專利名稱：人乳頭瘤病毒多肽和免疫原性組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于治療或預防宮頸癌和由人乳頭瘤病毒(HPV)引起的其它癌癥的藥物組合物和免疫原性組合物。具體而言，本發(fā)明涉及用于產生抗HPV的免疫反應的融合蛋白，及編碼這些融合蛋白的核酸。這些融合蛋白和多核苷酸用于治療和預防HPV-誘導的癌癥。
背景技術：
子宮頸癌是婦女與腫瘤有關的死亡的第二主要原因，全世界每年有250,000人死亡。已知所有宮頸癌中有超過99％均與人乳頭瘤病毒(HPV)感染有關，其中50％與16型HPV(HPV16)直接關聯(lián)(Walboomers等人，JPath.1999，18912-19)。而絕大多數HPV16感染都是沒有癥狀且短暫的，而它們確定的百分比則較持久。約1％持續(xù)感染的個體由于被稱作宮頸上皮內瘤形成(CIN)的嚴重宮頸損害而不斷發(fā)展，并最終發(fā)展成侵入性宮頸癌。
需要被稱作E6和E7的早期HPV蛋白來維持惡性表型(Von Knebel等人，Int J Cancer 1992，51831-4；Crook等人，Embo J 1989，8513-9；He和Huang，Cancer Res.1997，573993-9)。這些蛋白在CIN損害和癌中始終如一地表達(Smotkin和Wettstein，Proc NatlAcad Sci USA 1986，834680-4；Durst等人，Virology 1992，189132-40)。這些蛋白通過破壞細胞周期的調節(jié)而誘導上皮增殖。特別是，E7結合并滅活細胞腫瘤抑制劑成視網膜細胞瘤蛋白(Rb)(Dyson等人，Science 1989，243934-7)，其導致細胞發(fā)展成細胞周期的S-期(Cobrinik等人，Trends Biochem Sci 1992，17312-5)。HPV 16的E6蛋白誘導腫瘤抑制蛋白p53的降解(Scheffner等人，Cell1990，631129-36)，防止細胞經歷編程性細胞死亡。
因為腫瘤細胞組成型表達E6和E7蛋白，且這些蛋白不存在于正常細胞中，因此這些病毒蛋白是癌癥免疫療法的非常有吸引力的目標。很多證據表明抗人E6和E7的細胞-介導的免疫反應與HPV損害的天然退化和病毒DNA清除有關(Nakagawa等人，J Infect Dis 1997，175927-31；Kadish等人，J Natl Cancer Inst 1997，891285-93)。且在不同的鼠模型中，抗E7的CTL反應顯示出可保護小鼠免受HPV16-陽性腫瘤的侵襲(Feltkamp等人，Eur J Immunnol 1995，252638-42；Lin等人，Cancer Res 1996，5621-6)。
因為細胞-介導的免疫性(CMI)對于控制HPV感染和疾病似乎很重要(Eiben，G.L.等人，Adv Can Res 2002，86113-148)，因此治療性疫苗應當對人白細胞抗原(HLA)多樣性群體中有效覆蓋的若干HPVE6和E7抗原性肽產生最佳的T細胞反應。
用于送遞E6/E7抗原的有價值的疫苗載體是來源于委內瑞拉馬腦炎病毒的減毒3014株的重組甲病毒(AV)載體(VEE；Velders M.P.等人，Cancer Res 2001，617861-7867)。復制機能不全的VEE復制子顆粒(VRP)已被證實是對多數臨床前期感染疾病和腫瘤模型都十分有效的疫苗(Rayner，J.O.等人，Rev Med Virol 2002，12279-296)。AV-衍生的復制子載體，如VEE編碼RNA形式的異源基因，不會在最初感染外擴散，并誘導感染細胞的編程性細胞死亡(Griffith，D.E.等人，Annu.Rev.Microbiol.1997，51565-592)。這些限制了延長蛋白表達或整合到宿主DNA中的機會，而這些是自然感染后HPV-誘導的惡性腫瘤的特征。預先存在的抗-VEE免疫性的低水平流行和用VRP反復免疫的前景(Pushko，P.等人，Virology 1997，239389-401)要優(yōu)于其它重組病毒載體，如牛痘病毒或腺病毒。
癌癥免疫療法的目標，E6和E7具有轉化活性。因此，目前本領域中預期的使用E6和E7的免疫療法具有潛在的危險性，這是因為這些蛋白可誘導細胞的轉化和永生化。
這些導致對治療和預防CIN和宮頸癌的有效組合物的未實現(xiàn)需要。更具體而言，仍然需要包括基于E6-和/或E7-成分的免疫原性組合物，它們是安全的且可有效治療和/或預防CIN、宮頸癌、肛癌、和其它這類疾病。
由于缺少小鼠I類HLA表達腫瘤模型，所以HPV免疫原性組合物先前的研究受到了限制。此處描述了HPV 16 E6/B7陽性模型；該模型在HLA-A*0201轉基因小鼠中形成了逐漸生長的腫瘤。
發(fā)明概述本發(fā)明通過提供藥物組合物和多肽而滿足了上述和其它需要，所述藥物組合物和多肽包含E6和E7多肽的融合體，它具有可降低生物活性的突變和/或融合順序(E7E6)，因此轉化E6和E7的活性潛能。
具體而言，本發(fā)明提供新的E6/E7融合多肽以及編碼它們的多核苷酸。在具體實施方案中，本發(fā)明提供包含人乳頭瘤病毒E6和E7多肽的多肽，其中該E7多肽在與SEQ ID NO14的氨基酸24、26或91相對應的任何一個或多個氨基酸處具有突變且該E6多肽沒有突變或在與SEQ ID NO13的氨基酸63或106相對應的任何一個或多個氨基酸處具有突變。在具體實施方案中，在該融合多肽所含的E7多肽中，與SEQ ID NO14的氨基酸24和26相對應的其中一個、優(yōu)選兩個氨基酸發(fā)生突變。這些突變多肽可在這些突變位置的任何一個上具有甘氨酸殘基且E6可以在E7的羧基末端或氨基末端。
本發(fā)明還提供編碼這些多肽的分離核酸。例如，在本發(fā)明其中一個實施方案中，所述分離的核酸包含人乳頭瘤病毒E6和E7序列，其中E6核苷酸序列在與HPV 16 E6基因的核苷酸187-189或316-318相對應的任何核苷酸處具有突變，且E7核苷酸序列在與HPV 16 E7基因的核苷酸70-72、76-78、或271-273相對應的任何核苷酸處具有突變，且其中所述突變得到不同的被編碼的氨基酸。本發(fā)明還提供包含這些多肽和多核苷酸的藥物組合物和免疫原性組合物。
本發(fā)明還提供具有SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9、或SEQ ID NO11所示氨基酸序列的分離的多肽。在其它實施方案中，本發(fā)明提供編碼這種多肽的分離核酸，它包括具有核苷酸序列SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO10或SEQ ID NO12的核酸。
還提供了包含編碼E6/E7融合體的核酸序列的表達載體。例如，在具體實施方案中，本發(fā)明提供包含與表達控制序列可操縱連接(例如，受表達控制序列的控制)的SEQ ID NOS4、6、10或12的表達載體。
還提供了包含編碼E6/E7融合體的核酸的宿主細胞，以及表達或包含E6/E7融合多肽的宿主細胞。
在其它實施方案中，本發(fā)明還提供免疫原性組合物，它包含本發(fā)明的核酸或多肽且用于，例如，治療或預防宮頸癌。這種免疫原性組合物可包含(a)本發(fā)明的多肽(例如，包含人乳頭瘤病毒E6和E7多肽的多肽，其中該E7多肽在與SEQ ID NO14的氨基酸24、26或91相對應的任何一個或多個氨基酸處具有突變且該E6多肽沒有突變或在與SEQ ID NO13的氨基酸63或106相對應的任何一個或多個氨基酸處具有突變)，和(b)藥學可接受的載體。任選地，本發(fā)明的免疫原性組合物還可包含佐劑。
還提供了重組病毒，它包含本發(fā)明的一個或多個核酸，和/或編碼一個或多個本發(fā)明的多肽。因此，例如，本發(fā)明的重組病毒可包含SEQID NO3、5、9或11所示的編碼多肽的核酸，且更特別是具有SEQ IDNOS4、6、10或12的任何一個所示的序列。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的重組病毒是修飾的委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)。
此外還提供了使用上述組合物的方法，且這種方法也被認為是本發(fā)明的一部分。因此，本發(fā)明還提供一種通過給予個體免疫有效量的本發(fā)明多肽(例如，具有SEQ ID NOS3、5、9或11的任何一個所示的氨基酸序列的多肽)和藥學有效載體而在個體中產生免疫反應的方法。
還提供了用于治療和/或預防宮頸癌的方法。例如，在其中一個實施方案中，本發(fā)明提供用于治療宮頸癌的方法，其中給予被診斷患有宮頸癌的患者本發(fā)明的多肽(例如，具有SEQ ID NOS3、5、9或11的任何一個所示的氨基酸序列的多肽)和藥學可接受的載體。在其它實施方案中，本發(fā)明提供用于預防宮頸癌的方法，其中給予個體本發(fā)明的多肽和藥學可接受的載體。在另一實施方案中，本發(fā)明提供通過給予患者免疫有效量的本發(fā)明核酸(例如，多肽所具有的核酸序列編碼具有SEQ ID NOS3、5、9、或11，特別是SEQ ID NOS4、6、10或12的任何一個所示的氨基酸序列的多肽)而治療和/或預防患者宮頸癌的方法。
附圖簡述

圖1A和1B是表示被引入到HPV16 E6和E7蛋白中的點突變相關于主要的HLA-AI類等位基因的推定表位的位置的示意圖。圖1A表示E6中天然存在的氨基酸，63C和106C，它們每一個均突變成甘氨酸。圖1B表示E7中天然存在的氨基酸，24C、26E、和91C，它們每一個均突變成甘氨酸。先前定義的能夠結合HLA-A1、A2、A3、A11且A24等位基因的I類表位在帶條紋的格中表示(Kast，W.M.等人，J Immunol1994，1523904-3912)。
圖2A-E是表示人乳頭瘤病毒18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68(分別是SEQ ID NOS15-26)的E6多肽氨基酸序列的序列比對和共有序列的圖。所述共有序列(SEQ ID NO39)在下面的序列比對中表示。共有序列中的大寫字母表示完全共有的序列且共有序列中的小寫字母表示高頻，但不完全共有的序列。
圖3A-C是表示人乳頭瘤病毒18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68(分別是SEQ ID NOS27-38)的E7多肽氨基酸序列的序列比對和共有序列的圖。所述共有序列(SEQ ID NO40)在下面的序列比對中表示。共有序列中的大寫字母表示完全共有的序列且共有序列中的小寫字母表示高頻，但不完全共有的序列。
圖4A和4B是表示特異性溶解百分比對效應子與靶細胞(E∶T)比值的曲線圖，其代表VRP接種免疫后的CTL反應。用3×105IU的所示VRP給C57BL/6小鼠皮下接種免疫，并在1個月后進行CTL測定。細胞毒性是通過E7-MVA(A)或E6-MVA(B)感染的MC57G靶細胞的銪釋放測量的。這些結果在其它兩個實驗中再現(xiàn)(沒有給出數據)。
圖5A和5B是證實沒有腫瘤的小鼠百分比對腫瘤侵襲后天數的曲線圖。在第21-天和第7-天，用3×105IU的所示VRP免疫原性組合物給C57BL/6小鼠(n＝8/gp)引發(fā)免疫并加強，并在第0天用5×105個C3(A)或5×104個TC-1(B)腫瘤細胞侵襲側腹。每3天監(jiān)測腫瘤一次。
圖6是證實沒有腫瘤的小鼠百分比對腫瘤侵襲后天數的曲線圖。C57BL/6小鼠(n＝8-16/gp)在第0天接受5×105個C3腫瘤細胞并在第7、14、和21天用所示VRP接種免疫。每隔3天監(jiān)測腫瘤一次，共45天。
圖7是證實沒有腫瘤的小鼠百分比對腫瘤侵襲后天數的曲線圖。HLA-A*0201轉基因小鼠(n＝10/gp)在第0天接受2×106個HLF16腫瘤細胞并在第5、10、和15天用所示VRP接種免疫。每隔5天監(jiān)測腫瘤一次。
圖8A和8B是檢測感染了不同VRP制品的原代人乳上皮細胞(MEC)中p53(A)和Rb(B)表達的蛋白質印跡。用所示VRP(MOI＝10)感染后24小時，使25μg各MEC細胞溶解產物經過SDS-PAGE、印跡、并探測p53(A)和Rb(B)水平。相等的蛋白上樣是通過用抗-微管蛋白抗體探測證實的。E7蛋白的存在是通過用抗-E7抗體探測所示泳道證實的。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供HPV E6和E7蛋白的融合體，編碼這種融合體例子的核苷酸序列，及其突變體形式。雖然先前已經公開了用此方法鑒定的HPV 16的各種特異性突變(除E6 C106G之外，其先前僅突變成C106R(Dalal等人，J Virol 1996，70683-8))，但還沒有進行這些突變的組合，且還沒有測試這些突變的組合保留免疫原性而缺少轉化或永生化能力的能力。例如，還不知道兩種或多種突變的任何其它組合是否能夠產生維持它們免疫原性效能的多肽。本發(fā)明公開了E6/E7(此處所用術語“E6/E7”表示順序為E6E7、E7E6或兩者的融合體)蛋白的融合體，它包含這些突變的獨特組合，且令人吃驚地發(fā)現(xiàn)包含4或5個規(guī)定突變的E6/E7蛋白可維持它們的免疫原性效能。該發(fā)現(xiàn)特別重要，是因為治療性免疫原性組合物應對HLA多樣性群體中有效覆蓋度的若干HPV E6和E7抗原性肽產生最佳反應。本發(fā)明還公開了具有多個突變，同時維持它們免疫效能的這些E6/E7融合體不會維持E6和E7轉化能力，即p53和pRB降解所需的功能。具體而言，本發(fā)明的融合體不會誘導p53或Rb降解且，因此，用于送遞到患者中或在患者中表達時，比它們的非-突變對應物更安全。
本發(fā)明還公開了令人吃驚的發(fā)現(xiàn)，即E7E6融合體，即這種融合體中的E6在E7的羧基末端，與它們的E6E7對應物相比免疫活性增加。
在具體實施例中，生產HPV16 E6E7和E7E6融合蛋白并測試免疫原性和抗-腫瘤反應。將若干點突變引入到E6和E7基因中，從而將它們的致癌可能性滅活，同時保存已知的HLA表位。對H-2Db限制的E749-57表位的可比較CTL反應是在用3×105個編碼野生型或突變融合蛋白的VRP感染性單位接種免疫的小鼠中觀察到的。在90％或更多小鼠中，所有表達wt和突變融合蛋白的VRP免疫原性組合物均消除了7天-建立的C3腫瘤。此外，證實了E6E7融合構建體在兩個其它E6E7-陽性腫瘤模型中的抗-腫瘤效能。特別是，E7E6 TetM VRP在HLF16腫瘤模型中帶來完全的腫瘤排斥。用表達突變型，而不是野生型E6和E7基因的VRP感染的原代人乳上皮細胞證實了p53和成視網膜細胞瘤蛋白的正常水平。
本發(fā)明的E6E7和E7E6融合體本發(fā)明提供E6/E7融合多肽，它包含多個突變，如E7中的C24G、E26G和C91G和E6中的C63G和C106G(見圖1A和B)。例如，E6E7TetM和E7E6TetM融合多肽包含E7 C24G和E26G突變及E6 C63G和C106G突變，而E6E7PentM和E7E6PentM融合多肽除了存在于TetM突變體中的4個突變之外還包含C91G E7突變。這些突變的融合多肽，此外，可以是不穩(wěn)定的。本領域技術人員認識到不穩(wěn)定的蛋白，與穩(wěn)定的蛋白相比，發(fā)展CTL反應的能力增加。本領域的技術人員還認識到融合蛋白傾向于不發(fā)生適當折疊且因此較之它們未融合的對應物不太穩(wěn)定。因此，融合蛋白，如本發(fā)明中公開的那些，較之它們的未融合對應物更適于產生細胞-介導的免疫反應。
生產HPV16 E6E7和E7E6融合蛋白并測試免疫原性和抗-腫瘤反應。將若干點突變引入到E6和E7基因中以滅活它們的致癌可能性，同時保存已知的HLA表位。在本發(fā)明之前，還不知道此處所測試的突變組合是否能夠破壞多肽的免疫原性或是否這種突變多肽仍保留它們的免疫原性。在用3×105個編碼野生型或突變型融合蛋白的VRP感染性單位接種免疫的小鼠中觀察到了對H-2Db限制的E749-57表位的可比較CTL反應。表達所有野生型和突變型融合蛋白的VRP免疫原性組合物在90％或更多小鼠中均可消除7天-建立的C3腫瘤。此外，在兩個其它的E6E7-陽性腫瘤模型中證實了E6/E7融合構建體的抗-腫瘤效能。
本發(fā)明提供包含E6和E7的融合多肽，其中E6位于氨基末端或羧基末端。然而，本領域的技術人員可從即時公開認識到，即E6在E7羧基末端的融合體(E7E6融合體)，即E6跟在E7后面，如E7E6TetM和E7E6PentM，與其中E6在E7氨基末端的融合體(E6E7融合體，如E6E7TetM和E6E7PentM)相比，其免疫效能增加。此外，本領域技術人員還應認識到E7E6融合體，即其中E6在E7羧基末端的融合體與E6E7融合體相比，其E6活性降低了。因此，E7E6融合體通常被認為更安全。因此，其中E6在E7羧基末端的融合體是本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案。
