專利名稱：得自鼠尾草屬的具有抗病毒活性的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及得自植物鼠尾草屬提取物的活性物質(zhì)。所述活性成分包括具有至少一個(gè)來自β-(3,4-二羥基苯基)乳酸和/或咖啡酸的部分的分子偶聯(lián)物。優(yōu)選所述活性成分是丹酚酸、其二聚體、三聚體和四聚體。不論單用或更優(yōu)選在合用時(shí)，都可以施用所述活性劑用于治療病毒性感染或病毒介導(dǎo)的病癥。
SM植物具有數(shù)種可提取的部位。根部首先用乙醇提取隨后用冷水提取(SM(I))或用熱水(SM(I))提取。兩種用水提取的部分都顯示出抗病毒活性。
目前開發(fā)了以病毒生命周期中不同點(diǎn)為靶子的抗病毒劑。例如，已開發(fā)出用于治療逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的抗病毒劑，其是以逆轉(zhuǎn)錄病毒特異性酶如逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)和整合酶為靶子。尋找其他抗病毒劑以對抗疾病(如皰疹、肝炎和流感)的研究仍在繼續(xù)。
抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的抗病毒劑以整合酶蛋白為靶子的抗病毒劑包括肽抑制劑(美國專利號5578573)、核酸配體抑制劑(美國專利號5757287和5587468)以及如伊快霉素(Equisetin)(美國專利號5759842)和Ermophilane倍半萜類化合物(美國專利號5858738)。迄今為止，已經(jīng)鑒定了多種化合物并且已由FDA批準(zhǔn)上市用于HIV，但僅批準(zhǔn)了RT和蛋白酶抑制劑。
作為抗病毒劑的咖啡酸咖啡酸分離自野生九重葛屬植物(Bougainvillea spectabillis Wild)(Nyctaginaceae)的莖部，其在民間已用來抗肝炎(Chang等人，《抗癌研究》(Anticancer Res)14:501-6(1994))。據(jù)報(bào)導(dǎo)咖啡酸可抑制黃嘌呤氧化酶，該酶與若干疾病如痛風(fēng)、肝炎和腫瘤有關(guān)(Chan等人，《抗癌研究》15:703-7(1995)；和Chang等人(1994))。咖啡酸氧化產(chǎn)物(KOP)抑制Ⅰ型和Ⅱ型人皰疹病毒(Thiel等人，病毒學(xué)雜志(Acta Virol)27:200-8(1983))。根據(jù)Kashiwada等人在《自然進(jìn)程雜志》(J.Nat.Prod.)58:392-400(1995)所述，咖啡酸四聚體和咖啡酸四聚體葡糖苷的二鉀鹽及鉀鈉鹽具有抗HIV活性。市售的咖啡酸也具有抗病毒活性，這已利用對HIV的RT試驗(yàn)得到證實(shí)(Kreis等人《抗病毒研究》(Antiviral Res.)14323-37(1990))?？Х人岜揭阴?CAPE)對于HIV-1的整合酶蛋白具有抑制活性(Fesen等人《美國科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci,USA)90:2399-2403(1993)；Fesen等人《生物化學(xué)和藥理學(xué)》(Biochem.Pharmacol.)48:595-608(1994)；Burke等人《藥物化學(xué)雜志》(J.Med.Chem.)38:4171-8(1995)；Mazumder等人《藥物化學(xué)雜志》39:2472-81(1996))。然而，用于制備咖啡酸聚合物的方法影響其HIV-1和HIV-2抑制活性(Nakashima等人《化學(xué)和藥學(xué)通訊》(Chem.Pharm.Bull.)(東京)40:2102-5(1992))?？Х人崤c肉桂酸和迷迭香酸(rosemarinic acid)一起還可用于治療流感病毒，因其具有抗氧活性(國際專利申請98/30228)。
作為抗病毒劑的迷迭香酸和紫草酸(lithospermic acids)迷迭香酸是咖啡酸的二聚體。迷迭香酸的二聚體是紫草酸。已經(jīng)鑒定出在SM根部的提取物中同時(shí)存在迷迭香酸和紫草酸(Kohda等人《化學(xué)和藥學(xué)通訊》(東京)37:1287-90(1989))。迷迭香酸具有抗HIV活性(Arda等人《自然進(jìn)程雜志》60:1170-3(1997))并且是有效的1型單純皰疹(HSV-1)抑制劑(Dimitrova等人，《保加利亞微生物學(xué)雜志》(ActaMicrobiol.Bulg.)29:65-72(1993))。迷迭香酸被推薦用于治療炎性疾病和失調(diào)(美國專利號4329361)。
