(fā)明化合物中可用的某些中間物。見圖8(實施例60到64)和圖9(實施例65到72)。
實施例60N-(叔丁氧基羰基)-3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸-甲酯的制備 在N-(叔丁氧基羰基)-3-(3-吡啶基)丙氨酸(5.0克，18.8毫摩爾)的甲醇(100毫升)溶液中，加入亞硫酰氯(2M二氯甲烷溶液，66毫升，132毫摩爾)。在環(huán)境溫度下攪拌得到的溶液過夜。減壓將甲醇除至最少體積，加入乙酸乙酯(100毫升)。將得到的白色沉淀收集在多孔漏斗中。在收集沉淀的四氫呋喃/水(各40毫升)混合物溶液中，加入焦碳酸二-叔丁酯(4.8克，21.99毫摩爾)和碳酸鈉(1.95克，18.4毫摩爾)。在環(huán)境溫度下攪拌12小時后，用乙酸乙酯(10毫升)稀釋反應(yīng)混合物，用飽和碳酸氫鈉(25毫升)溶液洗滌。用無水硫酸鈉干燥有機層，真空濃縮，得到粗產(chǎn)物。對該產(chǎn)物進行硅膠(230-400篩目)快速柱層析，使用8×52cm柱，用乙酸乙酯/己烷的10∶90混合物、乙酸乙酯/己烷的60∶40混合物洗脫。獲得油狀的4克(74％)標題化合物。薄層層析(硅膠；乙酸乙酯)，Rf=0.68。
實施例61N-(叔丁氧基羰基)-3-([R.S]-3-哌啶基)-L-丙氨酸甲酯、乙酸鹽的制備 在45psi下，用氧化鈀(500毫克)氫化實施例60的化合物(5克，17.8毫摩爾)的乙醇(24毫升)、乙酸(6毫升)和水(6毫升)溶液3小時。濾去催化劑，真空濃縮濾液，得到油狀殘余物(6.89克)，不經(jīng)進一步純化用于實施例62描述的程序。薄層層析得到兩點，對應(yīng)Rf值分別為0.16和0.26的兩種非對映體(硅膠；4∶1；1正丁醇/乙酸/水)。
實施例62N-(叔丁氧基羰基)-3-[R.S]-3-哌啶基-(N-胍基(雙-芐氧基羰基))]-L-丙氡酸甲酯的制備 在實施例61的化合物(6.89克，19.9毫摩爾)的四氫呋喃(80毫升)溶液中加入S-甲基異硫脲雙-芐氧基羰基(7.13克，19.9毫摩爾)，然后加入N-甲基嗎啉(4.37毫升)。在環(huán)境溫度下攪拌反應(yīng)混合物18小時。然后真空濃縮反應(yīng)混合物，將得到的殘余物溶于乙酸乙酯(100毫升)，用1N硫酸氫鈉和飽和氯化鈉(各50毫升)洗滌。在無水硫酸鈉上干燥后，真空除去溶劑；對粗標題化合物進行硅膠(230-400篩目)的快速柱層析，用8×52厘米柱，用1∶9乙酸乙酯/己烷(兩柱體積)，然后用1∶1乙酸乙酯/己烷洗脫。獲得兩種非對映體的混合物的2.75克標題化合物。薄層層析得到兩個Rf值分別為0.57和0.62的點(硅膠；1；1/乙酸乙酯/己烷)。
實施例63N-(叔丁氧基羰基)-3-[(R,S)-3-哌啶基-(N-胍基(雙-芐氧基羰基))]-L-丙氨醇的制備 在實施例62的化合物(2.23克，3.7毫摩爾)的無水乙醇(8毫升)和無水四氫呋喃(4毫升)攪拌溶液中，加入氯化鈣(844毫克，7.6毫摩爾)和氫硼化鈉(575毫克，15.2毫摩爾)。在環(huán)境溫度下攪拌12小時后，真空濃縮反應(yīng)混合物，在乙酸乙酯和1N硫酸氫鈉(各10毫升)之間分配得到的殘余物。分離這兩層；用1N硫酸氫鈉洗滌兩次有機層，用無水硫酸鈉干燥，真空濃縮，得到殘余物。在硅膠(230-400篩目)上，用5.5×45cm柱快速柱層析殘余物，用乙酸乙酯洗脫，得到1.3克白色泡沫狀標題化合物。薄層層析得到兩點，對應(yīng)Rf值分別為0.18和0.27的兩種非對映體(硅膠；1；1乙酸乙酯/己烷)。
實施例643-[(R.S)-3-哌啶基-(N-胍基(雙芐氧基羰基))]-L-丙氨酸，鹽酸鹽的制備 在環(huán)境溫度下用2.5N無水鹽酸的乙酸乙酯(2.0ml)溶液處理實施例63的化合物(290毫克，0.57毫摩爾)1小時。真空除去溶劑，得到粘性白色固體(260毫克)。不經(jīng)進一步純化使用該固體，制備本發(fā)明P1處具有3-哌啶基-(N-胍基)-丙氨醛的化合物。CD3OD中取到的1H NMR顯示1.4ppm處無叔丁氧基羰基質(zhì)子。
實施例65氨基脲-4-基二苯基甲烷，三氟乙酸鹽的制備 步驟1室溫制備羰基二咪唑(16.2克，0.10毫摩爾)的225毫升二甲基甲酰胺溶液，氮氣下攪拌。然后在30分鐘內(nèi)滴加肼基甲酸叔丁酯(13.2克，0.100摩爾)的225毫升二甲基甲酰胺溶液。然后，在30分鐘內(nèi)加入二苯基甲胺(18.3克，0.10摩爾)。在氮氣下，室溫下攪拌反應(yīng)混合物1小時。加入水(10毫升)，真空濃縮該混合物到約150毫升。將該溶液倒到500毫升水中，然后用400毫升乙酸乙酯萃取。各用75毫升1N HCl、水、飽和碳酸氫鈉和鹽水萃取兩次乙酸乙酯相。然后用無水硫酸鎂干燥。過濾混合物，濃縮溶液，得到29.5克(85％產(chǎn)率)白色泡沫狀的1-叔丁氧基羰基-氨基脲-4-基二苯基甲烷。雖然可通過重結(jié)晶從乙酸乙酯/己烷中純化該材料，但它已純得足以直接用于步驟2:mp142-143℃。1NMR(CDCl3)δ1.45(s,9H),6.10(dd,2H),6.42(s,1H),6.67(bs,1H),7.21-7.31(m,10H)。C19H23N3O3的分析計算值:C,66.84；H,6.79；N,12.31。實測值C,66.46；H,6.75；N；12.90。
步驟2用12.5毫升三氟乙酸在0℃處理1-叔丁氧基羰基-氨基脲-4-基二苯基甲烷(3.43克，10毫摩爾)的12.5毫升二氯甲烷溶液。在該溫度下攪拌反應(yīng)混合物30分鐘。然后將反應(yīng)混合物滴加入75毫升乙醚中，得到沉淀。濾去得到的沉淀，用乙醚洗滌，得到2.7克(80％產(chǎn)率)的標題化合物；mp182-184℃。
實施例663-硫代酰氨基芐基-N-乙?；被岫阴サ闹苽?在氬氣下，在α-溴-間-甲苯腈(45.0克，0.24摩爾)、乙酰氨基丙二酸二乙酯(48.0克，0.22摩爾)和碘化鉀(3.0克，0.018摩爾)的二噁烷(500毫升)溶液中滴加2.5M乙氧化鈉的乙醇(100毫升)溶液。加入完成后，回流溶液6小時。將反應(yīng)混合物在室溫放置過夜，然后用鹽水(250毫升)和水(250毫升)稀釋，用乙酸乙酯萃取4次(總1升)。用水(100毫升)、10％檸檬酸(100毫升)、水(100毫升)和鹽水(2×50毫升)洗滌合并的萃取物，然后用無水硫酸鎂干燥并過濾。真空除去溶劑。從乙酸乙酯和乙醚中分兩批重結(jié)晶粗殘余物，得到43.51克(60％)黃色晶體狀3-氰基芐基-N-乙酰氨基丙二酸二乙酯。