本發(fā)明提供在與HPV16 E7的C24、E26和C91及HPV16 E6的C63和C106相對應的位置處的特定核苷酸和氨基酸突變的例子。例如，本發(fā)明提供半胱氨酸24突變成甘氨酸(核苷酸序列中的相應突變是CTG-CGG)。這些例子不是限制性的。例如，可使用類似導致鋅指破裂或Rb結合的突變。例如，可將對于鋅指形成至關重要的半胱氨酸殘基的突變改變成任何其它氨基酸。優(yōu)選的突變導致蛋白不穩(wěn)定且因此，蛋白的免疫原性增加。
在本發(fā)明的具體實施方案中，所述多肽是HPV 16 E6和E7的融合體，其中E7多肽在與SEQ ID NO14的24、26或91位置相對應的任何氨基酸處具有突變且E6多肽沒有突變或在與SEQ ID NO13的63或106位置相對應的一個或多個氨基酸處具有突變。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述多肽是HPV 16 E6和E7的融合體，其中E7多肽在與SEQ ID NO14的24和26位置相對應的氨基酸處具有突變且E6多肽在選自與SEQ ID NO13的63或106位置或兩個位置相對應的氨基酸處具有突變。
本領域技術人員應了解氨基酸數是通過以甲硫氨酸作為第一個氨基酸開始計算而測定的，甚至是在第二個融合蛋白中的第一個甲硫氨酸缺失的情況下。例如，E6E7TetM(SEQ ID NO3)的G24突變被認為位于多肽中E7的殘基24處。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，所速多核苷酸是HPV 16 E6和E7多核苷酸的融合體，其中E6多核苷酸在核苷酸187-189(其與HPV16基因組(基因銀行登記號K02718)的核苷酸290-292相對應)或316-318(其與HPV16基因組的核苷酸419-421相對應)的任何一個處具有突變或，E7核苷酸序列在核苷酸70-72(其與HPV16基因組的核苷酸631-633相對應)、76-78(其與HPV16基因組的核苷酸637-639相對應)或271-273(其與HPV16基因組的核苷酸832-834相對應)的任何一個處具有突變。這些核苷酸的改變導致錯義突變，而不是無義突變。換句話說，這些突變導致不同的氨基酸被編碼。
本發(fā)明提供包含這些多肽、或包含編碼這些多肽的核苷酸的多肽，和免疫原性組合物和藥物組合物。如下所述，這些多肽和多核苷酸以此處提供的序列描述。例如，E6E7TetM多肽在SEQ ID NO3中描述。本領域技術人員應認識到本發(fā)明的多肽和多核苷酸序列不限于本申請中公開的確切序列。例如，E6和E7序列是通過從HPV16的ATCCclone#45113進行PCR獲得的。該ATCC克隆的E6和E7序列與基因銀行HPV16序列，K02718中的那些稍有不同。因此，本領域技術人員應認識到本發(fā)明還包括與此處公開的那些基本同源或基本相似的氨基酸和核苷酸序列，且所述突變的組合可在任何一個E6或E7序列的背景中發(fā)生。例如，這些突變和這些突變任何數量的組合可位于K02718中公開的E6和E7序列背景中。
本領域技術人員應認識到除了HPV16之外，本發(fā)明還涉及乳頭瘤病毒家族的其它成員。與癌癥有關的其它乳頭瘤病毒基因型，特別是18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68在很可能對它們的致癌能力至關重要的E6和E7蛋白中具有保守基序(見FieldsVirology Fourth Edition，2001，Ch.65和66，2197-2265，Knipe& Howley Eds.，Lippincott Williams and Wilkins)。值得注意的是，這些E6和E7蛋白具有C-X-X-C鋅指基序且，對于E7而言，具有推定的Rb結合基序L-X-C-X-E。因此，本發(fā)明的實施方案包括來源于乳頭瘤病毒家族其它成員的E6和E7融合多肽和多核苷酸，它們具有與本發(fā)明公開的突變相應的突變。
與SEQ ID NOS1-12中公開的特定氨基酸和核苷酸位置相對應的氨基酸和核苷酸可通過進行序列比對而確定。這種序列比對的例子在圖2A-E和3A-C中表示。在這些圖中，已經將HPV18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68的E6和E7多肽的氨基酸進行了序列比對，并提出了共有序列。E6共有氨基酸序列在SEQ ID NO39中提出且E7共有氨基酸序列在SEQ ID NO40中提出。
這些序列比對證實了在本發(fā)明中測試的每個突變在這些HPV病毒的每一個中都是保守的且，因此，它們也可被突變從而剔除它們的致癌可能性，同時維持它們引發(fā)免疫反應的能力。涉及結構如鋅指和結合基序形成的氨基酸常常是保守的。人們可以，例如，鑒定并使與HPV基因型每個成員中的HPV16 E7的氨基酸24、26、和91或HPV 16 E6的氨基酸63或106相對應的保守氨基酸或核苷酸變異。例如，圖2A-E中所示的序列比對證實了與HPV16 E6的氨基酸63(63C)相對應的HPV18 E6氨基酸也是半胱氨酸殘基且位于HPV18 E6的位置65上。因此，除了與HPV16 E7的氨基酸24、26和91以及HPV16 E6的氨基酸106相對應的其它殘基之外，在本發(fā)明中，HPV 18 E6的66C也可發(fā)生突變。同樣，在本發(fā)明中，可對與E6共有序列(SEQ ID NO39)的氨基酸65或108相對應的任何HPV E6多肽或與E7共有序列(SEQ ID NO40)的氨基酸25、27或97相對應的任何HPV E7多肽進行突變。
在本發(fā)明其中一個實施方案中，所述融合多肽包含這些突變中的2個。在另一實施方案中，這些融合多肽包含這些突變中的3個。在另一實施方案中，這些融合多肽包含這些突變中的全部5個。
分子生物學定義。根據本發(fā)明，可使用本領域內的常規(guī)分子生物學、微生物學和重組DNA技術。這類技術在文獻中詳細描述。見，例如，Sambrook，Pitsch和Maniatis，Molecular CloningALaboratory Manual，Second Edition(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(此處稱作“Sambrook等人，1989”)；DNA CloningA Practical Approach，Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins，eds.1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRLPress，1986)；B.E.Perbal，A Practical Guide to MolecularCloning(1984)；F.M.Ausubel等人(eds.)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
此處的多核苷酸可利用天然調節(jié)序列側面連接，或與異源序列，包括啟動子、增強子、反應元件、信號序列、聚腺苷酸化序列、內含子、5′-和3′-非-編碼區(qū)等連接。所述核酸還可通過本領域已知的很多方法修飾。這種修飾的非-限制性例子包括甲基化，“帽”、一個或多個天然存在的核苷酸的置換(即，第三或原始“擺動”堿基的密碼子優(yōu)化)，及核苷酸間的修飾，如，例如，使用不帶電的鍵的那些(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸鹽、氨基甲酸酯等)和使用帶電的鍵的那些(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。多核苷酸可包含一個或多個附加的共價連接部分，如蛋白(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-賴氨酸等)、嵌入劑(例如，吖啶、補骨脂素等)、螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、鐵、氧化金屬等)和烷化劑等。所述多核苷酸可通過形成甲基或乙基磷酸三酯或烷基亞磷酰胺鍵而衍生。此外，此處的多核苷酸還可用能夠提供可檢測信號的標記直接或間接修飾。舉例性標記包括放射性同位素、熒光分子、生物素等。下面，在本發(fā)明的描述中提供可實施的有關修飾的其它非-限制性例子。
術語“基因”，也稱作“結構基因”是指編碼或與氨基酸的特定序列相對應的DNA序列，其包含一種或多種蛋白或酶的全部或一部分，且可包括或不包括調節(jié)DNA序列，如啟動子序列，其可決定，例如基因表達的條件。某些基因，它們不是結構基因，可從DNA轉錄成RNA，但不會被翻譯成氨基酸序列。其它基因可作為結構基因的調節(jié)子或DNA轉錄的調節(jié)子發(fā)揮作用。
“編碼序列”或“編碼”多肽、蛋白或酶的序列是核苷酸序列，當它們表達時，產生該多肽、蛋白或酶，即，該核苷酸序列編碼該多肽、蛋白、或酶的氨基酸序列。優(yōu)選，所述編碼序列是RNA序列，當受適宜調節(jié)序列的控制時，其在體外或體內被翻譯成細胞中的多肽。編碼序列的邊界是由靠近5’末端的起始密碼子和下游翻譯終止密碼子而確定的。編碼序列可包括，但不限于，原核序列、源于真核mRNA的cDNA，源于真核(例如，哺乳動物)DNA的基因組DNA序列，甚至合成的DNA序列。如果編碼序列用于在真核細胞中表達，則聚腺苷酸化信號和轉錄終止序列通常位于編碼序列的3’。
轉錄和翻譯控制序列是DNA調節(jié)序列，如啟動子、增強子、終止子等，提供編碼序列在宿主細胞中的表達。在真核細胞中，聚腺苷酸化信號是控制序列?！氨磉_控制序列”是涉及轉錄開始的轉錄控制序列，如啟動子和增強子。
“啟動子序列”是一種能夠結合細胞中RNA聚合酶且開始下游(3’方向)編碼序列的轉錄的DNA調節(jié)區(qū)。為了定義本發(fā)明，啟動子序列通過轉錄起始位點在其3’末端結合并伸展上游(5’方向)，從而包括以可檢測上述背景的水平開始轉錄所需的最小數量的堿基或元件。如上所述，啟動子DNA是開始、調節(jié)、或以其它方式介導或控制編碼DNA表達的DNA序列。
此處所用多核苷酸的“擴增”是指使用聚合酶鏈反應(PCR)增加DNA序列混合物內特定DNA的濃度。PCR的描述見Saiki等人，Science1988，239487。
術語“表達”是指使或引起基因或DNA序列中的信息顯現(xiàn)出來，例如通過激活涉及相應基因或DNA序列轉錄和翻譯的細胞功能而產生蛋白。DNA序列在細胞中表達或由細胞表達，形成“表達產物”如蛋白。表達產物本身，例如所得蛋白，也可被細胞表達。例如，當在外源或天然啟動子的控制下在外源宿主細胞中表達或產生時，或在外源啟動子的控制下在天然宿主細胞中表達或產生時，多核苷酸或多肽是重組表達的。
術語“轉染”是指將外源核酸引入到細胞中。術語“轉化”是指將“外源”(即外來的或胞外的)基因、DNA或RNA序列引入到宿主細胞中，這樣宿主細胞就可表達所引入的基因或序列，以產生所需物質，通常是由所引入的基因或序列編碼的蛋白或酶。所引入的基因或序列，其還可被稱作“克隆的”或“外源的”基因或序列，可包括調節(jié)或控制序列，如通過細胞的遺傳機構使用的起始、終止、啟動子、信號、分泌或其它序列。所述基因或序列可包括非功能性序列或功能未知的序列。接受且表達所引入DNA或RNA的宿主細胞已被“轉化”且是“轉化體”或“克隆”。被引入到宿主細胞中的DNA或RNA可來源于任何來源，包括與宿主細胞相同屬或種的細胞，或不同屬或種的細胞。
術語“載體”和“表達載體”是指通過它可將DNA或RNA序列(例如，外源基因)引入到宿主細胞中的載體，這樣就可轉化宿主并促進所引入序列的多肽的表達(例如，轉錄和翻譯)。
載體通常包括其中插入外源DNA的可傳遞劑的DNA。將DNA的其中一個片段插入到DNA的另一片段中的常用方法包括使用被稱作限制酶的酶裂解被稱作限制位點的特異性位點處(核苷酸的特異性基團)的DNA。通常，將外源DNA插入到載體DNA的一個或多個限制位點處，然后連同可傳遞載體DNA通過載體運送到宿主細胞中。具有插入或加成DNA的片段或序列，如表達載體，還可被稱作“DNA構建體”。
載體的常用類型是“質?！保渫ǔＪ请p鏈DNA自我包含的分子。質?？珊苋菀椎亟邮芷渌?外源)DNA且可很容易被引入到適宜宿主細胞中。質粒載體常常包含編碼DNA和啟動子DNA且具有適于插入外源DNA的一個或多個限制位點。啟動子DNA和編碼DNA可來源于相同基因或不同基因，且可來源于相同或不同生物。已經描述過大量載體，包括質粒和真菌載體，在各種真核和原核宿主中的復制和/或表達。非-限制性例子包括pKK質粒(Clontech)、pUC質粒、pET質粒(Novagen，Inc.，Madison，WI)、pRSET或pREP質粒(Invitrogen，San Diego，CA)、或pMAL質粒(New Englnd Biolabs，Beverly，MA)，和許多適宜的宿主細胞，使用此處公開或引證的方法或相關領域技術人員已知的其它方法。重組克隆載體常常包括一個或多個用于克隆或表達的復制系統(tǒng)，一個或多個用于在宿主中選擇的標記，例如抗生素抗性，和一個或多個表達彈夾。生物技術中的常規(guī)實驗可用于確定哪個克隆載體最適用于本發(fā)明。通常，克隆載體的選擇取決于多核苷酸序列和所用宿主細胞的大小。
“多肽”是被稱作化學構件的氨基酸鏈，它們由被稱作“肽鍵”的化學鍵連接。術語“蛋白”是指包含由基因或從基因直接或間接轉錄的核酸分子(例如，mRNA或cDNA)編碼的氨基酸殘基的多肽。任選地，蛋白可缺失某些由基因或mRNA編碼的氨基酸殘基。蛋白或多肽，包括酶，可以是“天然的”或“野生型的”，是指它可天然存在；或它可以是“突變體”、“變體”或“被修飾的”，是指它已被人工制造、改變、衍生，或某些方面不同于天然蛋白或其它突變體或自其改變。
“突變”是指產生突變蛋白、酶、多肽、多核苷酸、基因或細胞的任何方法或機理。這包括其中蛋白、酶、多核苷酸、或基因序列被改變的任何突變，且細胞中任何可檢測的改變是由這種突變引起的。所述改變的蛋白、酶、多肽或多核苷酸均是一種“突變體”，也被稱作“變體”。通常，突變發(fā)生于多核苷酸或基因序列中，通過單一或多個核苷酸殘基的點突變(置換)、缺失、或插入而進行。突變包括基因蛋白-編碼區(qū)內出現(xiàn)的多核苷酸改變以及蛋白-編碼序列以外區(qū)的改變，如，但不限于，調節(jié)或啟動子序列?；虻耐蛔兛梢允恰俺聊摹?，即表達后不反映在氨基酸改變中，產生基因的“序列-保守”變體。這通常是在一個氨基酸與不止一個密碼子相對應時發(fā)生。表1列出了哪個氨基酸對應于哪個密碼子。
因此，由于遺傳密碼的簡并，編碼此處所述E6/E7融合多肽的突變氨基酸殘基的任意3個-核苷酸密碼子均在本發(fā)明的范圍之內。
術語“突變體”和“變體”還可用于表示修飾或改變的基因、DNA或RNA序列、酶、細胞等，即，任何種類的突變體。這種改變還包括啟動子、核糖體結合位點等的改變。
術語“變體氨基酸序列”是指其它適宜的E6和E7融合多肽，通過不會消除免疫原性的修飾，它們可不同于具體舉例說明的E6和E7融合多肽。在進行這種改變時，可考慮氨基酸的親水指數。本領域技術人員通常均了解親水氨基酸指數在賦予多肽相互作用的生物功能方面的重要性(Kyte和Doolittle，1982)。已知某些氨基酸可被具有相似親水指數或值的其它氨基酸置換，且仍然產生具有相似生物活性的多肽。根據每個氨基酸的疏水性和電荷已為其分配了親水指數。那些指數是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸鹽(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天門冬氨酸鹽(-3.5)；天門冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
據信氨基酸殘基的相對親水性可決定所得多肽的二級和三級結構，其依次限定多肽與其它分子如酶、底物、受體、抗體、抗原等的相互作用。本領域已知氨基酸可被具有相似親水指數且仍然可獲得功能等價多肽的另一氨基酸置換。在這種改變中，優(yōu)選親水指數在+/-2以內的氨基酸置換，特別優(yōu)選+/-1以內的那些，且更特別優(yōu)選+/-0.5以內的那些。
相似氨基酸的置換還可基于親水性進行，特別是將由此創(chuàng)造的生物功能等價多肽或肽用于免疫方案中。美國專利號US4,554,101，其引入此處作為參考，指出由其相鄰氨基酸的親水性決定的多肽最大局部平均親水性與其免疫原性和抗原性相關，即與多肽的生物性質相關。