作為抗病毒劑的肉桂酸取代肉桂酸酯抑制流感病毒A/香港(H3N2)的感染活性(Serkedjieva等人《自然進(jìn)程雜志》55:294-302(1992))；肉桂酸衍生物的甾酯被證實(shí)在體外對于屬于細(xì)小核糖核酸病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科和皰疹病毒科的病毒具有抗病毒活性(“肉桂酸衍生物的膽甾醇酯的抗病毒活性”Z.Naturforsch 53:883-7(1998)；Conti等人《抗病毒化學(xué)和化學(xué)治療法》(Antivir.Chem.Chemother.)9:511-5(1998))。取代肉桂酸的脫氫聚合物也被描述為HIV-I治療劑(美國專利號5346695和5632980)。
丹酚酸文獻(xiàn)中未報(bào)導(dǎo)丹酚酸具有抗病毒性質(zhì)。若干形式的丹酚酸(例如丹酚酸A、乙?；し铀?據(jù)報(bào)道具有抗氧特性(Lin等人《生物化學(xué)和藥理學(xué)雜志》51:1237-1241(1996))。丹酚酸也顯示出可預(yù)防肝損傷和纖維變性，與其抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)(Hu等人，ActaPharmacol.Sin,18:478-480(1997))，并且可用于治療冠心病(日本專利2131423)。文獻(xiàn)中公開的丹酚酸的其他形式包括分離自貴州鼠尾草水提取物的那些(例如丹酚酸A、B、C、H和I)(Zhang等人《植物醫(yī)學(xué)》60:70-72(1994))或分離自丹參水提取物的那些(例如丹酚酸K，一種咖啡酸三聚體)(Kasimu等人《化學(xué)和藥學(xué)通訊》46:500-504(1998)；和Tezuka等人《化學(xué)和藥學(xué)通訊》46:107-112(1998))。丹酚酸F2和F3可以通過Dalla等人在《四面體》55:6923-2930(1999)；和Dalla等人《四面體通報(bào)》39:8285-8286(1998)中所述的合成方法來制備。鼠尾草科的其他成員可以用作獲得丹參的來源，包括南丹參，S.deserta,S.miltiorhizavar.miltiorhiza f.alba，皖鄂丹參，紫化擬丹參、甘西鼠尾、褐毛甘西鼠尾、紫花浙皖丹參和三葉鼠尾草)(Kasiumu等人，1998)。產(chǎn)生丹酚酸之類化合物高次級代謝水平植物的方法業(yè)已公開。見美國專利號5869340(1999)。
(3,4-二羥基苯基)乳酸SM的主要組分是“丹參素”，化學(xué)上稱作β-3,4-二羥基苯基乳酸鈉(Fen等人，Acta Acad.Med.PrimaeShanghai 10:133-6(1983))；Zhao等人，Chin Pharm.J.29:291-93(1994))。它在細(xì)胞培養(yǎng)中是制備迷迭香酸的中間體化合物(A1-Sereiti等人《印度實(shí)驗(yàn)生物學(xué)雜志》(Indian J.Exp.Biol.)37:124-130(1999)；Bogucki等人《加拿大化學(xué)雜志》(Can.J.Chem.)75:1783-94(1997)；和美國專利號5011775)。
用抗病毒劑治療病毒介導(dǎo)的疾病可能相當(dāng)昂貴。例如，采用逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶抑制劑治療HIV-1每年耗費(fèi)每位患者約12000-20000美元。由于大多數(shù)HIV感染患者居住在發(fā)展中國家，須開發(fā)其他更經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的醫(yī)療方法用于治療HIV和其他病毒性疾病。本發(fā)明提供一種鑒定、制備和應(yīng)用新化合物的方法和用作抗病毒治療劑的組合物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及偶聯(lián)產(chǎn)物，其是丹酚酸和/或丹酚酸的脫氫形式的單體單元的均聚物或雜聚物，該偶聯(lián)產(chǎn)物具有約492或更高的分子量，或其含乙?；?、酯或酸酐衍生物，或其可藥用鹽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該偶聯(lián)產(chǎn)物是丹酚酸(Ⅰ)和/或丹酚酸脫氫形式(Ⅱ)或(Ⅲ)的單體單元的均聚物或雜聚物，該丹酚酸具有以下結(jié)構(gòu) 并且丹酚酸的脫氫形式具有以下結(jié)構(gòu) 其中R1、R2、R3、R4、R5和R6是氫或一個(gè)鍵，該均聚物或雜聚物的單體單元彼此通過R1、R2、R3、R4、R5和R6鍵合。