將H2S氣體冒泡通入快速攪拌的3-氰基芐基-N-乙?；被岫阴?44.3克，0.13毫摩爾)的吡啶(300毫升)和三乙胺(100毫升)溶液中40分鐘。室溫攪拌反應(yīng)混合物16小時，然后倒入3.0升水中。立即形成黃色沉淀。將溶液置于4℃4小時，然后過濾。從乙酸乙酯和己烷中重結(jié)晶粗產(chǎn)標題化合物，得到48.1克(98％產(chǎn)率)的黃色晶體狀標題化合物，m.p.183-186℃。1HNMR(CDCl3):δ1.31(t,J=7.1Hz,6H),2.06(s,3H),3.70(s,2H),4.29(q,J=7.1Hz,6H),4.80-4.87(m,1H),6.60(s,1H),7.10-7.20(m,1H),7.27-7.35(m,2H),7.60-7.70(m,2H)。C17H22N2O5S的分析計算值C,55.72；H,6.05；N,7.64。實測值C,55.55；H,5.96；N,7.76。實施例673-脒基-D,L-苯基丙氨酸，二乙酸鹽的制備 將實施例66的化合物(48.19,0.13mol)溶于丙酮(800毫升)。加入碘甲烷(18.3毫升，0.19摩爾，1.5當量)，回流溶液30分鐘。將溶液冷卻至室溫；過濾中間物硫代酰亞胺酸酯，干燥并溶于甲醇(500毫升)。加入乙酸銨(14.8克，0.19摩爾，1.5當量)?；亓鞣磻?yīng)混合物1小時，然后冷卻至室溫，倒入乙醚(1.21)中。將溶液置于4℃72小時。過濾粗3-脒基芐基-N-乙酰基氨基丙二酸二乙酯，用乙醚洗滌，空氣干燥，然后在濃鹽酸(250毫升)中回流3小時。真空濃縮反應(yīng)混合物，用水(0.51)稀釋，再次真空濃縮。重復這些步驟。用陽離子交換劑(Sephadex SP-C25)用0-1.0N HCl梯度作為洗脫劑，純化粗標題化合物，得到10.8克(30％產(chǎn)率)的白色標題化合物。1NMR(D2O):δ3.14-3.29(2H,m),4.17(dd,J=7.4,6.2Hz,1H),7.42-7.69(4H,m)。C10H13N3O2·2HCl·1.9H2O的分析計算值C,38.20；H,6.03；N,13.36。實測值C,38.51；H,5.64；N,12.89。
實施例68N-α-Boc-N-ω-4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基-3-脒基-D,L-苯基丙氨酸的制備 將3-脒基-D,L-苯基丙氨酸(實施例67的化合物)(4.00克，13毫摩爾)溶于50％二噁烷水溶液(20毫升)。加入碳酸氫鈉(3.38克，40毫摩爾)，然后加入焦碳酸二叔丁酯(2.93克，13毫摩爾)的二噁烷水溶液(4毫升)。室溫攪拌反應(yīng)混合物18小時。在冰浴中冷卻溶液，然后滴加4.0N氫氧化鈉，直到溶液是pH12。滴加4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰氯(8.01克，32毫摩爾)的二噁烷水溶液(10毫升)。如所需，加入4.0N氫氧化鈉，保持pH12。除去冰浴。1小時后，加入1.0N HCl，得到pH7-8的溶液。再用50毫升水稀釋溶液，然后用乙酸乙酯洗滌兩次(各20毫升)。用1.0N HCl將水層酸化到pH1.0，用乙酸乙酯萃取3次(總的100毫升)。用水(20毫升)和鹽水兩次(各10毫升)洗滌合并的有機層。用無水硫酸鎂干燥有機層，真空除去溶劑。將殘余物溶于最小量二氯甲烷中，然后滴加到乙醚(25毫升)中。過濾除去固體雜質(zhì)，真空從濾液中除去溶劑，得到4.90克(68％粗產(chǎn)率)的灰白色泡沫標題化合物。用制備級薄層層析進一步純化30毫克標題化合物樣品，用1％乙酸/5％異丙醇/二氯甲烷展開，得到9毫克更純的標題化合物。Rf=0.16(1％乙酸/5％異丙醇/二氯甲烷)。1H NMR(CD3OD):δ1.32(s,9H),2.14(s,3H),2.63(s,3H),2.71(s,3H),2.93(dd,J=13.7,9.3Hz,1H),3.22(dd,J=13.7,4.3Hz,1H),3.85(s,3H),4.34-4.37(m,1H),6.72(s,1H),7.35-7.47(2H,m),7.69-7.75(m,2H)。
實施例69N-α-Boc-N-ω-4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺?；?3-脒基-D,L-苯基丙氨酸-N-甲基-O-甲基-羧酰胺的制備 在實施例68的化合物(1.00克，1.92毫摩爾)，O,N-二甲基羥基胺鹽酸鹽(375毫克，3.85毫摩爾)，羥基苯并三唑水合物(294毫克，1.92毫摩爾)和4-甲基嗎啉(1.06毫升，9.62毫摩爾)的四氫呋喃(4毫升)在冰浴中冷卻的攪拌溶液中加入EDC(406毫克，2.12毫摩爾)。除去冰浴，室溫下攪拌反應(yīng)混合物2小時。用乙酸乙酯(75毫升)稀釋反應(yīng)混合物，用水、10％檸檬酸、水、飽和碳酸氫鈉和鹽水洗滌。用無水硫酸鎂干燥有機層，真空除去溶劑。分離到750毫克(69％產(chǎn)率)的標題化合物。1H NMR(CD3Cl):δ1.33(s,9H),2.14(s,3H),2.66(s,3H),2.75(s,3H),2.80-2.88(m,1H),3.06-3.20(m,4H),3.70(s,3H),3.84(s,3H),4.98-5.06(m,1H),5.21(d,J=8.7Hz,1H),6.48(bs,1H),6.58(s,1H),7.30-7.34(m,2H),7.60-7.68(m,2H),8.11(bs,1H)。C22H38N4O7S·0.5H2O:C,56.73；H,6.88；N,9.80。實測值C,56.97；H,6.66；N,9.43。
實施例70N-α-Boc-N-ω-4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基-D,L-3-脒基苯基丙氨醛的制備 在LiAlH4(2.00ml的1.0M四氫呋喃溶液，1.24毫摩爾)的四氫呋喃溶液(8毫升)在干冰/丙酮浴中冷卻的攪拌溶液中，滴加實施例69的化合物(0.75克，1.9毫摩爾)的四氫呋喃(5毫升)溶液)。除去冷卻浴，使反應(yīng)混合物溫至5℃。將反應(yīng)混合物重新在干冰丙酮浴中冷卻，并用3.0毫升1∶2.7wt./wt硫酸氫鉀水溶液淬滅。使反應(yīng)混合物溫至室溫，攪拌3小時，過濾并真空濃縮。將殘余物溶于乙酸乙酯(20毫升)，用10％檸檬酸(2毫升)、水(2毫升)、飽和碳酸氫鈉(2毫升)和鹽水(2毫升)洗滌。用無水硫酸鎂干燥有機層，真空除去溶劑，得到580毫克(86％)的標題化合物。1H NMR(CD3Cl):δ1.31(s,9H),2.07(s,3H),2.57(s,3H),2.67(s,3H),2.90-3.17(2H,m),3.77(s,3H),4.33-4.40(1H,m),5.02-5.08(1H,m),6.48(1H,s),7.23-7.31(2H,m),7.50-7.62(2H,m),7.94,(1H,bs),8.05(1H,bs),9.55(1H,s)。C25H33N3O6S·0.5H2O:C,58.58；H,6.69；N,8.20。實測值C,58.57；H,6.72；N,7.98。
實施例71N-α-Boc-N-ω-4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基-D,L-3-脒基苯基丙氨醛-縮氨基脲基-4-N-二苯基甲烷的制備 使實施例70的化合物(0.58g,1.9mmol)、實施例65的化合物(410毫克，1.15毫摩爾)和三水合乙酸鈉(188毫克，1.38毫摩爾)在75％酒精(10毫升)中回流1小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，用乙酸乙酯(50毫升)稀釋，用1.0NHCl(5毫升)、水(5毫升)、飽和碳酸氫鈉(5毫升)和鹽水(2×5毫升)洗滌，用無水硫酸鎂干燥。真空除去溶劑，得到750毫克(89％產(chǎn)率)的白色泡沫狀標題化合物。C39H46N6O6S·1.0H2O:％C,62.88；％H,6.49；％N,11.28。實測值％C,63.14；％H,6.35％N,11.10。計算分子量是726.90。