如美國專利號US4,554,101所述，將下列親水性值賦予氨基酸殘基精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天門冬氨酸鹽(+3.0+/-1)；谷氨酸鹽(+3.0+/-1)；絲氨酸(+0.3)；天門冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5+/-1)；蘇氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。應了解可將一個氨基酸置換為具有相似親水值且仍可獲得生物等價，且特別是免疫等價多肽的另一氨基酸。在進行這種改變時，優(yōu)選親水值+/-2以內的那些；特別優(yōu)選+/-1以內的那些；且甚至更特別優(yōu)選+/-0.5以內的那些的氨基酸置換。
如上所列，氨基酸置換通常以氨基酸側鏈取代基的相對相似性，例如，它們的疏水性、親水性、電荷、大小等為基礎。考慮到上述若干特性的舉例性置換是本領域技術人員熟知的且包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸鹽和天門冬氨酸鹽；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天門冬酰胺；及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
“功能-保守性變體”是其中規(guī)定的氨基酸殘基已被改變但沒有改變整個結構構象和蛋白或酶的規(guī)定功能的蛋白或酶。這包括但不限于，用具有相似結果或物理性質，包括極性或非-極性、大小、形狀和電荷的氨基酸取代另一氨基酸(見，例如，表1)。
表1氨基酸、相應的密碼子、和功能性/性質
此處所稱的“序列相似性”是指核苷酸或蛋白序列相關的程度。兩個序列間相似性的程度可以序列同一性和/或保守百分比為基礎。除所示那些外的保守氨基酸在蛋白或酶中是不同的，這樣任何兩個相似功能蛋白之間的蛋白或氨基酸序列相似性百分比就可發(fā)生改變，且可以是，例如，至少70％、甚至更優(yōu)選80％，且最優(yōu)選至少90％，正如按照序列比對方案測定的那樣。
此處的“序列同一性”是指兩個核苷酸或氨基酸序列不變的程度。
當在規(guī)定長度的DNA序列上，至少約80％、且最優(yōu)選至少約90％或95％的核苷酸相匹配時，則兩個DNA序列基本同源或基本相似，這是通過序列比較算法，如BLAST、FASTA、DNA Strider等確定的。這種序列的例子是本發(fā)明特定基因的等位基因或種類變體?；就吹男蛄锌赏ㄟ^使用序列數據銀行所用的標準軟件比較該序列而鑒定，或在DNA雜交實驗中鑒定，例如，在特定系統(tǒng)所規(guī)定的嚴格條件下雜交。
同樣，當超過80％的氨基酸相同，或超過約90％相似時，兩個氨基酸序列基本同源或基本相似。優(yōu)選，相似或同源的序列是通過序列比對鑒定的。
多肽序列的“序列-保守性變體”是規(guī)定密碼子內一個或多個核苷酸的改變沒有導致由該密碼子編碼的氨基酸改變的那些。
“序列比對”是指排列兩個或多個序列，從而獲得最高水平的序列同一性的方法(且，在氨基酸序列的情況下，保守)，例如，為了評價序列相似性的程度。用于排列序列并評價相似性和/或同一性的很多方法都是本領域已知的，如，例如Cluster方法，其中相似性是以MEGALIGN算法為基礎的，以及BLASTN、BLASTP、和FASTA(Lipman和Pearson，1985；Pearson和Lipman，1988)。當使用所有這些程序時，優(yōu)選的設置是產生最高序列相似性的那些。
術語“異源的”是指非天然存在的元件組合。例如，異源DNA是指非天然位于細胞中，或細胞染色體位點中的DNA。優(yōu)選，異源DNA包括對細胞而言是外源性的基因。異源表達調節(jié)元件是與不同基因可操縱連接的調節(jié)元件，它實際上是可操縱連接的。
修飾，其通常不會改變E6和E7融合多肽的初級序列，包括多肽的體內或體外化學衍生，例如，乙?；?、甲基化或羧化。本發(fā)明的變體多肽還包括通過糖基化修飾的這些多肽，例如，通過在其合成和加工過程中或在進一步加工的步驟中修飾多肽的糖基化模式制造的那些；或通過使多肽與影響糖基化的酶，如哺乳動物糖基化或脫糖基化的酶接觸制造的那些。變體多肽還包括上面鑒定的誘變序列，其具有磷酸化的氨基酸殘基，例如；磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸。
術語“宿主細胞”是指以任何方式選擇、修飾、轉化、生長、使用或操縱的任何生物的任何細胞，用于利用細胞產生物質，例如利用細胞表達基因、DNA或RNA序列、蛋白或酶。
此處所用術語“分離的”是指從正常發(fā)現(xiàn)它的環(huán)境中除去的參考物質。因此，分離的生物物質可沒有細胞成分，即，發(fā)現(xiàn)或產生該物質的細胞成分。就核酸分子而言，分離的核酸分子包括PCR產物、分離的mRNA、cDNA、或限制片段。在另一實施方案中，分離的核酸優(yōu)選是從可發(fā)現(xiàn)它的染色體中除去的，且更優(yōu)選在染色體中發(fā)現(xiàn)時，不再與位于該分離核酸分子所含基因的上游或下游的非-調節(jié)、非-編碼區(qū)，或其它基因連接。在另一實施方案中，所述分離的核酸缺少一個或多個內含子。分離的核酸分子包括插入到質粒、粘粒、人工染色體等中的序列。因此，在具體實施方案中，重組核酸是分離的核酸。分離的蛋白可與細胞中連接的其它蛋白或核酸，或兩者連接，或如果它是膜-相關蛋白，則可與細胞膜連接。分離的細胞器、細胞或組織是從在生物中發(fā)現(xiàn)它的解剖位點除去的。分離的物質可以是，但并非必需是純化的。
此處所用術語“純化的”是指在減少或除去無關物質，即污染物，包括獲得該物質的天然材料的條件下分離的物質。例如，純化蛋白優(yōu)選基本上沒有細胞中與它連接的其它蛋白或核酸；純化的核酸分子優(yōu)選基本上沒有可在細胞內發(fā)現(xiàn)它的蛋白或其它無關核酸分子。在進行物質的分析測試時，此處所用術語“基本上沒有”是可操縱使用的。優(yōu)選，基本上沒有污染物的純化物質為至少50％純度；更優(yōu)選至少90％純度、且更優(yōu)選至少99％純度。純度可通過色譜、凝膠電泳、免疫測定、組成分析、生物測定、和本領域已知的其它方法來評價。
純化方法是本領域熟知的。例如，核酸可通過沉淀、色譜(包括制備型固相色譜、寡核苷酸雜交、和三股螺旋色譜)、超速離心、和其它方法純化。多肽和蛋白可通過各種方法純化，包括，但不限于，制備型圓盤-凝膠電泳、等電點聚焦、HPLC、反相HPLC、凝膠過濾、離子交換和分配色譜、沉淀和鹽析色譜、提取、和逆流分布。就某些目的而言，優(yōu)選在重組系統(tǒng)中生產多肽，其中所述蛋白包含促進純化的附加序列標記，如，但不限于，聚組氨酸序列，或特異性結合抗體的序列，如FLAG和GST。然后可通過色譜法在適宜的固相基質上從宿主細胞的粗溶解產物中純化多肽。可選擇性地，針對蛋白或從其衍生的肽產生的抗體可用作純化試劑。細胞可通過各種技術純化，包括離心、基質分離(例如，尼龍織物分離)、淘選和其它免疫選擇技術、缺失(例如，污染細胞的補體缺失)、和細胞分選(例如，熒光激活的細胞分選[FACS])。其它純化方法也是可用的。純化物質可包含少于約50％、優(yōu)選少于約75％、且最優(yōu)選少于約90％的細胞成分，該這些細胞成分是與其原始連接的。“基本上純的”表示使用本領域已知的常規(guī)純化技術可獲得的最高純度。
當在規(guī)定的嚴格條件下，一個多核苷酸的至少一個鏈可退火成另一個多核苷酸時，則多核苷酸可彼此“雜交”。雜交的嚴格程度是通過進行雜交和/或洗滌的溫度，和b)雜交和洗滌溶液的離子強度和極性(例如，甲酰胺)，以及其它參數確定的。雜交要求兩個多核苷酸包含基本互補的序列；取決于雜交的嚴格程度，然而，可允許不匹配。通常，兩個序列在高度嚴格條件(如，例如，在0.5xSSC的水溶液中，65℃下)下雜交要求該序列在它們的整個序列中顯示出某些較高程度的互補性。中等程度的嚴格條件(如，例如，2xSSC水溶液，65℃)和低度嚴格條件(如，例如，2xSSC水溶液，55℃)要求雜交序列間相應不十分完全的互補性。(1xSSC是0.15M NaCl、0.015M檸檬酸鈉)。與此處的多核苷酸“雜交”的多核苷酸可以是任何長度。在其中一個實施方案中，這種多核苷酸的長度為至少10個、優(yōu)選至少15個且最優(yōu)選至少20個核苷酸。在另一實施方案中，雜交的多核苷酸為大約相等的長度。在另一實施方案中，雜交的多核苷酸包括在適宜的嚴格條件下退火且編碼具有相同功能，如結合p53(在E6的情況下)或結合Rb(在E7的情況下)的能力的多肽或酶的那些。
這里討論的一般基因工程工具和技術，包括轉化和表達、宿主細胞、載體、表達系統(tǒng)等的使用是本領域熟知的。
此處所用術語“大約”或“近似”是指已知值的50％以內、優(yōu)選20％以內、更優(yōu)選10％以內、更優(yōu)選5％以內、且最優(yōu)選在已知值的1％以內?？蛇x擇性地，術語“大約”或“近似”是指數值可落在該類型值的系統(tǒng)可接受的誤差范圍內，其取決于所用的工具可給予怎樣定性的測量值?！按蠹s”或“近似”可限定平均值，而不是單一值周圍的分布。
本發(fā)明的免疫原性組合物和藥物組合物本發(fā)明提供包含人乳頭瘤病毒E6和E7的融合多肽和多核苷酸的免疫原性組合物和藥物組合物。這些組合物可用于治療和/或預防乳頭瘤病毒-誘導的癌癥，如宮頸癌，和宮頸損害如CIN。這些組合物還可用于治療下部胃腸道癌，如肛門癌，和生殖系統(tǒng)的其它癌癥，如陰莖和外陰癌。
在又一實施方案中，本發(fā)明提供包含多個乳頭瘤病毒的多肽的融合體和多核苷酸的融合體的免疫原性組合物和藥物組合物。例如，本發(fā)明提供包含來源于HPV家族的多個成員，如HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68的E6和E7蛋白融合體的免疫原性組合物和藥物組合物。HPV E6多肽的例子在圖2A-E中表示且來源于HPV 18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68的E6的氨基酸序列分別在SEQ ID NOS15-26中給出。編碼這些HPV E6多肽的核苷酸序列分別在SEQ ID NOS42-53中給出。HPV E7多肽的例子在圖3A-C中表示且來源于HPV 18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68的E7的氨基酸序列分別在SEQ ID NOS27-38中表示。編碼這些HPV E7多肽的核苷酸序列分別在SEQ ID NOS54-65中給出。通過序列比對鑒定的這些融合體所含的殘基突變與此處所述HPV 16中的突變殘基相對應或與E6和E7共有序列所示的保守序列(分別為SEQ ID NOS39和40)相對應，它們可阻礙蛋白的致癌性，但不會阻礙其誘導免疫反應的能力。在本發(fā)明其中一個實施方案中，該免疫原性組合物和藥物組合物包含一個融合體，該融合體包含來源于乳頭瘤病毒家族不同成員的E6和E7多肽。例如，融合體可在單一構建體內包含源于HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68的E6和E7的任何可能組合。
存在于一個融合體中的E6/E7多肽的數量僅受送遞結構的大小限制或送遞這些組合物的載體的限制。例如，受結構限制所限的病毒可僅包裝特定量的核酸。本領域技術人員可了解到不同病毒包裝核酸的能力并了解到篩選適合包裝大小的核酸是常規(guī)的。
可選擇性地，本發(fā)明的免疫原性組合物和藥物組合物可包含多個、E6/E7的不同融合體。例如，所述免疫原性組合物或藥物組合物可包含多個病毒顆粒，每個均含有來源于不同乳頭瘤病毒的E6和E7序列的不同融合體。
包含來源于多個乳頭瘤病毒的E6/E7融合體的免疫原性組合物和藥物組合物是特別有益的，這是因為它們可對多個E6和E7蛋白產生免疫反應并因此預防由這些病毒中的每一個所引起的癌癥和瘤形成。例如，HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68的每一個均與宮頸癌和/或上皮內瘤形成有關(Harrison′sPrinciples of Internal Medicine Fifteenth Edition，2001，1119；Braunwald等人，Eds.，McGraw-Hill)。因此，例如，HPV16和18 E6和E7多肽的融合體可預防和治療兩種不同病因學的癌癥。包含來源于多個不同病毒的E6和E7多肽的組合物是特別有力的方式，可用于治療和/或預防多種乳頭瘤病毒-誘導的癌癥，如宮頸癌、宮頸損害，如CIN，下部胃腸道癌，如肛門癌、和生殖系統(tǒng)的其它癌癥，如陰莖和外陰癌。
本領域的技術人員應了解測定免疫原性組合物安全性的方法。例如，測定E6/E7融合體是否可降低或消除轉化和永生化能力的舉例性方法包括例如，通過蛋白質即跡、軟瓊脂測定法測定p53和/或Rb水平，轉染原代角質形成細胞或乳上皮細胞并鑒定衰老的損失，和轉染細胞并鑒定細胞形態(tài)學的改變。除了這些功能測定法，還可使用生化測定法。例如，可測量E6和E7與細胞蛋白，如p53、E6 TP-1、端粒酶和Rb的結合。
評價p53和Rb的水平是其中一種測定包含E6/E7融合體的重組病毒顆粒，如VEE安全性的方法。在用表達野生型HPV 16 E6和E7，作為融合體或單個蛋白、E7E6 TetM融合蛋白的VRP、或作為陰性對照的GFP轉染后，評價原代人MEC中p53和Rb的穩(wěn)態(tài)水平。MEC的VRP感染揭示了分別含E6和E7野生型形式的培養(yǎng)物中的p53和Rb水平大大降低；與E6簡單融合的E7不足以削弱任一蛋白的活性(圖8A和B)。相反，用含E6(63C和106C)和E7(24C和26E)突變的E7E6 TetM VRP轉染的MEC含有正常水平的p53和Rb(圖8A和B)，表明這4種突變可消除這些蛋白的原始致癌活性。
因為所建立腫瘤的消除要求針對腫瘤特異性病毒抗原E6和E7誘導較強的T細胞介導的免疫反應，因此選擇委內瑞拉馬腦炎(VEE)復制子作為免疫原性組合物的載體。然而，任何基因或蛋白送遞方法均可用于送遞和包裝本發(fā)明的免疫原性組合物。例如，可使用本領域技術人員已知的其它病毒載體或通過質粒直接送遞編碼突變融合多肽的核苷酸。
重組AV載體，VEE是其一員，是特別通用的，這是因為它們可作為裸RNA、裸質粒DNA或顆粒被運載，后者是用于免疫原性組合物中的最有效制劑。與其它AV復制子相比，VRP的其中一個區(qū)別特性是它們對樹突細胞的親嗜性(MacDonald，G.H.等人，J Virol 2000，74914-922)。VRP-靶向樹突細胞對于將抗原運載到淋巴結中而言是十分有效的載體且是有效的節(jié)省劑量的策略。
本發(fā)明的免疫原性組合物，特別是核酸可經由病毒載體，如慢病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒、腺病毒、腺-伴隨病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、甲病毒和具有所需細胞親嗜性的其它重組病毒送遞。各種甲病毒均可用作病毒載體，包括，例如，Sindbis病毒載體、Semliki森林病毒(ATCC VR 67；ATCC VR 1247)、Ross River病毒(ATCC VR 373；ATCC VR 1246)和委內瑞拉馬腦炎病毒(ATCC VR 923；ATCC VR 1250；ATCC VR 1249；ATCC VR 532)。這種載體系統(tǒng)的代表性例子包括美國專利號US5,091,309；5,217,879；和5,185,440；及國際專利公開號WO 92/10578；WO 94/21792；WO 95/27069；WO 95/27044；和WO 95/07994中公開的那些。還提供了靶向細胞的特定區(qū)，例如，從而使融合多肽定位于細胞膜，如美國專利號US6,228,621所述。
因此，使用病毒載體或通過直接引入核酸，如DNA或復制子RNA，可體內、來自體內、或體外引入編碼E6/E7多肽融合體的基因。靶向組織中的表達可通過將重組載體靶向特定細胞而完成，如使用病毒載體或受體配體，或通過使用組織-特異性啟動子，或兩者。靶向基因送遞在國際專利公開號WO 96/28494中描述。
通常用于體內或來自體內的靶向和治療過程的病毒載體是基于DNA的載體和逆轉錄病毒載體。用于構建和使用病毒載體的方法是本領域已知的(見，例如，Miller和Rosman，BioTechniques 1992，7980-990)。優(yōu)選，所述病毒載體是復制缺損的，即，它們不能在靶細胞中自主復制。通常，在本發(fā)明范圍內使用的復制缺損病毒載體的基因組缺少至少一個區(qū)，而該區(qū)是在受感染細胞中復制病毒所需的。這些區(qū)可被消除(全部或部分)，或通過本領域已知的任何技術使其成為非-功能性的。這些技術包括全部缺失、(被其它序列，特別是被插入的核酸)置換、(復制)必需區(qū)的一個或多個堿基的部分缺失或加成(從而引起移碼)。這種技術可體外(在分離的DNA上)或原位進行，使用基因操縱技術，或用誘變劑處理。優(yōu)選，復制缺損病毒仍然保留了包裹病毒顆粒所需的其基因組的序列。