本發(fā)明還涉及一種制備抗病毒劑的方法，該方法包括將丹酚酸在堿性pH下保溫使均聚物或雜聚物形成，它們具有高于丹酚酸的抗病毒活性。
本發(fā)明的試劑具有抗病毒活性且可以在可藥用載體中全身或局部給藥。
圖2．實(shí)施例4的化合物6的三維圖示。
圖3．實(shí)施例4的化合物7的三維圖示。
圖4．實(shí)施例4的化合物8的三維圖示。
圖5．實(shí)施例4的化合物9的三維圖示。
圖6．實(shí)施例4的化合物10的三維圖示。
圖7．實(shí)施例4的化合物11的三維圖示。
圖8．實(shí)施例4的化合物12的三維圖示。
圖9．實(shí)施例4的化合物13的三維圖示。


圖10．實(shí)施例4的通過丹酚酸碳24和38脫氫生成的化合物2的三維圖示。
圖11．實(shí)施例4的通過丹酚酸碳24和35脫氫生成的化合物3的三維圖示。
圖12．實(shí)施例4的通過丹酚酸碳27和38脫氫生成的化合物4的三維圖示。
圖13．實(shí)施例4的化合物24的三維圖示。
發(fā)明詳述本發(fā)明利用另外的途徑來開發(fā)衍生自植物提取物的藥物，特別是鼠尾草屬植物的提取物。這些活性劑在多種不同的病毒(包括逆轉(zhuǎn)錄病毒)中抑制病毒整合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述活性劑抑制病毒基因組全部或部分整合在宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)。該活性劑還可以通過干擾病毒生活周期的其他位點(diǎn)抑制病毒感染、病毒增進(jìn)和/或病毒增殖。
鼠尾草屬(唇形科)含有約700種，它們位于世界的熱帶和溫帶地區(qū)，并且約300種是在亞洲、歐洲和非洲而400種位于美洲(J.C.Willis，《開花植物和蕨類植物辭典》(第7版，劍橋大學(xué)出版社，1966)；J.Briquet,Labiatae,DIE NATURLICHEN PFLANZENFAMILIEN第Ⅳ卷，3a,183-375(Engler & Prantl編輯，Englemann,Leipzig,1897))。本發(fā)明的抗病毒化合物和組合物可以衍生自任何鼠尾草屬的物種，但優(yōu)選來自SM和SY。A．定義術(shù)語“病毒抑制有效量”、“治療有效量”或“治療有效劑量”是指活性劑以該量向患有病毒性感染或病毒介導(dǎo)疾病的對象給藥時(shí)，所述感染或疾病被緩解，或感染被抑制的程度超過任何由活性劑引起的有害副作用。此類活性劑被認(rèn)為是“抗病毒劑”。
術(shù)語“病毒介導(dǎo)病癥”是指與病毒性感染有關(guān)的疾病表型。例如，AIDS相關(guān)綜合征(ARC)是與HIV-1感染有關(guān)的病癥。
術(shù)語“抗病毒活性”是指抑制或減輕病毒感染或與病毒感染有關(guān)病癥的能力。本發(fā)明具有抗病毒活性的化合物優(yōu)選以≤1μM的劑量抑制體外感染，或退一步體外優(yōu)選小于或等于約10mM。
術(shù)語“整合酶活性”是指整合酶蛋白或可以整合病毒基因組或病毒基因組片段進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中的蛋白。絕大多數(shù)整合酶蛋白與逆轉(zhuǎn)錄病毒科的成員有關(guān)。
術(shù)語“鼠尾草屬植物”是指唇形科鼠尾草屬的植物。優(yōu)選用于分離本發(fā)明化合物的鼠尾草植物是“丹參”或“SM”和“云南鼠尾草”“SY”。術(shù)語“偶聯(lián)衍生物”或“較大聚合物”是指包括二聚體、三聚體、四聚體等的活性劑，其中單體單元是如下部分之一 偶聯(lián)衍生物或較大聚合物可以是上述殘基的均聚二聚體、均聚三聚體、均聚四聚體等，或雜二聚體、雜三聚體、雜四聚體等。偶聯(lián)衍生物的一個(gè)例子是紫草酸鹽B，其是迷迭香酸的二聚體，而迷迭香酸是咖啡酸的二聚體。B．病毒治療或抑制任何對本發(fā)明抗病毒化合物和組合物產(chǎn)生反應(yīng)的病毒性感染都屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。優(yōu)選的病毒是下列病毒科肝炎病毒、皰疹病毒、正粘病毒、乳頭瘤病毒、副粘病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、多瘤病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。