實施例72N-ω-4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺?；?D,L-3-脒基苯基丙氨酰基-縮氨基脲基-4-N-二苯基甲烷，三氟乙酸鹽的制備 在室溫下，用50％三氟乙酸/二氯甲烷(3毫升)處理實施例71的化合物(750毫克，1.9毫摩爾)30分鐘。將反應(yīng)混合物滴加入乙醚(50毫升)中。將溶液置于4℃18小時。濾出產(chǎn)物，真空干燥，得到600毫克(79％產(chǎn)率)的灰白色固體狀標題化合物。C34H38N6O4S·1.3CF3CO2H:％C,56.72；％H,5.11；％N,10.84。實測值％C,56.34；％H,5.47；％N,11.49。該鹽具有計算分子量740.8。
實施例73化合物10-6的制備根據(jù)實施例60到64的方法制備了圖10的化合物10-6，用實施例60中的叔丁氧基羰基-4-(4-吡啶基)丙氨酸代替。
實施例74化合物11-7的制備根據(jù)圖11的反應(yīng)流程制備了圖11的化合物11-7。
實施例75化合物12-5的制備根據(jù)圖12的反應(yīng)流程制備了圖12的化合物12-5。
實施例76異丁氧羰基-D-(異丙氧基羰基)Ser-L-Ala-Ng-硝基丙氨醛-乙基環(huán)醇的制備 在冰浴中冷卻的實施例58的化合物(21.0克，42.9毫摩爾)的吡啶(100毫升)溶液中，加入氯甲酸異丙酯(21毫升1M甲苯溶液，20毫摩爾，5當量)。1小時后，用分析級HPLC確定反應(yīng)完成。用甲苯稀釋反應(yīng)混合物(300毫升)；減壓除去溶劑。將殘余物溶于乙腈(400毫升)，減壓除去溶劑。將殘余物溶于乙腈(30毫升)和乙酸乙酯(30毫升)中。加入乙醚，分離沉淀。用乙醚洗滌固體，然后真空干燥。用乙醚和乙酸乙酯(2×200毫升的1∶1混合物)洗滌固體，然后真空干燥，得到22.4克產(chǎn)率為91％的灰白色微黃固體狀標題化合物。HPLCtr=18.1分鐘，0.1％TFA緩沖液中的5-75％乙腈梯度，4.6×250mm，5微米顆粒，100孔，C18柱，流速為1毫升/分鐘。實施例77異丁氧基羰基-D-(異丙氧基羰基)Ser-L-Ala-精氨醛-乙基-環(huán)醇的制備 用氮氣對實施例76的化合物(11.0克，19毫摩爾)的乙醇∶水∶乙酸(450毫升的4∶1∶1混合物)通氣，加入10％鈀碳(2.0克)。以35psi氫化混合物6小時。加入硅藻土，過濾反應(yīng)混合物除去鈀，真空除去溶劑，得到淡黃色膠狀固體的標題化合物，直接在實施例87的程序中使用。HPLC:tr=13.1分鐘，0.1％TFA緩沖液中的5％-75％乙腈梯度，4.6×250mm，5微米顆粒，100?？?，C18柱，流速為1毫升/分鐘。
實施例78異丁氧基羰基-D-(異丙氧基羰基)Ser-L-Ala-精氨醛的制備
用6M HCl(60毫升)處理實施例77的化合物(19毫摩爾)乙腈(20毫升)溶液40分鐘。將反應(yīng)混合物冷卻至0℃，然后用乙酸鈉淬滅(240毫升的2.5M溶液)。過濾得到的溶液，然后分兩批用制備級HPLC純化。用含有0.1％TFA的5-40％乙腈水溶液洗脫含有產(chǎn)物的級分，合并，凍干，得到4.1克(42％)白色粉末狀標題化合物。分析級HPLC觀察到三個峰。HPLC:tr=17.2,18.2,18.6分鐘，0.1％TFA緩沖液中的5％-50％乙腈梯度，4.6×250mm,5微米顆粒，100?？?，C18柱，流速為1毫升/分鐘。
實施例79根據(jù)實施例76到78的方法，用標出的取代物代替氯甲酸異丙酯，制備了下列化合物
異丁氧基羰基-D-((+)-薄荷氧基羰基)Ser-L-Ala-精氨醛(實施例79A)。 異丁氧基羰基-D-(苯氧基羰基)Ser-k-Ala-精氨醛(實施例79B)。實施例80N-α-芐氧基羰基-D-Ser(O-叔丁基)-L-Ala-叔丁基酯的制備 在N-α-Cbz-D-絲氨酸叔丁醚(5.02克，17毫摩爾)的乙腈(100毫升)溶液中，加入EDC(4.90克，25.5毫摩爾，1.5當量)和1-羥基苯并三唑(2.60克，17毫摩爾)。攪拌45分鐘后，加入丙氨酸叔丁酯，鹽酸鹽(3.55克，19.6毫摩爾，1.15當量)和4-甲基嗎啉(7.5毫升，68毫摩爾，4當量)。攪拌反應(yīng)混合物1.5小時。TLC表明反應(yīng)完成。減壓濃縮反應(yīng)混合物。將殘余物溶于乙酸乙酯(100毫升)，然后連續(xù)用1N HCl，飽和碳酸氫鈉，水和鹽水(各25毫升)洗滌。真空除去溶劑，得到油，放置后結(jié)晶。獲得淡黃色固體狀的標題化合物(6.95克)，產(chǎn)率為97％。Rf=0.63(5％異丙醇的二氯甲烷溶液)。
實施例81D-Ser(O-叔丁基)-L-Ala叔丁酯的制備 用氫氧化鈀(110毫克)在低壓下氫化實施例80化合物(1.14克，2.69毫摩爾)的甲醇溶液1.5小時。將反應(yīng)混合物濾過硅藻土，真空除去溶劑，得到定量產(chǎn)率的黃色油狀標題化合物。Rf=0.44(5％甲醇的二氯甲烷溶液)。
實施例82苯乙基磺酰基-D-Ser(O-叔丁基)-L-Ala叔丁酯的制備 在冰浴中冷卻的實施例82的化合物(4.2克，14.6毫摩爾)和苯乙基磺酰氯(3.58克，17.5毫摩爾，1.2當量)的乙腈(100毫升)攪拌溶液中，加入2,4,6-可力丁(4.8毫升，36.5毫摩爾，2.5當量)。使反應(yīng)混合物溫至室溫，然后攪拌過夜。減壓濃縮反應(yīng)混合物。將殘余物溶于乙酸乙酯(80毫升)；連續(xù)用1.0NHCl、飽和碳酸氫鈉、水和鹽水洗滌得到的溶液，然后用硫酸鈉干燥。真空除去溶劑。用硅膠層析殘余物，洗脫0-60％乙酸乙酯/己烷。分離得到產(chǎn)率為89％的黃色油狀標題化合物(5％甲醇的二氯甲烷溶液)。
實施例83苯乙基磺?；?D-Ser-L-Ala-Ng-硝基精氨醛-乙基環(huán)醇的制備 用50％TFA/二氯甲烷(40毫升)處理實施例82的化合物(4.16克，9.11毫摩爾)。3小時后，用甲苯(45毫升)稀釋反應(yīng)混合物，減壓除去溶劑。將殘余物溶于乙腈(40毫升)；真空除去溶劑，得到苯乙基磺?；?D-絲氨酸-L-丙氨酸(4.36克)。Rf=0.52(10％異丙醇的二氯甲烷溶液)。
將粗苯乙基磺酰基-D-絲氨酸-L-丙氨酸(9.11毫摩爾，理論量)溶于乙腈(90毫升)。在冰浴中氮氣下冷卻攪拌溶液。加入EDC(3.63克，18.9毫摩爾)和1-羥基苯并三唑(1.93克，12.6毫摩爾)；攪拌反應(yīng)混合物5分鐘。加入Ng-硝基精氨醛乙基環(huán)醇，鹽酸鹽(4.04克，15.1毫摩爾)。攪拌10分鐘后，除去冷卻浴，加入4-甲基嗎啉(5.54毫升，50毫摩爾)。攪拌反應(yīng)混合物過夜。減壓濃縮反應(yīng)混合物，然后用乙酸乙酯稀釋。連續(xù)用1.0N HCl、飽和碳酸氫鈉、水和鹽水洗滌溶液，然后用硫酸鈉干燥，減壓濃縮。用乙酸乙酯(25毫升)反萃取合并水層。連續(xù)用1.0N HCl、飽和碳酸氫鈉、水和鹽水洗滌有機層，然后用硫酸鈉干燥，減壓濃縮。用硅膠層析來自萃取和反萃取的合并粗產(chǎn)物，使用1-6％乙醇的二氯甲烷溶液。分離橙色固體狀的標題化合物(3.25克，64％產(chǎn)率)。Rf=0.83(10％異丙醇的二氯甲烷溶液)。