病毒載體包括減毒或缺失的DNA或RNA病毒，如，但不限于，單純性皰疹病毒(HSV)、Epstein Barr病毒(EBV)、腺病毒、腺-伴隨病毒(AAV)、VEE等。優(yōu)選缺損病毒，其完全或幾乎完全缺失病毒基因。在引入到細胞中后，缺損病毒不會產生子代。缺損病毒載體的使用允許給予特定局部區(qū)域中的細胞，而無需考慮病毒載體是否擴散并感染其它細胞。因此，可特異性靶向特定組織。特定載體的例子包括，但不限于，復制缺損VEE系統(tǒng)，如Pushko等人(Virology 1997，239389-401)所述，和減毒腺病毒載體，如Stratford-Perricaudet等人(J.Clin.Invest.1992，90626-630；還見La Salle等人，Science 1993，259988-990)所述的載體，和缺損的腺-伴隨病毒載體(Samulski等人，J.Virol.1987，613096-3101；Samulski等人，J.Virol.1989，633822-3828；Lebkowski等人，Mol.Cell.Biol.1988，83988-3996)。
很多公司都商業(yè)生產病毒載體，包括但不限于Avigen，Inc.(Alameda，CA；AAV載體)、Cell Genesys(Foster City，CA；逆轉錄病毒、腺病毒、AAV載體，和慢病毒載體)、Clontech(逆轉錄病毒和桿狀病毒載體)、Genovo，Inc.(Sharon Hill，PA；腺病毒和AAV載體)、Genvec(腺病毒載體)、IntroGene(Leiden，Netherlands；腺病毒載體)、Molecular Medicine(逆轉錄病毒、腺病毒、和AVV載體)、Norgen(腺病毒載體)、Oxford BioMedica(Oxford，UnitedKingdom；慢病毒載體)、Transgene(Strasbourg，F(xiàn)rance；腺病毒、牛痘、逆轉錄病毒和慢病毒載體)、AlphaVax(甲病毒載體，如VEE載體)和Invitrogen(Carlsbad，California)。
在另一實施方案中，可通過脂質轉染，如裸DNA，或用其它轉染促進劑(肽、聚合物、布比卡因等)將載體引入體內。合成的陽離子脂類可用于制備編碼標記的基因的體內轉染的脂質體(Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1987，847413-7417；Felgner和Ringold，Science 1989，337387-388；Mackey等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1988，858027-8031；Ulmer等人，Science 1993，2591745-1748)。用于核酸轉移的有用的脂類化合物和組合物在國際專利公開號WO 95/18863和WO 96/17823，和美國專利號US5,459,127中描述。脂類可與其它分子化學偶聯(lián)，用于靶向(見，Mackey等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1988，858027-8031)。靶向肽，例如，激素或神經遞質，和蛋白如抗體，或非-肽分子可與脂質體化學偶聯(lián)。其它分子也可用于促進核酸體內轉染，如陽離子寡肽(例如，國際專利公開號WO 95/21931)、來源于DNA結合蛋白的肽(例如，國際專利公開號WO 96/25508)、或陽離子聚合物(例如，國際專利公開號WO 95/21931)。
還可將載體作為裸DNA質粒引入體內。通過本領域已知的方法，可將用于基因療法的裸DNA載體引入到所需宿主細胞中，例如，電穿孔、微量注射、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、基因槍的使用(例如，可用于表皮基因送遞的Hellos基因槍系統(tǒng)(Bio-Rad；Hercules，CA))、或DNA載體轉運蛋白的使用(見，例如，Wu等人，J.Biol.Chem.1992，267963-967；Wu和Wu，J.Biol.Chem.1988，26314621-14624；Hartmut等人，加拿大專利申請?zhí)?,012,311，1990年3月15日提交；Williams等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1991，882726-2730)。還可使用受體-介導的DNA送遞方法(Curiel等人，Hum.Gene Ther.1992，3147-154；Wu和Wu，J.Biol.Chem.1987，2624429-4432)。美國專利號US5,580,859和5,589,466公開了外源DNA序列，沒有轉染促進劑，在哺乳動物中的送遞?？蛇x擇性地，將DNA與轉染促進劑配制在組合物中，其可促進免疫，如布比卡因和其它局部麻醉劑(美國專利號US6,127,170)。近來，已經描述過相對較低的電壓、高效率體內DNA轉移技術，即電轉移(Mir等人，C.P.Acad.Sci.1998，321893；WO 99/01157；WO 99/01158；WO99/01175)。
此處所用術語“免疫原性組合物”廣義是指給藥以在受體中引發(fā)免疫原性反應的任何組合物。免疫原性組合物通常包含免疫有效劑量的免疫原(例如，感染劑的抗原)和藥學可接受的載體和，任選地，佐劑。所述藥學可接受的載體可以是適合給予人的無菌水或無菌等滲生理鹽水，以及任何和所有的溶劑、分散介質、涂層、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。適宜的載體對本領域技術人員是顯而易見的且大部分取決于給藥途徑。
免疫原性組合物可通過，例如，吸入或吹入(通過口腔或鼻)、或口服、口腔、陰道、直腸或非腸道給藥(例如，通過皮下、真皮內、肌內、眼眶內、囊內、脊柱內、胸骨內、腹膜內或靜脈內注射等)給予生物。免疫原性組合物還可通過粒子-介導的轉移給藥(例如，使用“粒子槍”)。見，例如Gainer等人，J.Neurooncol 2000，4723-30；Koide等人，Jpn J. Pharmacol 2000，83167-174；Kuriyama等人，Gene Ther.2000，71132-1136；和Yamauchi等人，J.Exp.Zool.2000，287285-293。這種粒子轉移方法對DNA或載體免疫原性組合物是特別優(yōu)選的，例如，使用“基因槍”。適宜的給藥途徑是根據所用免疫原性組合物的性質，和患者年齡、體重、性別和一般健康狀況的評價和存在于免疫原性組合物中的抗原，及類似因素由醫(yī)師決定。
免疫原性組合物可包含，例如，減毒或殺死的、引起感染性疾病的感染劑(例如，微生物如細菌或病毒，寄生蟲或其它病原體等)的混懸液?？蛇x擇性地，本發(fā)明的免疫原性組合物可以是多肽免疫原性組合物或DNA免疫原性組合物。術語“多肽免疫原性組合物”是指包含免疫原性多肽的免疫原性組合物，例如來源于感染劑的多肽，其可以是抗原，且因此激活生物中的免疫反應。此處所用的術語“DNA免疫原性組合物”是指利用重組載體送遞的免疫原性組合物。此處所用的可選擇性術語是“載體免疫原性組合物”(因為某些有效的載體，例如甲病毒載體，是RNA病毒且因為在某些情況下，代替DNA的非-病毒RNA可被送遞給細胞)。
術語“免疫有效劑量”是指足以產生所需活性的化合物或組合物用量。因此，為了描述免疫原性組合物，免疫有效劑量是指足以產生有效免疫反應的化合物或組合物(例如，抗原)的用量?？傊?，用于本發(fā)明免疫原性組合物的適宜免疫有效用量或給藥劑量的選擇也是以所用的特定免疫原性組合物、以及受治療者的健康狀況、最特別是包括受到免疫的受治療者的一般健康狀況和體重為基礎的。這種選擇和有效劑量的向上或向下調節(jié)也在本領域范圍內。誘導免疫反應而沒有明顯副作用所需的活性成分的用量根據所用組合物而變化。
就含有編碼本發(fā)明突變E6/E7融合多肽的DNA的重組，優(yōu)選復制-缺損病毒而言，免疫有效量是在常規(guī)給藥從而轉染受治療者所需細胞方面有效并提供充足的所選基因表達水平以提供所需作用的重組病毒用量。可監(jiān)測免疫水平以確定是否需要加強，如果有的話。
術語“佐劑”是指提高對抗原的免疫反應的化合物或混合物。例如，佐劑可發(fā)揮組織倉庫的作用，緩慢釋放抗原，也可作為淋巴系統(tǒng)激活劑提高免疫反應(見，Hood等人，Immunology，Second Ed.，1984，Benjamin/CummingMenlo Park，California，p.384)。這種佐劑還包括，除了別的之外，MPLTM(3-O-脫?；瘑瘟柞；?A；Corixa，Hamilton，MT)，其在美國專利號US4,912,094中描述，其引入此處作為參考。還適合用作佐劑的是氨烷基葡萄糖胺磷酸鹽化合物(AGP)、或其衍生物或類似物，它們可從Corixa(Hamilton，MT)得到，并在美國專利號US6,113,918中描述，其引入此處作為參考。其中一種這類AGP是2-[(R)-3-四癸酰氧基四癸酰氨基]乙基2-脫氧-4-O-膦?；?3-O-[(R)-3-四癸酰氧基四癸?；鵠-2-[(R)-3-四癸酰氧基四癸酰氨基]-b-D-喃葡萄糖，其也被稱作529(從前稱作RC529)。該529佐劑可配制成含水形式或穩(wěn)定的乳液。
其它佐劑包括礦物油和水乳液，鋁鹽(明礬)，如氫氧化鋁、磷酸鋁等，Amphigen、Avridine、L121/角鯊烯、D-交酯-聚交酯/糖苷、胞壁酰基二肽、被殺死的博代氏桿菌、皂苷，如Quil A或StimulonTMQS-21(Antigenics，F(xiàn)ramingham，MA.)，在美國專利號US5,057,540中描述，其引入此處作為參考，和從其產生的顆粒，如ISCOMS(免疫刺激復合物)、結核分支桿菌、細菌脂多糖、合成的多核苷酸，如含CpG基序的寡核苷酸(美國專利號US6,207,646，其引入此處作為參考)、霍亂毒素(野生型或突變形式，例如，其中29位氨基酸上的谷氨酸被另一氨基酸，優(yōu)選組氨酸取代，按照國際專利公開號WO 00/18434，其引入此處作為參考)、百日咳毒素(PT)、或大腸桿菌熱-不穩(wěn)定性毒素(LT)、特別是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129；見，例如，國際專利公開號WO 93/13302和WO 92/19265，其引入此處作為參考。各種細胞因子和淋巴因子均適于用作佐劑。其中一種這類佐劑是粒細胞-巨嗜細胞集落刺激因子(GM-CSF)，其具有美國專利號US5,078,996所述的核苷酸序列，該文獻引入此處作為參考。已經將含GM-CSF cDNA的質粒轉化到大腸桿菌中并在American Type Culture Collection(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209保藏，登記號為39900。細胞因子白介素-12(IL-12)是另一種佐劑，在美國專利號US5,723,127中描述，該文獻引入此處作為參考。其它細胞因子或淋巴因子已經顯示出具有免疫調節(jié)活性，包括但不限于白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18，干擾素-α、β和γ，粒細胞集落刺激因子，和腫瘤壞死因子α和β，它們適合用作佐劑。
其它適宜的佐劑包括，但不限于表面活性物質(例如，十六胺、十八胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂、二甲基-二十八烷基溴化銨)、甲氧基十六烷基甘油、和pluronic多元醇；多元胺，例如，吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC、卡波姆；肽，例如，胞壁?；摹⒍谆拾彼?、他福新；油狀乳液；和礦物凝膠，例如，磷酸鋁等和免疫刺激復合物。還可將免疫原摻入到脂質體中，或與多糖、脂多糖和/或其它聚合物結合用于免疫原性組合物中。
舉例性佐劑包括，但不限于，不完全的Freund′s佐劑、表面活性物質(例如，溶血卵磷脂)、pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油或烴乳液。舉例性佐劑還包括潛在有效的人類佐劑如BCG(卡介苗)和小棒桿菌。此外，免疫刺激蛋白，如，趨化因子或編碼趨化因子的核酸序列；可作為佐劑提供，以增加對免疫原性組合物的免疫反應。
短語“藥學可接受的”是指當給予個體時，分子實體和組合物是生理可耐受的且通常不會產生變應性或類似不利反應(例如，胃部不適，頭昏等)。優(yōu)選，且特別是在人類中使用免疫原性組合物時，術語“藥學可接受的”是指由管理機構(例如，U.S.Food and DrugAgency)批準或在用于動物中的通常認可的藥典(例如，美國藥典)中所列的。
術語“載體”是指稀釋劑、助劑、賦形劑或載體，以用其給予化合物。無菌水或含水的生理鹽水溶液和含水的葡萄糖及甘油溶液優(yōu)選用作載體，特別是用于可注射的溶液。舉例性的適宜藥物載體在“Reminington′s Pharmaceutical Sciences”中由 E.W.Martin描述。
化合物的毒性和治療功效可通過標準藥物過程測定，例如，在細胞培養(yǎng)測定法中或使用實驗動物測定LD50和ED50。參數LD50和ED50是本領域熟知的，且分別指使50％人群死亡和對50％人群治療有效的化合物劑量。毒性和治療作用之間的劑量比被稱作治療指數且可表示為LD50/ED50的比值。優(yōu)選顯示較大治療指數的化合物。也可使用具有毒副作用的化合物。然而，在這種情況下，特別優(yōu)選使用將這種化合物特異性靶向受影響組織部位的送遞系統(tǒng)，以便將對其它細胞、組織或器官的潛在損害減到最小并降低副作用。
從細胞培養(yǎng)測定法或動物研究獲得的數據可用于配制用于人類的給藥劑量范圍。用于本發(fā)明治療方法中的化合物給藥劑量優(yōu)選落在循環(huán)濃度的范圍之內，包括ED50濃度，但具有較小毒性或沒有毒性(例如，低于LD50濃度)。用于任何應用的特定給藥劑量可在該范圍內改變，這取決于各種因素，如所用的特定給藥形式、所用給藥途徑、個體(例如患者)的狀況等。
除人類以外的動物包括，但不限于，實驗室動物，如小鼠、大鼠、兔、倉鼠、豚鼠等；馴養(yǎng)動物如狗和貓；畜牧動物如綿羊、山羊、豬、馬、和母牛；以及除人類以外的靈長類動物。
治療有效劑量最初可從細胞培養(yǎng)測定法估計并在動物模型中配制以獲得包括IC50在內的循環(huán)濃度范圍。化合物的IC50濃度是獲得癥狀的一半-最大抑制的濃度(例如，根據細胞培養(yǎng)測定法確定)。然后使用該信息可更準確地確定用于特定個體，例如人類患者的適宜給藥劑量。
術語“治療”是指嘗試對腫瘤細胞，即癌引發(fā)抗腫瘤反應?？鼓[瘤反應包括，但不限于，增加存活時間、抑制腫瘤轉移、抑制腫瘤生長、腫瘤消退、和對未修飾腫瘤細胞的延遲型過敏反應(DTH)的發(fā)展。
化合物在血漿中的測量值可在個體如患者中常規(guī)測量，如利用高效液相色譜(HPLC)或氣相色譜技術進行。
用于本發(fā)明的藥物組合物可使用一種或多種生理可接受的載體或賦形劑以常規(guī)方式配制。
因此，化合物和它們生理可接受的鹽和溶劑化物可通過上述途徑配制用于給藥。
就口服給藥而言，藥物組合物可采用，例如，片劑或膠囊劑的形式，用藥物可接受的賦形劑通過常規(guī)方式制備，如粘合劑(例如預膠凝的玉蜀黍淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石粉或二氧化硅)；崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉或羥基乙酸淀粉鈉)；或濕潤劑(例如，十二烷基硫酸鈉)。片劑可通過本領域熟知的方法包衣。用于口服給藥的液體制劑可采用，例如，溶液、糖漿或混懸液的形式，或可以干燥產品的形式給出，在使用前用水或其它適宜的載體構成。這種液體制劑可通過常規(guī)方式，用藥物可接受的添加劑制備，如混懸劑(例如，山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化可食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯膠)；非-水載體(例如，杏仁油、油酯、乙醇或分餾的植物油)；和防腐劑(例如，甲基或丙基-p-羥基苯甲酸鹽或山梨酸)。根據需要，所述制劑還可含有緩沖鹽、調味劑、著色劑和甜味劑。
用于口服給藥的制劑可被適當配制成控制釋放活性化合物。用于口腔給藥時，所述組合物可采用以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑形式。
吸入給藥時，用于本發(fā)明的化合物通常以氣霧劑的形式從加壓的包或霧化器中噴出；使用適宜的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適宜的氣體。在加壓氣霧劑的情況下，給藥劑量單位可通過提供閥門來送遞計量用量而確定。用于吸入器或吹入器中的明膠膠囊和藥筒可被配制成含有化合物與適宜粉末基質，如乳糖或淀粉的粉末混合物。
所述化合物可被配制用于通過注射非腸道給藥，例如，大藥團注射或連續(xù)輸注。用于注射的制劑可以單位給藥劑量形式提供，例如，在安瓿或多劑量容器中，含有添加的防腐劑。所述組合物可采用，如溶于含油或含水載體中的混懸液、溶液或乳液的形式，且可含有配制劑，如混懸、穩(wěn)定和/或分散劑。可選擇性地，活性成分可以是粉末形式，在使用前，用適宜的載體，例如，沒有熱原的水構成。
所述化合物還可被配制成直腸用組合物，如栓劑或保留灌腸，例如，含有常規(guī)栓劑基質，如椰子油或其它甘油酯。
除了前述制劑外，還可將化合物配制成貯存制劑。這種長時間發(fā)揮作用的制劑可通過植入(例如皮下或肌內)或通過肌內注射給藥。因此，例如，可用適宜的聚合或疏水物質(例如，在可接受的油中配制乳液)或離子交換樹脂配制該化合物，或作為少量溶解的衍生物，例如，作為少量溶解的鹽。
如果需要，所述組合物可在包裝或分散裝置中給出，其可包括含活性成分的一個或多個單位給藥劑量形式。該包裝可例如包括金屬或塑料箔，如發(fā)泡包裝。所述包裝或分散裝置可伴有給藥說明。
本說明書中所用的術語通常具有本領域中它們的常規(guī)含義，落在本發(fā)明的范圍之內且在具體情況下，可使用各術語。某些術語在說明書中討論，以在描述本發(fā)明的組合物和方法以及如何制造和使用它們時，為實踐者提供額外指導。
實施例通過下列實施例描述本發(fā)明。然而，說明書中任何地方使用的這些或其它實施例僅僅用于舉例說明而不是對本發(fā)明范圍和含義或任何舉例說明的術語的限制。同樣，本發(fā)明不限于此處所述的任何優(yōu)選實施方案。事實上，在閱讀了本說明書后，本發(fā)明的很多改進和變化對本領域技術人員都是顯而易見的，且可在不背離它的精神和范圍的前提下進行。
實施例1。HPV16免疫原性組合物構建體的設計和生產材料和方法VEE-復制子構建體的生產。HPV16 E6和E7基因是通過PCR方法(Horton等人，Gene 1989，7761-8)從pHPV-16(ATCC，#45113)獲得的，并以兩個不同的方向融合，對所有構建體產生編碼248個氨基酸的744個堿基對(bp)的可讀框(ORF)。除去每個下游ORF的甲硫氨酸起始密碼子，以消除內部開始的任何可能性。使用QuikChange定點誘變試劑盒(Stratagene；La Jolla，CA)使融合ORF的特異核苷酸發(fā)生誘變。將野生型(wt)和突變(mut)融合基因亞克隆到載體pVR200(AlphaVax；Durham，NC)中，一種來源于委內瑞拉馬腦炎(VEE)Trinidad驢菌株的高度減毒的、非-神經營養(yǎng)突變體(V3014)的cDNA的質粒(Grieder，F(xiàn).B.等人，Virology 1995，206994-1006)。pVR200質粒在Pushko等人(Virology 1997，239389-401，特別見p.390-391“細胞系和質?！焙蚿.393圖1b)中描述。簡單地說，該質粒具有T7啟動子，之后是VEE的非-結構基因、亞基因組啟動予26S、目標基因的克隆位點(在本發(fā)明中，E6/E7融合體)、和NotI線性化位點。
復制-機能不全的VEE復制子顆粒(VRP)是利用斷裂輔助方法制備并按(Pushko等人，Virology 1997，239389-401)所述滴定的。簡單地說，將pVR200質粒(克隆的目標融合體)共轉染到細胞中，連同(1)編碼殼體的輔助構建體，和(2)編碼糖蛋白的輔助構建體。這些輔助構建體均沒有包裝序列且因此不會摻入到VRP中。因此，所得VRP是復制缺損的。每種VRP制劑的效能，以感染單位/毫升(IU/ml)表示，是通過在幼小倉鼠的腎(BHK)-21細胞上滴定而測得的E7-陽性顆粒數限定的。所有VRP制劑的滴度均超過109IU/電穿孔；在這些研究中，按照先前所述，使用3×105IU/接種免疫的有效劑量(Velders M.P.等人，Cancer Res 2001，617861-7867)。
蛋白質印跡和免疫熒光。用所示VRP感染BHK-21細胞。感染后24小時，將細胞采集到SDS樣品緩沖液中用于進行蛋白質即跡分析或用甲醇-丙酮固定用于免疫熒光。為了通過蛋白質印跡檢測蛋白表達，通過SDS-PAGE分離細胞溶解產物中的蛋白、轉移到聚乙烯(PVD)膜上并使用抗-HPV16 E7單克隆抗體(Zymed；San Francisco，CA)，利用Western Breeze檢測系統(tǒng)(Invitrogen；Carlsbad，CA)分析。就免疫熒光分析而言，用初級抗-E7抗體，接著是FITC-標記的山羊抗-小鼠次級抗體(#554001，Pharmingen；San Diego，CA)培養(yǎng)固定的細胞。使用Viaprobe(#555815，Pharmingen)將細胞核染色。
結果為了設計抗HPV16-誘導的宮頸癌的有效且安全的免疫原性組合物，抗原多樣性是通過表達E6和E7腫瘤特異性抗原而增加的。VRP免疫原性組合物中含有全長E6和E7基因對于使表達所有可能表位的可能性達到最大，用于刺激I類和II類HLA-多樣性群體中的CD8+和CD4+T細胞。E6和E7 ORF的融合體是以兩個不同方向通過PCR獲得的，且多達5個氨基酸被誘變(圖1A和B)以得到表達構建體，用于生產特定的E6/E7融合多肽。
63C位置上單一氨基酸的置換已經顯示出可破壞若干HPV16 E6功能p53降解、E6TP-1降解、端粒酶激活、和，因此，原代上皮細胞永生化(Gao，Q.等人，J Virol 2001，754459-4466)。在106C處含有單一點突變的HPV 16 E6既不結合也不促進p53的降解且不能使人MEC永生化，一種依賴于p53降解的表型(Dalal等人，J Virol 1996，70683-688)。98氨基酸HPV16 E7蛋白通過L-X-C-X-E基序結合Rb；該基序在24C和26E位置的突變可破壞Rb結合及降解(Munger，K等人，Oncogene 2001，207888-7898)。除了E7中這兩個點突變外，第三個氨基酸91C突變，從而破壞了E7的單一鋅指。
這里被稱作E6E7wt的第一個融合蛋白在氨基末端包含野生型E6多肽序列(SEQ ID NO13)的氨基酸序列，在羧基末端包含野生型E7多肽序列(SEQ ID NO14)的氨基酸序列。這種融合多肽的代表性氨基酸序列在SEQ ID NO1中提供。編碼這種野生型E6E7融合多肽的舉例核酸序列在SEQ ID NO2中給出。
還制備了被稱作E6E7TetM的第二個融合多肽。像E6E7wt融合多肽一樣，E6E7TetM在氨基末端包含E6多肽序列，在羧基末端包含E7多肽序列。然而，該構建體的E6多肽序列在E6多肽的殘基63和106處包含甘氨酸，而不是在野生型E6氨基酸序列(SEQ ID NO13)中發(fā)現(xiàn)的半胱氨酸。此外，該構建體的E7多肽序列在E7多肽的殘基24和26處包含甘氨酸，而不是在野生型E7氨基酸序列(SEQ ID NO14)中發(fā)現(xiàn)的半胱氨酸(24)和谷氨酸鹽(26)。這種融合多肽的代表性氨基酸序列在SEQ ID NO3中提供。編碼這種E6E7TetM融合多肽的舉例性核苷酸序列在SEQ ID NO4中給出。
還制備了被稱作E6E7PentM的第三個融合多肽。像E6E7TetM融合多肽一樣，E6E7PentM包含E6多肽序列，其在氨基末端的殘基63和106處包含甘氨酸，E6E7PentM還包含E7多肽序列，其在羧基末端的殘基24和26處包含甘氨酸。然而，該融合蛋白的E7多肽序列還在E7多肽序列的殘基91處包含甘氨酸，而不是在野生型E7氨基酸序列(SEQID NO14)中發(fā)現(xiàn)的半胱氨酸。這種融合多肽的代表性氨基酸序列在SEQ ID NO5中提供。編碼這種E6E7PentM融合多肽的舉例性核苷酸序列在SEQ ID NO6中給出。
被稱作E7E6wt的第四個融合多肽在氨基末端包含野生型E7多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO14)，并在數基末端包含野生型E6多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO13)。這種融合多肽的代表性氨基酸序列在SEQ ID NO7中提供。編碼這種E7E6wt融合多肽的舉例性核苷酸序列在SEQ ID NO8中給出。
還制備了被稱作E7E6TetM的第五個融合多肽。像E7E6wt融合多肽一樣，E7E6TetM在氨基末端包含E7多肽序列并在羧基末端包含E6多肽序列。然而，該構建體的E7多肽在E7多肽的氨基酸24和26處包含甘氨酸殘基，而不是在野生型E7氨基酸序列(SEQ ID NO14)中發(fā)現(xiàn)的半胱氨酸(24)和谷氨酸鹽(26)。此外，該構建體的E6多肽在E6多肽的氨基酸63和106處包含甘氨酸殘基，而不是在野生型E6氨基酸序列(SEQ ID NO13)中發(fā)現(xiàn)的半胱氨酸。這種融合多肽的代表性氨基酸序列在SEQ ID NO9中提供。編碼這種E7E6TetM融合多肽的舉例性核苷酸序列在SEQ ID NO10中給出。
還制備了被稱作E7E6PentM的第六個融合多肽。像E7E6TetM一樣，E7E6PentM包含E7多肽，其在氨基末端的E7多肽的殘基24和26處包含甘氨酸，E7E6PentM還包含E6多肽，其在羧基末端的E6多肽的殘基63和106處包含甘氨酸。然而，該構建體的E7多肽序列還在E7多肽的殘基91處包含甘氨酸，而不是在野生型E7氨基酸序列(SEQID NO14)中發(fā)現(xiàn)的半胱氨酸。這種融合多肽的代表性氨基酸序列在SEQ ID NO11中提供。編碼這種E7E6TetM融合多肽的舉例性核苷酸序列在SEQ ID NO12中給出。
E6和E7中的突變被設計用于1)破壞3個鋅指，因此使蛋白不穩(wěn)定且加速降解(并因此增加免疫原性)(E6的63C和106C；E7的91C(Dalal等人，J Virol 1996，70683-8；Shi等人，J Virol 1999，737877-81))；2)干擾E6-誘導的p53降解(106C；(Dalal等人，J Virol1996，70683-8))和E6-TP1-結合(Gao等人，J Virol 2001，754459-66)；和3)利用E7破壞Rb結合及降解(24C和26E；(Edmonds和Vousden，J Virol 1989，632650-6))。認真選擇這些突變以位于已知的HLA表位之外，除91C之外。雖然91C已知是跨越E7的氨基酸86-93的HLA A2表位的一部分(Ressing等人，J Immunol 1995，1545934-43；Ressing等人，Cancer Res 1996，56582-8；Evans等人，Cancer Res 1997，572943-50)，但決定使該氨基酸突變以得到最大的免疫原性組合物安全性，是因為這種突變可破壞已知使其活性永生化活性所需的E7鋅指(Jewers等人，J.Virol 1992，661329-1335)。因為這種突變并不位于具有已知的HLA-A*0201結合性的肽的P2氨基酸錨定區(qū)中(Rammensee等人，Annu Rey Immunol1993，11213-44)，因此C91G誘變的多肽可保留它們結合HLA-A*0201分子的能力是可能的。且，C91突變可影響跨越E7氨基酸82-90的其它HLA表位的裂解也是可能的。含那5個氨基酸突變的融合構建體被稱作PentM。
雖然先前已經各自公開了HPV16 E6和E7這些位點每一個處的突變，但是還不了解這些突變組合，如果有的話，是否仍可維持它們的免疫原性。
為了研制出可引發(fā)抗病毒致癌產物E6和E7的較強細胞-介導反應的治療宮頸癌的免疫原性組合物，將這些融合體克隆到基于委內瑞拉馬腦炎(VEE)病毒復制子的系統(tǒng)中。重組VEE免疫原性組合物的優(yōu)點包括高水平的異源基因表達、樹突細胞親嗜性(由此向淋巴組織，用于誘導免疫型的重要位點，靶向表達)，誘導編程性細胞死亡和較強的細胞及體液免疫反應和有效的重復免疫，這是因為對人類中的VEE還沒有廣泛存在的免疫性。此外，甲病毒，如VEE在細胞溶膠中復制目標RNA且是細胞病變的，由此顯著降低E6和E7整合到細胞基因組中的危險。
為了評價這些融合構建體的表達，用重組VRP感染BHK細胞，隨后通過蛋白質印跡和免疫熒光分析。蛋白質印跡分析揭示出E6E7融合蛋白通常以約30kDa的分子量在SDS-PAGE上遷移。雖然野生型和突變構建體的表達水平是可比較的，但是它們的胞內定位大不相同。這些融合蛋白的免疫熒光染色揭示了野生型E6和E7 VRP的核重疊的點狀染色模式，而對于TetM和PentM VRP則規(guī)察到了更擴散的、核周染色(沒有給出數據)。這種擴散的核周定位表示蛋白聚集/錯誤折疊。這種錯誤折疊表示蛋白不穩(wěn)定，進一步支持了這些融合蛋白具有較高的引發(fā)CTL反應的能力。
實施例2由不同的免疫原性組合物構建體誘導的細胞免疫反應材料和方法小鼠和細胞系.特殊的沒有病原體的6-12周齡雌性C57BL/6小鼠是從Taconic Farms(Germantown，NY)獲得的。將小鼠在Wyeth andLoyola University(Chicago)動物設施中飼養(yǎng)，條件為頂部過濾，隨意進食喝水。特殊的沒有病原體的6-12周齡雌性HLA-A*0201小鼠是從Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)購買的。MC57G和EL4細胞用于細胞毒性測定。BHK-21細胞用于VEE RNA表達、VEE復制子顆粒(VRP)包裝和滴定(效能測定)。腫瘤侵襲研究是使用E6E7-陽性腫瘤系C3(Feltkamp，M.C.W.等人，Eur J Immun 1993，232242-2249)、TC-1(Lin，K.Y.等人，Cancer Res 1996，5621-26)、和HLF16進行的。所有細胞系(除了HLF16、C3和TC-1細胞)都是從American TypeCulture Collection(ATCC；Manassas，VA)獲得的。
細胞毒性(CTL)測定。用3×105個VRP感染單位給C57BL/6小鼠皮下接種免疫。在用在背面足墊中給予的、單一劑量3×105個所示VRP給小鼠接種免疫后4周進行細胞毒性測定。用絲裂霉素-C-處理過的MC57G細胞再次刺激(20∶1)單細胞的脾細胞混懸液，所述MC57G細胞是以5次多重感染(MOI)，用編碼E7或E6的重組修飾牛痘病毒Ankara(MVA)載體感染的。5天后測量CTL活性。E7-或E6-MVA-感染的MC57G細胞和HPV16 E749～57H-2Db-限制肽(RAHYNIVTF(SEQ IDNO41，其與SEQ ID NO14的氨基酸49-57相對應)；Lin等人，CancerRes 1996，56，21-6)-脈沖的EL-4細胞(ATCC)作為靶。以5 MOI，用E7-MVA或E6-MVA感染MC57G細胞1小時。將EL-4細胞(1×107)與肽(20μg/ml)培養(yǎng)1小時。然后通過電穿孔，用銪(Eu+3；Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)標記靶細胞3小時。以所示比例培養(yǎng)效應子和靶細胞3小時，之后采集上清液并與增強子溶液(Wallac；Turku，F(xiàn)inland)混合。Eu+3的釋放是通過時間-分辨熒光，使用1234 Delgfia熒光計(Wallac)量化的。特異性溶解的百分比按照(實驗-自發(fā)釋放/最大-自發(fā)釋放)×100計算。自發(fā)釋放百分比為5-10％。
結果為了描述不同免疫原性組合物構建體誘導的免疫反應，用3×105個wt和PentM VRP構建體的感染性單位給C57BL/6小鼠的背部足墊皮下接種免疫。接種免疫1個月后，使用編碼E6或E7的MVA感染的MC57G靶，通過銪釋放測定法測定CTL-介導的溶解。圖4A揭示出源于用野生型或PentM VRP接種免疫的小鼠的CTL均可殺死表達E7的靶。用E749-57肽脈沖的EL-4靶具有相同的結果(沒有給出數據)。對E6靶的CTL-介導的溶解也很明顯，該E6靶來源于用所有形式的VRP接種免疫的小鼠，雖然在突變VRP的受體中溶解大大降低(圖4B)。有關E7和E6特異性溶解的這些結果在另外兩個實驗中再現(xiàn)，且使用TetM VRP接種免疫的小鼠也可觀察到(沒有給出數據)。
這些結果表明用編碼突變型和野生型融合蛋白的VRP進行接種免疫可對免疫顯性E749-57表位產生相似的CTL反應，其對于腫瘤排斥是很重要的。針對用表達野生型基因的VRP免疫的動物的E6靶的CTL反應是可清楚檢測的，消除CTL反應則是在接受突變形式E6的小鼠中觀察到的，表明63C和/或106C是H-2b-限制表位的重要成分。