實施例84苯乙基磺?；?D-Ser-L-Ala-精氨醛的制備 根據(jù)實施例58到59中描述的兩步氫化和水解方法，制備了白色粉末狀的標題化合物。HPLC:tr=15.6和17.8分鐘，0.1％TFA緩沖液中的10％-30％乙腈梯度，4.6×250mm,5微米顆粒，100?？?，C18柱，流速為1毫升/分鐘。質(zhì)譜(M+H)=485。
實施例85苯乙基磺?；?D-(異丙氧基羰基)Ser-L-Ala-精氨醛的制備 根據(jù)實施例76到78中描述的碳酸酯的形成，氫化和水解三步方法，制備了白色粉末狀的標題化合物。HPLC:tr=12.6,13.1和13.2分鐘，0.1％TFA緩沖液中的5％-90％乙腈梯度，4.6×250mm，5微米顆粒，100孔，C18柱，流速為1毫升/分鐘。質(zhì)譜(M+H)=571。
根據(jù)本發(fā)明的詳述和實施例，使用合適的起始材料和試劑，制備了下列化合物N-α-(2-苯基乙基)磺?；?D-絲氨酰基-吖丁啶-2-羰基-精氨醛；芐氧基羰基-D-絲氨酰基-4-羥基脯氨?；?精氨醛；和芐氧基羰基-D-絲氨?；?3-反-羥基脯氨酰基-精氨醛。
根據(jù)本發(fā)明詳述和實施例，使用合適的起始材料和試劑，制備了下列化合物N-α-(2-苯基乙基)磺酰基-D-絲氨?；?3,4-二氫脯氨?；?精氨醛； 苯乙氧基羰基-D-Ser-L-Ala-精氨醛； 苯乙基磺?；?D-Ser-L-炔丙基Gly-精氨醛； 3-苯丙氧基羰基-D-Ser-L-Ala-精氨醛； 芐基氨基羰基-D-Ser-L-脫氫脯氨?；?精氨醛； 苯乙基氨基羰基-D-Ser-L-Ala-精氨醛； 芐基氨基羰基-D-Ser-L-吖丁啶-2-羧基-精氨醛； 3-苯丙基氨基羰基-D-Ser-L-Ala-精氨醛； 環(huán)己基甲基氨基羰基-D-Ser-L-脫氫脯氨?；?精氨醛； 3-苯乙基氨基羰基-D-Ser-L-脫氫脯氨?；?精氨醛； 環(huán)己基甲基氨基羰基-D-Ser-L-P吖丁啶-2-羧基-精氨醛； 3-苯丙基氨基羰基-D-Ser-L-吖丁啶-2-羧基-精氨醛； 苯乙基磺?；?D-Ser-L-脫氫脯氨?；?精氨醛； 苯乙基磺酰基-D-Ser-L-吖丁啶-2-羧基-精氨醛； 異丁氧基羰基-D-(乙氧基羰基)-Ser-L-Ala-精氨醛； 異丁氧基羰基-D-(正丙氧基)-ser-L-Ala-精氨醛； 異丁氧基-D-(正丁氧基羰基)-Ser-L-Ala-精氨醛； 異丁氧基-D-(2-甲氧基乙氧基羰基)-Ser-L-Ala-精氨醛； 苯乙基磺?；?D-(乙氧基羰基)-Ser-L-Ala-精氨醛； 苯乙基磺酰基-D-(正丙氧基羰基)-Ser-L-Ala-精氨醛； 苯乙基磺?；?D-(正丁氧基羰基)-Ser-L-Ala-精氨醛；和 苯乙基磺?；?D-(2-甲氧基乙氧基羰基)-Ser-L-Ala-精氨醛。
實施例A特異性測定的體外酶試驗通過測定將尿激酶活性抑制到50％(IC50)的測試化合物濃度，并將該值與下列相關(guān)的絲氨酸蛋白酶(重組組織纖溶酶原激活物(rt-PA)、纖溶酶、活化的蛋白C、胰凝乳蛋白酶、凝血因子Xa、纖維蛋白酶和胰蛋白酶)的全部或一些的值比較，評估了本發(fā)明化合物作為尿激酶催化活性的選擇性抑制劑的能力。
全部試驗所用的緩沖液是HBSA(10mM HEPES,pH7.5,150mM氯化鈉，0.1％牛血清清蛋白)。
通過在Corning微量滴定板的合適孔中合并50微升HBSA、50微升特定濃度的稀釋于HBSA中的測試化合物(或只用HBSA，用于V0(無抑制速率)的測定)(覆蓋廣濃度范圍)，和50微升稀釋于HBSA中的酶，進行IC50測定試驗。環(huán)境溫度培養(yǎng)30分鐘后，將50微升下列特定濃度的底物加到孔中，得到最終總體積為200微升(約4xKm)。用Thermo MaxKineticMicroplate Reader在5分鐘內(nèi)(利用小于5％的加入底物)測量405納米處的吸光度改變，來測量生色底物水解的起始速度。將加入的，導致起始水解速率降低50％的抑制劑濃度定義為IC50值。
尿激酶試驗使用生色底物150mM S-2444(L-焦谷氨?；?甘氨酰基-L-精氨酸-p-硝基苯胺鹽酸鹽)(獲自DiaPharma Group,Inc.)測定了尿激酶催化活性。從PriorityPharmaceuticals獲得Abbott Laboratories制造的尿激酶(Abbokinase)，在HBSA試驗緩沖液中稀釋到750pM，然后使用。試驗緩沖液是HBS(10mMHEPES,150mM氯化鈉，pH7.4)和0.1％BSA。
纖維蛋白酶(fIIa)試驗使用生色底物，Pefachrome t-PA(CH3SO2-D-六氫酪氨酸-甘氨酸-L-精氨酸-p-硝基苯胺，獲自Pentapharm Ltd.)測定了酶活性。使用前，將底物在去離子水中重建。從Enzyme Research Laboratories,Inc獲得純化的人α-纖維蛋白酶。用于全部試驗的緩沖液是HBSA(10mM HEPES,pH7.5,150mM氯化鈉，0.1％牛血清清蛋白)。
在合適的孔中合并HBSA(50微升)，α-纖維蛋白酶(50微升)(最終酶濃度是0.5nM)和抑制劑(50微升)(覆蓋廣濃度范圍)，室溫培育30分鐘，然后加入底物Pefachrome-t-PA(50微升)(最終底物濃度是250微摩爾，約5×Km)，進行IC50測定。用Thermo MaxKineticMicroplate Reader在5分鐘內(nèi)(利用小于5％的加入底物)測量405納米處的吸光度改變，來測量Pefachrome-t-PA水解的起始速度。將加入的，導致起始水解速度降低50％的抑制劑濃度定義為IC50值。
凝血因子Xa
用生色底物S-2765(N-芐氧基羰基-D-精氨酸-L-甘氨酸-L-精氨酸-p-硝基苯胺)，獲自DiaPharma Group(Franklin，OH)測定了凝血因子的催化活性。使用前，將全部底物在去離子水中重建。S-2765的最終濃度是250μM(約5倍Km)。純化的人凝血因子X從Enzyme Research Laboratories,Inc.(South Bend,IN)獲得，活化凝血因子Xa(FXa)，如所述[Bock,P.E.,Craig,P.A.,Olson,S.T.，和Singh,P.，農(nóng)業(yè)生物化學生物物理273:375-388(1989)]從其制備。試驗前將酶稀釋入HBSA，其中最終濃度是0.25nM。
重組組織纖溶酶原激活物(rt-PA)試驗使用底物Pefachrome t-PA(CH3SO2-D-六氫酪氨酸-甘氨酰基-L-精氨酸-p-硝基苯胺，獲自PentaPharm Ltd.)測定了rt-PA催化活性。將底物配制在去離子水中，然后試驗前稀釋在HBSA中，其中最終濃度是500毫摩爾(約3倍Km)。從Genentech Inc.獲得了人rt-PA(Activase)。將酶重建于去離子水中，試驗前稀釋于HBSA，其中最終濃度是1.0nM。
纖溶酶試驗用生色底物，S-2366[L-焦谷氨酰-L-脯氨?；?L-精氨酸-p-硝基苯胺鹽酸鹽]，獲自DiaPharma Group。將底物配制于去離子水，然后在試驗前稀釋于HBSA，其中最終濃度是300微摩爾(約2.5倍Km)。純化人纖溶酶獲自Enzyme ResearchLaboratories,Inc.試驗前將酶稀釋于HBSA，其中最終濃度是1.0nM。