實施例3免疫原性組合物構建體在C3和TC1腫瘤模型中的腫瘤保護和治療功效材料和方法腫瘤保護和治療實驗。通過腹膜內注射10mg/kg賽拉嗪(Sigma，St.Louis，MO)和100mg/kg氯胺酮(Abbott Laboratories，Chicago，IL)將每組14只C57BL/6小鼠麻醉，并通過在第21天和第7天將3×105VRP注射到背部足墊中而進行接種免疫。陰性對照小鼠接受3×105IU綠色熒光蛋白(GFP)VRP。一周后，每組中有一半小鼠通過皮下側腹注射5×105C3細胞而受到侵襲(Feltkamp等人，Eur J Immunol 1995，252638-42)，另一半用5×104TC-1細胞侵襲(Lin等人，Cancer Res1996，5621-6)。每3天監(jiān)測一次腫瘤的生長。就C3治療實驗而言，首先在側腹中用5×105個C3腫瘤細胞侵襲小鼠，接著在第7、14和12天，以3×105/每次接種免疫的劑量用所示VRP接種免疫。就人肺成纖維細胞(HLF)治療實驗而言，HLA-A*0201轉基因小鼠是通過在第0天將2×106個HLF16細胞皮下注射到左側腹中侵襲的。在侵襲后第5、10和15天，如上所述將小鼠麻醉并通過將3×105個VRP注射到背部足墊中而進行接種免疫。每隔5天監(jiān)測一次腫瘤生長。
也見小鼠和細胞系(上文)結果比較編碼野生型E7E6和E7E6PentM融合蛋白的VRP的體內預防抗腫瘤功效。所有組的小鼠都是在第0天和第21天用3×105個所示VRP接種免疫且隨后用C3或TC-1腫瘤細胞侵襲的。接受GFP-VRP的所有小鼠作為陰性對照，在腫瘤侵襲約7天后長出腫瘤(圖5A和B)。相反，接受E7E6野生型或PentM的所有小鼠均沒有受到腫瘤侵襲，而與它們是否接受了C3(5×105)(圖5A)或TC-1(5×104)(圖5B)腫瘤細胞無關。這些數據表明保護不限于特異性鼠腫瘤侵襲模型，且該保護主要取決于VRP-編碼的E6和E7基因產物。
作為更嚴格的抗腫瘤功效測量值，在下一個實驗中，在第7、14和21天，用E7E6野生型、PentM、或TetM VRP接種免疫前，用C3腫瘤細胞侵襲小鼠。圖6表示接受任何表述突變型或野生型E6和E7融合蛋白的VRP的小鼠中，有85％-100％排斥C3腫瘤，與之相比，陰性對照小鼠為0％-12％。如先前Velders等人(Cancer Res 2001，617861-7)和圖6所述，單獨表達E7的VRP免疫原性組合物僅在65％-75％的小鼠中促進排斥。
最后，與單獨的E7相比(67％-75％，圖6)，包含編碼作為融合配偶體與E7融合的E6的基因，可再現(xiàn)性地提高治療性抗腫瘤功效(85％-100％，圖6)，而與E6是野生型還是突變型無關。因此，E6中的突變，當與E7融合表達時，不會導致這些腫瘤模型中的抗腫瘤作用消除。然而，該結果舉例說明對含突變氨基酸的表位的最佳CTL反應不會在某些用突變VRP接種免疫的個體中被引發(fā)。在人類中，這可能不是原因，I類和II類HLA等位基因的多樣性可與C57BL/6小鼠表達的有限數量的H-2等位基因相比較。
實施例4免疫原性組合物構建體在HLF16腫瘤模型中的治療功效雖然實施例2和3的結果顯示出鼓舞人心的結果，但C57BL/6小鼠中HPV抗原的H-2b限制T細胞的識別為HLA限制的抗腫瘤反應提供有限的預測值。因此，有關相同的免疫原性組合物可對HLA-A*0201轉基因小鼠中的HPV16 E6和E7誘導HLA-A*0201限制反應的證實是特別重要的(Ressing等人，J Immunol 1995，1545934-5943)。
來源于HLA-A*0201轉基因小鼠的CD8+T細胞已經顯示出可識別相同的HLA-A*0201限制抗原，如HLA-A*0201限制人CTL識別的那些(Engelhard等人，J Immunol 1991，1461226-1232；Shirai等人，J Immunol 1995，1542733-2742)。HLA轉基因小鼠的使用可因此克服H-2限制腫瘤排斥的限制。然而，還沒有HPV腫瘤模型可用于試驗HLA-A*0201限制性抗-腫瘤反應。這里，提出了HLA-A*0201轉基因小鼠的第一個HPV16腫瘤模型(還在Eiben GL等人，Cancer Research，Oct.15 2002，62，No.20中描述)。E6/E7融合體的免疫原性就是在該模型中測試的。
該腫瘤模型是通過用HPV16 E6和E7和Ras V12轉染HLA-A 0201轉基因C57BL/6小鼠的成纖維細胞，在HLA-A 0201小鼠中產生致瘤細胞系(HLF16)而研究的。除去E7基因中的顯性H-2Db表位，以確?？?腫瘤反應不依賴于49-57表位且很可能通過HLA-A*0201介導。
構建體的TetM組用于HLF腫瘤模型中。這些構建體僅含4個突變E6中的C63G和C106G；E7中的C24G和E26G。除去E7中的突變C91G(存在于PentM構建體中)，因為已知它是跨越E7氨基酸86-93的HLA-A*0201表位的-部分(Ressing等人，J Immunol 1995，1545934-43；Ressing等人，Cancer Res 1996，56582-8；Evans等人，Cancer Res 1997，572943-50)。通過使用II類-結合算法(www.imtech.res.in/raghava/propred)，還可確定在E7的氨基酸87和95之間是否存在對若干II類單元型而言雜亂的預測表型。因為發(fā)現(xiàn)II類-介導的免疫反應在C3腫瘤模型中，是VRP免疫原性組合物的治療功效所需的，因此假設PentM免疫原性組合物構建體中存在的C91G突變可破壞人II類表位。
材料和方法HLF16腫瘤模型的構建體和描述。HLF16腫瘤細胞系來源于從HLA-A2 Dd轉基因C57BL/6小鼠解剖下來的心肺組織。培養(yǎng)若干周后，用含E6/E7的pIRES雙-順式載體轉化粘附的成纖維細胞，并激活H-ras，同時賦予遺傳霉素抗性。除去來源于HPV16 E749-57基因產物的唯一已知的H-2b I類限制表位(Vel1ders等人，Cancer Res 1997，617861-7867)以確保腫瘤不存在于該免疫顯性的HPV16 E7表位。在G418上選擇轉染子并克隆擴展。然后通過FACS分析測試各克隆的HLA-A*0201表述。隨后測試顯示最高水平HLA-A*0201表達的克隆在軟瓊脂中形成集落的能力。心肺成纖維細胞克隆16(HLF16)在軟瓊脂中顯示出錨定的獨立性生長，并選擇用于進一步研究。用抗-E7單克隆抗體進行免疫熒光染色后，E7表達在HLF16的胞質和核中是顯而易見的。為了確定HLF16系事實上是否在小鼠中形成腫瘤，用不同濃度的腫瘤細胞給HLA-A*0201轉基因小鼠注射并監(jiān)測35天。所有小鼠均長出腫瘤，但只有用最高劑量，2×106個HLF16細胞侵襲的那些才隨著時間而仍然維持腫瘤。HLF16腫瘤大約在第5天出現(xiàn)，且繼續(xù)逐漸生長，直到它在第35天變成大約12×12×12mm，并在該時間點處死小鼠。HLF16腫瘤細胞系的構建和描述還可見Eiben GL等人(Cancer Research，Oct.15 2002，62，No.20)。
軟瓊脂測定法。錨定-獨立性生長能力是通過評價混懸于軟瓊脂中的細胞的集落形成效率而測定的。將轉化細胞和對照細胞(0.5×106、0.25×106和0.1×106)接種在5ml 0.3％覆蓋瓊脂上，并加入到用20ml0.6％襯墊瓊脂覆蓋的10mm平板中。干燥平板并在37℃下培養(yǎng)。平板接種3周后計算集落數。
還可見小鼠和細胞系、腫瘤保護和治療實驗、及蛋白質印跡和名義熒光(上述)結果通過BHK-感染細胞的蛋白質印跡和免疫熒光檢測TetM構建體的表達。E6E7和E7E6 TetM蛋白以約30kDa在SDS-PAGE上遷移并具有與PentM構建體非常相似的擴散性核周定位。
在HLF腫瘤模型中分析PentM和TetM免疫原性組合物構建體的腫瘤治療功效(圖7)。用2×106個HLF 16細胞皮下侵襲轉基因小鼠，并在侵襲后第5、10和15天，用GFP VRP、TetM VRP或PentM VRP給小鼠接種免疫。用E7E6 TetM VRP接種免疫后出現(xiàn)完全的腫瘤排斥，而E7E6 PentM VRP和E6E7 PentM VRP則誘導90％小鼠的腫瘤退化，除了E6E7 TetM外(圖7)。這些結果證實了用這里試驗的若干VRP進行的治療性接種免疫產生了較高程度的抗腫瘤功效，和E749-57特異的T細胞的貢獻無關。此外，這些結果證實了其中E6在E7羧基末端的融合體(E7E6融合體)較之其中E6位于氨基末端的對應物(E6E7融合體)可提供更強的免疫保護。
根據C3和HLF16腫瘤模型的集合治療功效數據(圖6和7)，我們可總結出編碼HPV16 E6和E7突變形式的VRP，沒有任何輔助蛋白、細胞因子、或佐劑，對消除所建立的鼠腫瘤而言十分有效。
實施例5表達突變體E6和E7的VRP不會誘導p53和Rb的降解用表達野生型HPV16 E6和E7，作為融合蛋白或單個蛋白、E7E6TetM融合蛋白的VRP、或作為陰性對照的GFP感染后，評價原代人MEC中p53和Rb的穩(wěn)態(tài)水平。
材料和方法p53和Rb的檢測。以MOI＝10用編碼野生型或突變形式E6和E7的VRP感染原代人乳上皮細胞(MEC，Clonetics，San Diego，CA)并在16-20小時后采集總的細胞蛋白。為了提高p53檢測，用1.0nM放線菌素D處理細胞(Sigma，St.Louis，MO)。每泳道上樣25微克總蛋白，通過SDS-PAGE電泳，并印跡到PVDF膜上。使用抗-p53抗體(FL-393，Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA)或抗-Rb抗體(Catalog# 554136，BDPharmingen，San Diego，CA)探測蛋白質印跡。通過用抗-微管抗體探測而監(jiān)測微管蛋白水平作為上樣對照(H-235，Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA)。
結果確定在VRP感染的情況下，與這些蛋白的野生型形式相比，突變形式的E6和E7融合蛋白是否會功能性滅活p53和Rb。選擇E7E6 TetM是因為它被證實具有較高的抗腫瘤功效(圖6和7)并含有最小數量的突變。
用編碼單獨的HPV16 E6、單獨的E7、E7E6野生型或E7E6 TetM的VRP感染原代人乳上皮細胞(MEC)。以MOI＝10，用這些VRP中的每一個感染原代人乳上皮細胞(MEC)約20小時后，通過SDS-PAGE將含等量總細胞蛋白的細胞溶解產物進行電泳，轉移到PVDF膜上，并用p53(圖8A)、Rb(圖8B)的特異性抗體探測，微管蛋白作為上樣對照。這些蛋白質印跡的結果在圖8A和8B中表示，且代表兩個獨立的實驗。
與含有可與陰性對照GFP-VRP感染樣品相比較的p53水平、用E7E6 TetM感染的MEC相比，用編碼單獨的E6或E7E6野生型融合蛋白感染的MEC含有不可檢測水平的p53(圖8A)。與用E7E6 TetM VRP或GFP-VRP感染的MEC相比，用編碼單獨的E7或E7E6野生型融和蛋白的VRP感染的MEC含有不可檢測水平的Rb(圖8B)。含E7的融合蛋白在E7E6野生型和E7E6 TetM VRP感染樣品中的存在是通過用抗-E7單克隆抗體探測那些泳道而加以證實的(圖8A和8B)。結果顯示在VRP感染的情況下，表達E6和E7野生型形式的原代MEC中的p53和Rb水平大大降低，而在VRP感染后，在表達E7E6 TetM的MEC中則是正常的。
總之，MEC的VRP感染揭示出分別含E6和E7野生形式的培養(yǎng)物中的p53和Rb水平大大降低；與E6簡單融合的E7不足以損害任一蛋白的活性(圖8A和B)。相反，用含E6(63C和106C)和E7(24C和26E)突變的E7E6 TetM VRP感染的MEC含有正常水平的p53和Rb(圖8A和B)，表明這4個突變可消除這些蛋白的原始致癌活性。對E7E6 TetM VRP的永生化可能的評價揭示了MEC在感染后死亡，其是由復制子表達的AV非結構蛋白表達的預期結果(Griffith等人，Annu.Rev.Microbiol.1997，51565-592)且進一步支持了該載體的安全性。
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本發(fā)明的說明書中引證并討論了若干參考文獻，包括專利、專利申請和各種公開出版物。這種參考文獻的引證和/或討論僅被提供用于闡明本發(fā)明的描述，而沒有承認任何這種參考文獻都是此處所述本發(fā)明的“現(xiàn)有技術”。本說明書中引證和/或討論的所有參考文獻整體引入此處作為參考，且與每篇參考文獻單獨引入此處作為參考的程度相等。
序列表<110>WyethCassetti，Maria C.
Smith，Larry<120>人乳頭瘤病毒多肽和免疫原性組合物<130>00630/200M137-WO0<150>US 60/415,929<151>2002-10-03<160>65<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>248<212>PRT<213>16型人乳頭瘤病毒<400>1Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys1 5 10 15Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr20 25 30Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg35 40 45Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp50 55 60Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys65 70 75 80Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu85 90 95Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro100 105 110Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile115 120 125Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg130 135 140Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu145 150 155 160
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agctcagagg aggaggatga aatagatggt ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc600cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa660agcacacacg tagacattcg tactttggaa gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg720ggccccatct gttctcagaa accataa747<210>7<211>248<212>PRT<213>16型人乳頭瘤病毒<400>7Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln1 5 10 15Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser20 25 30Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp35 40 45Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr50 55 60Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu65 70 75 80Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln85 90 95Lys Pro Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu100 105 110Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val115 120 125Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe130 135 140Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys145 150 155 160Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr165 170 175Cys Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro180 185 190
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115 120 125Met Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Ser Glu Cys Trp Arg Pro Arg Pro130 135 140Val Thr Gln Val145<210>23<211>155<212>PRT<213>56型人乳頭瘤病毒<400>23Met Glu Pro Gln Phe Asn Asn Pro Gln Glu Arg Pro Arg Ser Leu His1 5 10 15His Leu Ser Glu Val Leu Glu Ile Pro Leu Ile Asp Leu Arg Leu Ser20 25 30Cys Val Tyr Cys Lys Lys Glu Leu Thr Arg Ala Glu Val Tyr Asn Phe35 40 45Ala Cys Thr Glu Leu Lys Leu Val Tyr Arg Asp Asp Phe Pro Tyr Ala50 55 60Val Cys Arg Val Cys Leu Leu Phe Tyr Ser Lys Val Arg Lys Tyr Arg65 70 75 80Tyr Tyr Asp Tyr Ser Val Tyr Gly Ala Thr Leu Glu Ser Ile Thr Lys85 90 95Lys Gln Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Tyr Arg Cys Gln Ser Pro100 105 110Leu Thr Pro Glu Glu Lys Gln Leu His Cys Asp Arg Lys Arg Arg Phe115 120 125His Leu Ile Ala His Gly Trp Thr Gly Ser Cys Leu Gly Cys Trp Arg130 135 140Gln Thr Ser Arg Glu Pro Arg Glu Ser Thr Val145 150 155<210>24<211>149<212>PRT<213>58型人乳頭瘤病毒<400>24
Met Phe Gln Asp Ala Glu Glu Lys Pro Arg Thr Leu His Asp Leu Cys1 5 10 15Gln Ala Leu Glu Thr Ser Val His Glu Ile Glu Leu Lys Cys Val Glu20 25 30Cys Lys Lys Thr Leu Gln Arg Ser Glu Val Tyr Asp Phe Val Phe Ala35 40 45Asp Leu Arg Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Phe Ala Val Cys Lys50 55 60Val Cys Leu Arg Leu Leu Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Asn65 70 75 80Tyr Ser Leu Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Gln Thr Leu Lys Lys Cys Leu85 90 95Asn Glu Ile Leu Ile Arg Cys Ile Ile Cys Gln Arg Pro Leu Cys Pro100 105 110Gln Glu Lys Lys Arg His Val Asp Leu Asn Lys Arg Phe His Asn Ile115 120 125Ser Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Ala Val Cys Trp Arg Pro Arg Arg130 135 140Arg Gln Thr Gln Val145<210>25<211>160<212>PRT<213>59型人乳頭瘤病毒<400>25Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Gln Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp1 5 10 15Leu Ser Thr Thr Leu Asn Ile Pro Leu His Asp Ile Arg Ile Asn Cys20 25 30Val Phe Cys Lys Gly Glu Leu Gln Glu Arg Glu Val Phe Glu Phe Ala35 40 45Phe Asn Asp Leu Phe Ile Val Tyr Arg Asp Cys Thr Pro Tyr Ala Ala50 55 60
Cys Leu Lys Cys Ile Ser Phe Tyr Ala Arg Val Arg Glu Leu Arg Tyr65 70 75 80Tyr Arg Asp Ser Val Tyr Gly Glu Thr Leu Glu Ala Glu Thr Lys Thr85 90 95Pro Leu His Glu Leu Leu Ile Arg Cys Tyr Arg Cys Leu Lys Pro Leu100 105 110Cys Pro Thr Asp Lys Leu Lys His Ile Thr Glu Lys Arg Arg Phe His115 120 125Asn Ile Ala Gly Ile Tyr Thr Gly Gln Cys Arg Gly Cys Arg Thr Arg130 135 140Ala Arg His Leu Arg Gln Gln Arg Gln Ala Arg Ser Glu Thr Leu Val145 150 155 160<210>26<211>158<212>PRT<213>68型人乳頭瘤病毒<400>26Met Ala Leu Phe His Asn Pro Glu Glu Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp1 5 10 15Leu Cys Arg Thr Leu Asp Thr Thr Leu His Asp Val Thr Ile Asp Cys20 25 30Val Tyr Cys Arg Arg Gln Leu Gln Arg Thr Glu Val Tyr Glu Phe Ala35 40 45Phe Ser Asp Leu Cys Val Val Tyr Arg Asp Gly Val Pro Phe Ala Ala50 55 60Cys Gln Ser Cys Ile Lys Phe Tyr Ala Lys Ile Arg Glu Leu Arg Tyr65 70 75 80Tyr Ser Glu Ser Val Tyr Ala Thr Thr Leu Glu Thr Ile Thr Asn Thr85 90 95Lys Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Met Ser Cys Leu Lys Pro Leu100 105 110Cys Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Thr Thr Lys Arg Arg Leu His115 120 125Lys Ile Ala Gly Asn Phe Thr Gly Gln Cys Arg His Cys Trp Thr Ser
130 135 140Lys Arg Glu Asp Arg Arg Arg Ile Arg Gln Glu Thr Gln Val145 150 155<210>27<211>105<212>PRT<213>18型人乳頭瘤病毒<400>27Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu1 5 10 15Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser20 25 30Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His35 40 45Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met50 55 60Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Lys Leu Val Val Glu Ser Ser Ala65 70 75 80Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe85 90 95Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln100 105<210>28<211>98<212>PRT<213>31型人乳頭瘤病毒<400>28Met Arg Gly Glu Thr Pro Thr Leu Gln Asp Tyr Val Leu Asp Leu Gln1 5 10 15Pro Glu Ala Thr Asp Leu His Cys Tyr Glu Gln Leu Pro Asp Ser Ser20 25 30Asp Glu Glu Asp Val Ile Asp Ser Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp35 40 45Thr Ser Asn Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Gln Cys Lys Ser Thr50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr Gln Val Asp Ile Arg Ile Leu Gln65 70 75 80Glu Leu Leu Met Gly Ser Phe Gly Ile Val Cys Pro Asn Cys Ser Thr85 90 95Arg Leu<210>29<211>97<212>PRT<213>33型人乳頭瘤病毒<400>29Met Arg Gly His Lys Pro Thr Leu Lys Glu Tyr Val Leu Asp Leu Tyr1 5 10 15Pro Glu Pro Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Ser Asp Ser Ser20 25 30Asp Glu Asp Glu Gly Leu Asp Arg Pro Asp Gly Gln Ala Gln Pro Ala35 40 45Thr Ala Asp Tyr Tyr Ile Val Thr Cys Cys His Thr Cys Asn Thr Thr50 55 60Val Arg Leu Cys Val Asn Ser Thr Ala Ser Asp Leu Arg Thr Ile Gln65 70 75 80Gln Leu Leu Met Gly Thr Val Asn Ile Val Cys Pro Thr Cys Ala Gln85 90 95Gln<210>30<211>99<212>PRT<213>35型人乳頭瘤病毒<400>30Met His Gly Glu Ile Thr Thr Leu Gln Asp Tyr Val Leu Asp Leu Glu1 5 10 15Pro Glu Ala Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Cys Asp Ser Ser20 25 30Glu Glu Glu Glu Asp Thr Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Lys Pro
35 40 45Asp Thr Ser Asn Tyr Asn Ile Val Thr Ser Cys Cys Lys Cys Glu Ala50 55 60Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Ile Asp Ile Arg Lys Leu65 70 75 80Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Phe Gly Ile Val Cys Pro Gly Cys Ser85 90 95Gln Arg Ala<210>31<211>109<212>PRT<213>39型人乳頭瘤病毒<400>31Met Arg Gly Pro Lys Pro Thr Leu Gln Glu Ile Val Leu Asp Leu Cys1 5 10 15Pro Tyr Asn Glu Ile Gln Pro Val Asp Leu Val Cys His Glu Gln Leu20 25 30Gly Glu Ser Glu Asp Glu Ile Asp Glu Pro Asp His Ala Val Asn His35 40 45Gln His Gln Leu Leu Ala Arg Arg Asp Glu Pro Gln Arg His Thr Ile50 55 60Gln Cys Ser Cys Cys Lys Cys Asn Asn Thr Leu Gln Leu Val Val Glu65 70 75 80Ala Ser Arg Asp Thr Leu Arg Gln Leu Gln Gln Leu Phe Met Asp Ser85 90 95Leu Gly Phe Val Cys Pro Trp Cys Ala Thr Ala Asn Gln100 105<210>32<211>106<212>PRT<213>45型人乳頭瘤病毒<400>32Met His Gly Pro Arg Glu Thr Leu Gln Glu Ile Val Leu His Leu Glu1 5 10 15
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<400>34Met Arg Gly Asp Lys Ala Thr Ile Lys Asp Tyr Ile Leu Asp Leu Gln1 5 10 15Pro Glu Thr Thr Asp Leu His Cys Tyr Glu Gln Leu Gly Asp Ser Ser20 25 30Asp Glu Glu Asp Thr Asp Gly Val Asp Arg Pro Asp Gly Gln Ala Glu35 40 45Gln Ala Thr Ser Asn Tyr Tyr Ile Val Thr Tyr Cys His Ser Cys Asp50 55 60Ser Thr Leu Arg Leu Cys Ile His Ser Thr Ala Thr Asp Leu Arg Thr65 70 75 80Leu Gln Gln Met Leu Leu Gly Thr Leu Gln Val Val Cys Pro Gly Cys85 90 95Ala Arg Leu<210>35<211>105<212>PRT<213>56型人乳頭瘤病毒<400>35Met His Gly Lys Val Pro Thr Leu Gln Asp Val Val Leu Glu Leu Thr1 5 10 15Pro Gln Thr Glu Ile Asp Leu Gln Cys Asn Glu Gln Leu Asp Ser Ser20 25 30Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Val Asp His Leu Gln Glu Arg Pro Gln35 40 45Gln Ala Arg Gln Ala Lys Gln His Thr Cys Tyr Leu Ile His Val Pro50 55 60Cys Cys Glu Cys Lys Phe Val Val Gln Leu Asp Ile Gln Ser Thr Lys65 70 75 80Glu Asp Leu Arg Val Val Gln Gln Leu Leu Met Gly Ala Leu Thr Val85 90 95Thr Cys Pro Leu Cys Ala Ser Ser Asn100 105