活化蛋白質(zhì)C(aPC)試驗使用生色底物，Pefachrome PC(δ-芐氧羰基-D-賴氨酸-L-脯氨?；?L-精氨酸-p-硝基苯胺二鹽酸鹽，獲自Pentapharm Ltd.)測定了aPC催化活性。將底物配制于去離子水，然后在試驗前用HBSA稀釋，其中最終濃度是400毫摩爾(約3倍Km)。純化人aPC獲自Hematologic technologies,Inc。試驗前將酶稀釋于HBSA，最終濃度是1.0nM。
胰凝乳蛋白酶試驗使用生色底物，S-2586(甲氧基-琥珀?；?L-精氨酸-L-脯氨?；?L-酪氨?；?p-硝基苯胺)，獲自DiaPharma Group測定了胰凝乳蛋白酶催化活性。將底物配制于去離子水，然后在試驗前用HBSA稀釋，其中最終濃度是100毫摩爾(約9倍Km)。純化(3X-結(jié)晶的；CDI)牛胰α-胰凝乳蛋白酶獲自WorthingtonBiochemical Corp。將酶配制于去離子水，試驗前稀釋于HBSA，最終濃度是0.5nM。
胰蛋白酶試驗使用生色底物，S-2222(苯甲酰基-L-異亮氨酸-L-谷氨酸-[γ-甲酯]-L-精氨酸-p-硝基苯胺)，獲自DiaPharma Group測定了胰蛋白酶催化活性。將底物配制于去離子水，然后在試驗前用HBSA稀釋，其中最終濃度是250毫摩爾(約4倍Km)。純化(3X-結(jié)晶的；TRL3)牛胰蛋白酶獲自Worthington BiochemicalCorp。將酶配制于去離子水，試驗前稀釋于HBSA，最終濃度是0.5nM。
表Ⅰ表Ⅰ列出了本發(fā)明化合物對上述酶的測定IC50值，顯示與其它絲氨酸蛋白酶比較，對尿激酶抑制的高度特異性。表Ⅰ
*A=小于100nmB=100-200nmC=250-2500nmD=大于2500nmNT=未檢測到實施例B化合物1作為體內(nèi)血管形成抑制劑的評估用雞CAM(雞胚絨毛尿囊膜)模型(這是一種標準抗血管形成試驗)評估化合物1抑制血管形成的能力。該模型是已建立的評估試驗化合物影響新血管形成活性的模型。
將一片用0.5微克/毫升堿性纖維生長因子(bFGF)飽和的濾紙片置于10天齡的雞胚CAM上，來誘導血管生長。24小時后，將0-1微克化合物1的總體積為100微升的無菌PBS靜脈內(nèi)注射入胚胎。約48小時后，殺死雞胚，切下濾紙片和周圍的CAM組織用于分析。通過對貼近濾紙的區(qū)域中的血管分枝點數(shù)進行計數(shù)來定量血管形成[Brooks,P.C.，等，分子生物學方法120:257-269(1999)]。將血管形成指數(shù)定義為實驗組和未處理的對照組之間血管分枝點數(shù)的差異。各實驗組含有8到10個雞胚。單施用1微克化合物1在該實驗中抑制92％的血管形成。
表Ⅱ
實施例C化合物1抑制人腫瘤細胞在雞胚模型中生長的評估用雞胚模型來評估化合物1抑制人腫瘤細胞體內(nèi)生長的活性。將含有4×105細胞，總體積為40微升的人纖維肉瘤細胞的單細胞懸液涂在如Brooks等(“Brooks,P.C.等“整合素αrβ3拮抗劑通過誘導血管形成的凋亡促進腫瘤衰退”，細胞79:1157-1164(1994))所述的10日齡雞胚上。24小時后，將0-10微克化合物1靜脈注射入胚胎。一次施用化合物后，培育對照和處理的胚胎共7天，然后殺死。切下腫瘤，剪去周圍的CAM組織，并稱重。表Ⅲ列出了該實驗中切下的腫瘤濕重。各實驗組含有10-12個雞胚。單劑的10微克化合物減少腫瘤重量約65％。
表Ⅲ
權(quán)利要求
1．一種化合物，其特征在于，該化合物具有下式 其中(a)X選自-S(O)2-、-N(R’)-S(O)2-、-(C=O)-、-OC(=O)-、-NH-C(=O)-、-P(O)(R’)-、和直接的化學鍵，其中R’分別是氫、1到約4個碳原子的烷基、約6到14個碳原子的芳基或約7到16個碳原子的芳烷基，條件是當X是-P(O)(R’)-時，R’不是氫；(b)R1選自(1)可任選的被Y1取代的1到約12個碳原子的烷基，(2)被約5到8個碳原子的環(huán)烷基取代的1到約3個碳原子的烷基，所述環(huán)烷基可任選的被Y1、Y2和/或Y3在環(huán)上單-、二-或三取代，(3)在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3可任選的單-、二-、或三取代的3到約15個碳原子的環(huán)烷基，(4)4到約10個環(huán)上原子的雜環(huán)烷基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，所述雜原子選自氧、氮、和S(O)i，其中i是0、1或2，該雜環(huán)烷基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(5)4到約10個環(huán)上原子的雜環(huán)基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中i是0、1或2，包括 其中 是5到7個成員的雜環(huán)，具有3到6個環(huán)上碳原子，而V是-CH2-、-O-、-S(=O)-、-S(O)2-或-S-，V可任選在環(huán)上碳原子上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(6)2到約6個碳原子的鏈烯基，所述鏈烯基可任選的被約5到8個碳原子的環(huán)烷基取代，所述環(huán)烷基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(7)約6到14個碳原子的芳基，所述芳基可任選被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(8)約5到14個環(huán)上原子的雜芳基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，所述雜芳基可任選被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(9)約7到15個碳原子的芳烷基，所述芳烷基可任選在芳環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(10)約5到14個環(huán)上原子的雜芳烷基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，而且所述雜芳烷基在烷基鏈上任選被羥基和鹵素取代，并可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(11)約8到16個碳原子的芳烯基，所述芳烯基在芳環(huán)上可任選被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(12)約5到14個環(huán)上原子的雜芳烯基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，所述雜芳烯基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代， (17)約9到15個碳原子的稠合碳環(huán)烷基；(18)二氟甲基或1到約12個碳原子的全氟烷基，(19)約6到約14個碳原子的全氟芳基，(20)約7到15個碳原子的全氟芳烷基，和(21)氫，當X是直接鍵時；其中Y1、Y2和Y3是獨立的，而且是(ⅰ)選自鹵素、氰基、硝基、四唑基、胍基、脒基、甲基胍基、-CF3、-CF2CF3、-CH(CF3)2、-C(OH)(CF3)2、-OCF3、-OCF2H、-OCF2CF3、-OC(O)NH2、-OC(O)NHZ1、-OC(O)NZ1Z2、-NHC(O)Z1、-NHC(O)NH2、-NH(O)NZ1、-NHC(O)NZ1NZ2、-C(O)OH、-C(O)OZ1、-C(O)NH2、-C(O)NHZ1、-C(O)NZ1Z2、-P(O)3H2、-P(O)3(Z1)2、-S(O)3H、-S(O)mZ1、-Z1、-OZ1、-OH、-NH2、-NHZ1、-NZ1Z2、-N-嗎啉基、-S(CF2)qCF3、和-S(O)m(CF2)qCF3，其中m是0、1或2,q是0到5的整數(shù)，而Z1和Z2分別選自1到約12碳原子的烷基，約6到14個碳原子的芳基，約5到14個環(huán)上原子的雜芳基，約7到15個碳原子的芳烷基，和約5到14個環(huán)上原子的雜芳烷基，或(ⅱ)Y1和Y2合起來選自-O[C(Z3)(Z4)]rO-，其中r是1到4的整數(shù)，而Z3和Z4分別是選自氫、1到約12個碳原子的烷基，約6到14個碳原子的芳基，約5到14個環(huán)上原子的雜芳基，約7到15個碳原子的芳烷基和約5到14個環(huán)上原子的雜芳烷基；(c)R2選自H、-CH3、-C2H5、-(CH2)2OH、-(CH2)2OA2、-CH(R6)OH、-CH(R6)OA2和-CH2NH-X’-R6，其中A2是-C(=O)OR9或-C(=O)R9；X’是選自-S(O)2-、-S(O)2-N(R″)-、-(C=O)-、-C(=O)-O-、-C(=O)-NH-、-P(O)(R″)-、和直接鍵，其中R″是氫，1到約4個碳原子的烷基，約6到14個碳原子的芳基，或約7到16個碳原子的芳烷基，條件是當X’是-P(O)(R″)-時，R″不是氫；R6選自(1)1到約12個碳原子的烷基，可任選的被Y1取代，(2)被約5到8個碳原子的環(huán)烷基取代的1到約3個碳原子的烷基，所述烷基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(3)3到約15個碳原子的環(huán)烷基，所述環(huán)烷基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(4)4到約10個環(huán)上原子的雜環(huán)烷基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中i是0、1或2，所述雜環(huán)烷基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(5)4到約10個環(huán)上原子的雜環(huán)基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中i是0、1或2，包括 其中 是5到7個成員的雜環(huán)，具有3到6個環(huán)上碳原子，而V是-CH2-、-O-、-S(=O)-、-S(O)2-、或-S-，所述雜環(huán)基可任選在環(huán)上碳原子上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(6)2到約6個碳原子的烯基，其可任選被約5到8個碳原子的環(huán)烷基取代，該烯基可任選的在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(7)約6到14個碳原子的芳基，其可任選被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(8)約5到14個環(huán)上原子的雜芳基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，所述雜芳基可任選的被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(9)約7到15個碳原子的芳烷基，所述芳烷基可任選在芳環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(10)約5到14個環(huán)上原子的雜芳烷基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，而且所述雜芳烷基可任選的在烷基鏈上被羥基或鹵素取代，可任選的在芳環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(11)約8到16個碳原子的芳烯基，其可任選在芳環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(12)5到約14個環(huán)上原子的雜芳烯基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，所述雜芳烯基可任選在環(huán)上碳原子上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，和(13)氫；和R9選自(1)可任選的被Y1取代的1到約12個碳原子的烷基，(2)被約5到8個碳原子的環(huán)烷基取代的1到約3個碳原子的烷基，所述烷基可任選的在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(3)3到約15個碳原子的環(huán)烷基，所述環(huán)烷基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(4)4到約10個環(huán)上原子的雜環(huán)烷基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中i是0、1或2，所述雜環(huán)烷基可任選的在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(5)4到約10個環(huán)上原子的雜環(huán)基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和S(O)i，其中i是0、1或2，包括 其中 