<210>36<211>98<212>PRT<213>58型人乳頭瘤病毒<400>36Met Arg Gly Asn Asn Pro Thr Leu Arg Glu Tyr Ile Leu Asp Leu His1 5 10 15Pro Glu Pro Thr Asp Leu Phe Cys Tyr Glu Gln Leu Cys Asp Ser Ser20 25 30Asp Glu Asp Glu Ile Gly Leu Asp Gly Pro Asp Gly Gln Ala Gln Pro35 40 45Ala Thr Ala Asn Tyr Tyr Ile Val Thr Cys Cys Tyr Thr Cys Gly Thr50 55 60Thr Val Arg Leu Cys Ile Asn Ser Thr Thr Thr Asp Val Arg Thr Leu65 70 75 80Gln Gln Leu Leu Met Gly Thr Cys Thr Ile Val Cys Pro Ser Cys Ala85 90 95Gln Gln<210>37<211>107<212>PRT<213>59型人乳頭瘤病毒<400>37Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Cys Asp Ile Val Leu Asp Leu Glu1 5 10 15Pro Gln Asn Tyr Glu Glu Val Asp Leu Val Cys Tyr Glu Gln Leu Pro20 25 30Asp Ser Asp Ser Glu Asn Glu Lys Asp Glu Pro Asp Gly Val Asn His35 40 45Pro Leu Leu Leu Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Asn Ile Val50 55 60Cys Val Cys Cys Lys Cys Asn Asn Gln Leu Gln Leu Val Val Glu Thr65 70 75 80
Ser Gln Asp Gly Leu Arg Ala Leu Gln Gln Leu Phe Met Asp Thr Leu85 90 95Ser Phe Val Cys Pro Leu Cys Ala Ala Asn Gln100 105<210>38<211>110<212>PRT<213>68型人乳頭瘤病毒<400>38Met His Gly Pro Lys Pro Thr Val Gln Glu Ile Val Leu Glu Leu Cys1 5 10 15Pro Tyr Asn Glu Ile Gln Pro Val Asp Leu Val Cys His Glu Gln Leu20 25 30Gly Asp Ser Asp Asp Glu Ile Asp Glu Pro Asp His Ala Val Asn His35 40 45His Gln His Leu Leu Leu Ala Arg Arg Asp Glu Gln Gln Arg His Arg50 55 60Ile Gln Cys Leu Cys Cys Lys Cys Asn Lys Ala Leu Gln Leu Val Val65 70 75 80Glu Ala Ser Arg Asp Asn Leu Arg Thr Leu Gln Gln Leu Phe Met Asp85 90 95Ser Leu Asn Phe Val Cys Pro Trp Cys Ala Thr Glu Thr Gln100 105 1l0<210>39<211>152<212>PRT<213>人乳頭瘤病毒<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(152)<223>其中Xaa是任何氨基酸<400>39Xaa Xaa Xaa Phe Glx Asp Pro Xaa Glu Arg Pro Xaa Lys Leu Xaa Asp1 5 10 15Leu Cys Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa His Asx Ile Xaa Xaa Xaa Cys20 25 30
Val Tyr Cys Lys Xaa Glx Leu Glx Arg Xaa Glu Val Tyr Xaa Phe Ala35 40 45Phe Xaa Asp Leu Xaa Ile Val Tyr Arg Asp Xaa Xaa Pro Xaa Ala Xaa50 55 60Cys Xaa Xaa Cys Leu Xaa Phe Tyr Ser Lys Ile Xaa Glu Xaa Arg Xaa65 70 75 80Tyr Xaa Xaa Ser Val Tyr Gly Xaa Thr Leu Glu Xaa Xaa Thr Xaa Lys85 90 95Xaa Leu Xaa Asx Leu Leu Ile Arg Cys Xaa Xaa Cys Gln Xaa Pro Leu100 105 110Cys Pro Xaa Glu Lys Xaa Arg His Xaa Asx Xaa Lys Xaa Arg Phe His115 120 125Asn Ile Xaa Gly Xaa Trp Thr Gly Xaa Cys Xaa Xaa Cys Trp Xaa Xaa130 135 140Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa145 150<210>40<211>104<212>PRT<213>人乳頭瘤病毒<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(104)<223>其中Xaa是任何氨基酸<400>40Met Xaa Gly Xaa Xaa Pro Thr Leu Xaa Xaa Xaa Val Leu Asp Leu Xaa1 5 10 15Pro Glx Xaa Xaa Xaa Asp Leu Xaa Cys Tyr Glu Gln Leu Xaa Asp Ser20 25 30Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40 45Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Cys50 55 60Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Val Glx Ser Xaa Xaa Xaa65 70 75 80
Asp Leu Arg Xaa Leu Gln Gln Leu Leu Met Gly Thr Leu Xaa Xaa Val85 90 95Cys Pro Xaa Cys Ala Xaa Xaa Xaa100<210>41<211>9<212>PRT<213>16型人乳頭瘤病毒<400>41Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe1 5<210>42<211>477<212>DNA<213>18型人乳頭瘤病毒<400>42atggcgcgct ttgaggatcc aacacggcga ccctacaagc tacctgatct gtgcacggaa60ctgaacactt cactgcaaga catagaaata acctgtgtat attgcaagac agtattggaa120cttacagagg tatttgaatt tgcatttaaa gatttatttg tggtgtatag agacagtata180ccccatgctg catgccataa atgtatagat ttttattcta gaattagaga attaagacat240tattcagact ctgtgtatgg agacacattg gaaaaactaa ctaacactgg gttatacaat300ttattaataa ggtgcctgcg gtgccagaaa ccgttgaatc cagcagaaaa acttagacac360cttaatgaaa aacgacgatt tcacaacata gctgggcact atagaggcca gtgccattcg420tgctgcaacc gagcacgaca ggaacgactc caacgacgca gagaaacaca agtataa 477<210>43<211>474<212>DNA<213>31型人乳頭瘤病毒<400>43atgttcaaaa atcctgcaga aagacctcgg aaattgcatg aactaagctc ggcattggaa60ataccctacg atgaactaag attgaattgt gtctactgca aaggtcagtt aacagaaaca120gaggtattag attttgcatt tacagattta acaatagtat atagggacga cacaccacac180ggagtgtgta caaaatgttt aagattttat tcaaaagtaa gtgaatttag atggtataga240tatagtgtgt atggaacaac attagaaaaa ttgacaaaca aaggtatatg tgatttgtta300attaggtgta taacgtgtca aagaccgttg tgtccagaag aaaaacaaag acatttggat360aaaaagaaac gattccacaa cataggagga aggtggacag gacgttgcat agcatgttgg420agaagacctc gtactgaaac ccaagtgtaa acatgcgtgg agaaacacct acgt 474
<210>44<211>450<212>DNA<213>33型人乳頭瘤病毒<400>44atgtttcaag acactgagga aaaaccacga acattgcatg atttgtgcca agcattggag60acaactatac acaacattga actacagtgc gtggaatgca aaaaaccttt gcaacgatct120gaggtatatg attttgcatt tgcagattta acagttgtat atagagaggg aaatccattt180ggaatatgta aactgtgttt gcggttctta tctaaaatta gtgaatatag acattataat240tattctgtat atggaaatac attagaacaa acagttaaaa aacctttaaa tgaaatatta300attaggtgta ttatatgtca aagacctttg tgtcctcaag aaaaaaaacg acatgtggat360ttaaacaaac gatttcataa tatttcgggt cgttgggcag ggcgctgtgc ggcgtgttgg420aggtcccgac gtagagaaac tgcactgtga 450<210>45<211>450<212>DNA<213>35型人乳頭瘤病毒<400>45atgtttcagg acccagctga acgaccttac aaactgcatg atttgtgcaa cgaggtagaa60gaaagcatcc atgaaatttg tttgaattgt gtatactgca aacaagaatt acagcggagt120gaggtatatg actttgcatg ctatgatttg tgtatagtat atagagaagg ccagccatat180ggagtatgca tgaaatgttt aaaattttat tcaaaaataa gtgaatatag atggtataga240tatagtgtgt atggagaaac gttagaaaaa caatgcaaca aacagttatg tcatttatta300attaggtgta ttacatgtca aaaaccgctg tgtccagttg aaaagcaaag acatttagaa360gaaaaaaaac gattccataa catcggtgga cggtggacag gtcggtgtat gtcctgttgg420aaaccaacac gtagagaaac cgaggtgtaa 450<210>46<211>477<212>DNA<213>39型人乳頭瘤病毒<400>46atggcgcgat ttcacaatcc tgcagaacgg ccatacaaat tgccagacct gtgcacaacg60ctggacacca ccttgcagga cattacaata gcctgtgtct attgcagacg accactacag120caaaccgagg tatatgaatt tgcatttagt gatttatatg tagtatatag ggacggggaa180ccactagctg catgccaatc atgtataaaa ttttatgcta aaatacggga gctacgatat240tactcggact cggtgtatgc aactacatta gaaaatataa ctaatacaaa gttatataat300
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1.一種包含人乳頭瘤病毒E6和E7多肽的多肽，其中該E7多肽在與SEQ ID NO14的氨基酸24、26或91相對應的任何一個或多個氨基酸處具有突變，且該E6多肽沒有突變或在與SEQ ID NO13的氨基酸63或106相對應的任何一個或多個氨基酸處具有突變。
2.根據權利要求1所述的多肽，其中該突變的氨基酸突變成甘氨酸.
3.根據權利要求1所述的多肽，其中E7多肽在E6多肽之前。
4.根據權利要求2所述的多肽，其中E7多肽在E6多肽之前。
5.一種編碼權利要求1的多肽的分離的核酸。
6.根據權利要求5所述的核酸，其中E7的核苷酸序列在E6的核苷酸序列之前。
7.一種受表達控制序列控制的、包含權利要求5的核酸序列的表達載體。
8.一種包含權利要求5的核酸的宿主細胞。
9.一種表達權利要求1的多肽的宿主細胞。
10.一種包含權利要求7的表達載體的宿主細胞。
11.一種免疫原性組合物，它包含(a)權利要求1的多肽；和(b)藥學可接受的載體。
12.根據權利要求11所述的免疫原性組合物，它還包含佐劑。
13.一種免疫原性組合物，它包含權利要求5的核酸。
14.一種包含權利要求5的核酸的重組病毒。
15.根據權利要求14所述的重組病毒，其中該病毒是一種修飾的委內瑞拉馬腦炎病毒。
16.一種用于在個體中產生免疫反應的方法，該方法包括給予個體足以產生免疫反應的量的權利要求11的免疫原性組合物。
17.一種治療宮頸癌的方法，該方法包括給予被診斷患有宮頸癌的患者足以產生保護性免疫反應的量的權利要求11的免疫原性組合物。
18.一種預防宮頸癌的方法，該方法包括給予個體足以產生保護性免疫反應的量的權利要求11的免疫原性組合物。
19.一種預防宮頸癌的方法，該方法包括給予個體足以產生保護性免疫反應的量的權利要求7的表達載體。
20.一種治療宮頸癌的方法，該方法包括給予被診斷患有宮頸癌的患者足以產生保護性免疫反應的量的權利要求7的表達載體。
21.根據權利要求1所述的分離的多肽，其中該E7多肽在與SEQ IDNO14的氨基酸24、26和91相對應的至少兩個氨基酸處具有突變，且該E6多肽在與SEQ ID NO13的氨基酸63和106相對應的氨基酸處具有一個或多個突變。
22.一種分離的多肽，它包含SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ IDNO9、或SEQ ID NO11所示的氨基酸序列。
23.一種分離的核酸序列，它編碼包含SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9、或SEQ ID NO11所示的氨基酸序列的多肽。
24.根據權利要求23所述的分離的核酸，它具有SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO1O或SEQ ID NO12所示的核苷酸序列。
25.一種受表達控制序列控制的、包含權利要求23的核酸序列的表達載體。
26.一種受表達控制序列控制的、包含權利要求24的核酸序列的表達載體。
全文摘要
本發(fā)明提供用于治療和預防人乳頭瘤病毒(HPV)－相關癌癥且特別是宮頸癌的免疫原性組合物和藥物組合物。具體而言，本發(fā)明涉及用于產生抗HPV的免疫反應的融合蛋白，及編碼這些融合蛋白的核酸。特別是，本發(fā)明提供HPV E6與E7的融合體，其中該E6和/或E7包含一個或多個突變。這些突變可消除這些致癌蛋白的轉化活性且因此賦予E6/E7融合體安全性。此外，這些融合體可維持或增加E6和E7的免疫原性效能。任何基因或蛋白送遞方法均可用于送遞或包裝本發(fā)明的免疫原性組合物。
文檔編號A61K39/12GK1720060SQ200380104973
公開日2006年1月11日 申請日期2003年10月2日 優(yōu)先權日2002年10月3日
發(fā)明者L·史密斯, M·C·卡塞蒂, J·K·普倫, S·P·麥克埃爾希尼 申請人:惠氏控股公司