是5到7個成員的雜環(huán)，具有3到6個環(huán)上碳原子，而V是-CH2-、-O-、-S(=O)-、-S(O)2-、或-S-，所述雜環(huán)基可任選的在環(huán)上碳原子上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(6)6到約14個碳原子的芳基，所述芳基可任選被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(7)約5到14個環(huán)上原子的雜芳基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，而且所述雜芳基可任選在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(8)約7到15個碳原子的芳烷基，所述芳烷基可任選在芳環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，(9)約5到14個環(huán)上原子的雜芳烷基，環(huán)上原子選自碳和雜原子，其中雜原子選自氧、氮和硫，而且所述雜芳烷基可任選的在烷基鏈上被羥基或鹵素取代，并可任選的在環(huán)上被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，和(10)氫，條件是當A2是-C(=O)OR9時，R9不是氫；(d)R3選自H或甲基，或R3和R4合起來選自在(f)中列出的；(e)R4是S構(gòu)型，而且選自H、-CH2-S-CH3、-CH2OH、-CH2CN、1到約3個碳原子的低級烷基，-CH2C≡CH、-CH2CH=CH2和-CH=CH2或R3和R4合起來選自在(f)中列出的；(f)或者，R3和R4合起來是S構(gòu)型，在P2形成選自脯氨酰基、甲基哌啶基、吖丁啶-2-羰基、4-羥基脯氨酰基、3-羥基脯氨酰基和3,4-脫氫脯氨?；幕鶊F；(g)R5是選自 和 其中R7選自 和 其中d是1到3的整數(shù)，而W是-N-或-CH-；和(h)A1是-NHR8，其中R8是1到約12個碳原子的烷基，約6到14個碳原子的芳基，或約6到15個碳原子的芳烷基，所有的都可任選被Y1、Y2和/或Y3單-、二-、或三取代，或是氫；及其藥物學上接受的鹽。
2．如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R5是
3．如權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于，R7是
4．如權(quán)利要求3所述的化合物，其特征在于，d是2。
5．如權(quán)利要求4所述的化合物，其特征在于，R2是H、-CH3、-CH2CH3、-CH2NH(X’)(R6)或-CH(R6)OH。
6．如權(quán)利要求5所述的化合物，其特征在于，R6是氫、可任選的被Y1取代的烷基或可任選的被Y1、Y2和/或Y3單-、雙-或三-取代的芳烷基。
7．如權(quán)利要求6所述的化合物，其特征在于，R2是H、-CH2OH或-CH(CH3)OH。
8．如權(quán)利要求7所述的化合物，其特征在于，R2是-CH(CH3)OH并具有R構(gòu)型。
9．如權(quán)利要求7所述的化合物，其特征在于，R3是氫。
10．如權(quán)利要求9所述的化合物，其特征在于，R4是甲基或炔丙基。
11．如權(quán)利要求7所述的化合物，其特征在于，R3和R4是合起來選擇，得到在P2處選自脯氨?；?、甲基哌啶基、吖丁啶-2-羰基、4-羥基脯氨?；?-羥基脯氨?；?,4-脫氫脯氨?；幕鶊F。
12．如權(quán)利要求11所述的化合物，其特征在于，R3和R4合起來選擇，得到在P2處選自脯氨?；?-順-羥基脯氨?；?、3,4-脫氫脯氨?；瓦苟∴?2-羰基的基團。
13．如權(quán)利要求5所述的化合物，其特征在于，R6是H。
14．如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，X選自-S(O)2-、-OC(=O)-、-NH-C(=O)-和直接鍵。
15．如權(quán)利要求14所述的化合物，其特征在于，X是-S(O)2-或-OC(=O)-。
16．如權(quán)利要求15所述的化合物，其特征在于，R1是選自苯基、芐基、2-苯基乙基、異丁基和3-苯基丙基。
17．如權(quán)利要求16所述的化合物，其特征在于，R1-X-是選自苯基-S(O)2-、芐基-S(O)2-、2-苯基乙基-S(O)2-、3-苯基丙基-S(O)2-、芐基-OC(=O)-和異丁基-OC(=O)-。
18．如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R2選自氫、甲基、乙基、-CH2NH(X’)(R6)和-CH(R6)OH。
19．如權(quán)利要求18所述的化合物，其特征在于，R6是氫、可任選的被Y1取代的烷基或可任選的被Y1、Y2和/或Y3單-、雙-或三-取代的芳烷基。
20．如權(quán)利要求19所述的化合物，其特征在于，選擇R2在P3處得到選自甘氨?；-絲氨?；?、(R,R)D-別蘇氨?；?、D-2-氨基丁酰基、N-β-甲氧基羰基-D-2,3-二氨基丙?；-β-(2-苯基乙基羰基)-D-2,3-二氨基丙?；蚇-β-芐氧基羰基-D-2,3-二氨基丙酰基。
21．如權(quán)利要求20所述的化合物，其特征在于，P3是D-絲氨?；?R,R)D-別蘇氨?；?br> 22．如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R3是氫。
23．如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R4是甲基或炔丙基。
24．如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，合起來選擇，R3和R4在P2處形成選自脯氨?；⒓谆哙せ?、吖丁啶-2-羰基、4-羥基脯氨?；?-羥基脯氨?；?,4-脫氫脯氨酰基的基團。
25．如權(quán)利要求24所述的化合物，其特征在于，合起來選擇，R3和R4在P2處形成選自脯氨?；?、4-順-羥基脯氨?；?、3,4-脫氫脯氨?；瓦苟∴?2-羰基的基團。
26．如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，選擇R2在P3處形成D-絲氨?；?R,R’)D-別蘇氨?；?，選擇R5在P1處形成精氨酸醛。
27．如權(quán)利要求26所述的化合物，其特征在于，R3是氫而R4是甲基。
28．如權(quán)利要求26所述的化合物，其特征在于，合起來選擇，R3和R4在P2處形成選自脯氨?；?、吖丁啶-2-羰基和3,4-脫氫脯氨酰基的基團。
29．如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R5是
30．如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，該化合物選自 和
31．如權(quán)利要求7所述的化合物，其特征在于，R2是-CH2OH，而且具有R構(gòu)型。
32．一種化合物，其特征在于，該化合物具有式 及其藥物學上可接受的鹽。
33．如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R2是-(CH2)OA2或-CH(R6)OA2。
34．如權(quán)利要求33所述的化合物，其特征在于，R2是-CH(R6)OA2。
35．如權(quán)利要求34所述的化合物，其特征在于，R6選自氫、可任選的被Y1取代的烷基或可任選的被Y1、Y2和/或Y3單-、雙-或三-取代的芳烷基。
36．如權(quán)利要求35所述的化合物，其特征在于，選擇R2在P3處形成選自烯丙基和D-絲氨酰基的碳酸酯的基團。
37．如權(quán)利要求36所述的化合物，其特征在于，R3是氫。
38．如權(quán)利要求37所述的化合物，其特征在于，R4是甲基或炔丙基。
39．如如權(quán)利要求36所述的化合物，其特征在于，合起來選擇，R3和R4在P2處形成選自脯氨?；⒓谆哙せ?、吖丁啶-2-羰基、4-羥基脯氨?；?、3-羥基脯氨?；?,4-脫氫脯氨酰基的基團。
40．如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，選擇R2在P3處形成?；虳-絲氨?；奶妓狨サ然鶊F，選擇R5在P1處形成精氨酸醛。
41．如權(quán)利要求40所述的化合物，其特征在于，R3是氫而R4是甲基。
42．如權(quán)利要求40所述的化合物，其特征在于，合起來選擇，R3和R4在P2處形成選自脯氨?；⑦苟∴?2-羰基和3,4-脫氫脯氨?；幕鶊F。
43．如權(quán)利要求4所述的化合物，其特征在于，R2選自-(CH2)2OA2或-CH(R6)OA2。
44．如權(quán)利要求4所述的化合物，其特征在于，選擇R2在P3處形成選自?；虳-絲氨酰基的碳酸酯的基團。
45．如權(quán)利要求29所述的化合物，其特征在于，R2選自氫、-CH3、-CH2CH3、-CH2NH(X’)(R6)和-CH(R6)OH。
46．如權(quán)利要求29所述的化合物，其特征在于，R2是-(CH2)OA2或-CH(R6)OA2。
47．一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物包含藥物學上可接受的載體和治療上有效量的權(quán)利要求1所述的化合物。
48．一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物包含藥物學上可接受的載體和治療上可接受量的權(quán)利要求4所述的化合物。
49．一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物包含藥物學上可接受的載體和治療上可接受量的權(quán)利要求12所述的化合物。
50．一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物包含藥物學上可接受的載體和治療上可接受量的權(quán)利要求17所述的化合物。
51．一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物包含藥物學上可接受的載體和治療上可接受量的權(quán)利要求21所述的化合物。
52．一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物包含藥物學上可接受的載體和治療上可接受量的權(quán)利要求24所述的化合物。
53．一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物包含藥物學上可接受的載體和治療上可接受量的權(quán)利要求26所述的化合物。
54．一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物包含藥物學上可接受的載體和治療上可接受量的權(quán)利要求30所述的化合物。
55．一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物包含藥物學上可接受的載體和治療上有效量的權(quán)利要求32所述的化合物。
56．一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物包含藥物學上可接受的載體和治療上有效量的權(quán)利要求33所述的化合物。
57．一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物包含藥物學上可接受的載體和治療上有效量的權(quán)利要求40所述的化合物。
58．一種治療在需要治療的哺乳動物體內(nèi)通過抑制或減弱尿激酶活性而改善的情況的方法，其特征在于，該方法包括施給所述哺乳動物治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物。
59．一種治療在需要治療的哺乳動物體內(nèi)通過抑制或減弱尿激酶活性而改善的情況的方法，其特征在于，該方法包括施給所述哺乳動物治療有效量的權(quán)利要求4所述的化合物。
60．一種治療在需要治療的哺乳動物體內(nèi)通過抑制或減弱尿激酶活性而改善的情況的方法，其特征在于，該方法包括施給所述哺乳動物治療有效量的權(quán)利要求12所述的化合物。
61．一種治療在需要治療的哺乳動物體內(nèi)通過抑制或減弱尿激酶活性而改善的情況的方法，其特征在于，該方法包括施給所述哺乳動物治療有效量的權(quán)利要求17所述的化合物。
62．一種治療在需要治療的哺乳動物體內(nèi)通過抑制或減弱尿激酶活性而改善的情況的方法，其特征在于，該方法包括施給所述哺乳動物治療有效量的權(quán)利要求21所述的化合物。
63．一種治療在需要治療的哺乳動物體內(nèi)通過抑制或減弱尿激酶活性而改善的情況的方法，其特征在于，該方法包括施給所述哺乳動物治療有效量的權(quán)利要求24所述的化合物。
64．一種治療在需要治療的哺乳動物體內(nèi)通過抑制或減弱尿激酶活性而改善的情況的方法，其特征在于，該方法包括施給所述哺乳動物治療有效量的權(quán)利要求26所述的化合物。
65．一種治療在需要治療的哺乳動物體內(nèi)通過抑制或減弱尿激酶活性而改善的情況的方法，其特征在于，該方法包括施給所述哺乳動物治療有效量的權(quán)利要求30所述的化合物。
66．一種治療在需要治療的哺乳動物體內(nèi)通過抑制或減弱尿激酶活性而改善的情況的方法，其特征在于，該方法包括施給所述哺乳動物治療有效量的權(quán)利要求32所述的化合物。
67．一種在需要治療的哺乳動物體內(nèi)減弱或抑制血管形成的方法，其特征在于，該方法包括施給所述哺乳動物治療有效量的權(quán)利要求32所述的化合物。
68．如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，該方法包括所述血管形成與病理情況有關(guān)。
69．一種治療在需要治療的哺乳動物體內(nèi)通過抑制或減弱尿激酶活性而改善的情況的方法，其特征在于，該方法包括施給所述哺乳動物治療有效量的權(quán)利要求33所述的化合物。
70．一種治療在需要治療的哺乳動物體內(nèi)通過抑制或減弱尿激酶活性而改善的情況的方法，其特征在于，該方法包括施給所述哺乳動物治療有效量的權(quán)利要求40所述的化合物。
全文摘要
提供了具有尿激酶抑制劑和減弱或抑制血管形成活性的新穎化合物。這些化合物在P1處具有精氨酸或精氨酸擬醛,或精氨酸酮酰胺基團。這些化合物可用于在體外監(jiān)測纖溶酶激活物水平,和在體內(nèi)治療通過尿激酶抑制或減弱的活性而改善的情況,和治療血管形成與病理情況相關(guān)的病理情況。
文檔編號A61P9/10GK1313863SQ99810002
公開日2001年9月19日 申請日期1999年7月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月24日
發(fā)明者T·K·布蘭克, S·Y·塔穆拉 申請人:科爾凡斯國際股份有限公司