逆轉(zhuǎn)錄病毒本發(fā)明的化合物和組合物優(yōu)選用于治療逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。雖然逆轉(zhuǎn)錄病毒屬于一個(gè)清楚限定的相對均一的病毒屬，但它們歷史上被再分為三種分類組，主要是基于感染的病理結(jié)果。腫瘤病毒亞組包括能夠在感染宿主中引起腫瘤性疾病的逆轉(zhuǎn)錄病毒，以及若干有關(guān)但顯然是良性的病毒。慢病毒引起緩慢、長期的疾病，其通常但不總是缺少腫瘤成分。慢病毒還有待與任何人體或動(dòng)物的疾病清楚地關(guān)聯(lián)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制是由病毒體核穿透胞質(zhì)內(nèi)引發(fā)的，它是一個(gè)由病毒包膜糖蛋白與特異性細(xì)胞表面受體的特定相互反應(yīng)所介導(dǎo)的過程。此后，與病毒體有關(guān)的依賴于RNA的DNA聚合酶將單鏈RNA基因組轉(zhuǎn)錄成雙鏈線性DNA原病毒中間體(逆轉(zhuǎn)錄)。整合蛋白(整合酶)特異性地識(shí)別病毒DNA的兩個(gè)末端并且從3，-末端脫去兩個(gè)核苷酸(3’-供體加工)。隨后經(jīng)加工的病毒DNA和整合酶遷移至核中，其中病毒整合酶使逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組共價(jià)連接在宿主染色體DNA上(鏈轉(zhuǎn)移)，由此形成逆轉(zhuǎn)錄原病毒。
作為重要的人體致病原，I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的出現(xiàn)提高了對逆轉(zhuǎn)錄病毒的科研興趣。特別是，有證據(jù)表明，上述單一生活周期不能完全描述所有逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制周期。例如，HIV-1除了特征逆轉(zhuǎn)錄病毒Gag、Pol和Env以外編碼不少于6個(gè)基因產(chǎn)物；這些翻譯自一組新的單剪接和多剪接病毒mRNA種類。這些附加蛋白中的至少兩種(稱作Tat和Rev)以反式直接作用于調(diào)節(jié)HIV-1基因的表達(dá)。所以，穿透和原病毒整合之間的步驟對于MLV(鼠科白血病病毒)和HIV-1兩者似乎相當(dāng)類似，但發(fā)現(xiàn)整合后事件在后者中明顯更加復(fù)雜。目前，已清楚HIV-1僅僅是動(dòng)物逆轉(zhuǎn)錄病毒這一大類型中的一種，這一大類目前稱作“復(fù)合”逆轉(zhuǎn)錄病毒。屬于這種復(fù)合逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括所有慢病毒，泡沫病毒，以及HTLV-1和有關(guān)病毒(表1)。
表1逆轉(zhuǎn)錄病毒中的主要分類
縮寫RSV，魯斯氏肉瘤病毒；ALV，鳥白血病病毒；ASV，鳥肉瘤病毒；FeLV，貓白血病病毒；MSV，鼠科肉瘤病毒；SNV，脾壞死病毒；REV，網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒；SSV，猿猴肉瘤病毒；MMTV，小鼠乳腺瘤病毒；MPMV,Mason-Pfizer猴病毒；SRV-1,Ⅰ型猿猴逆轉(zhuǎn)錄病毒；STLV，猿猴T細(xì)胞白血病病毒；BFV，牛泡沫病毒。
參與原病毒整合的步驟對于單純和復(fù)合逆轉(zhuǎn)錄病毒而言相當(dāng)類似。因?yàn)檫@種機(jī)理上的共同特性，逆轉(zhuǎn)錄病毒整合酶的抑制劑將抑制多種生物如人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、貓白血病病毒(FeLV)、鼠科白血病病毒(MuLV)、魯斯氏肉瘤病毒(RSV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、人T細(xì)胞白血病病毒(HTLV)。除了這些逆轉(zhuǎn)錄病毒以外，本發(fā)明的活性劑可能用作抗整合酶樣蛋白的抑制劑用于抑制其他病毒如乙型肝炎病毒(HBV)的復(fù)制。
其他病毒還可以考慮將本發(fā)明的活性劑用作治療由例如肝炎病毒、皰疹病毒、正粘病毒、乳頭瘤病毒、副粘病毒、細(xì)小核糖核酸病毒和多瘤病毒引起的病毒性感染。優(yōu)選用本發(fā)明的活性劑治療的病毒包括下表中所列的那些
表2
參見《基礎(chǔ)病毒學(xué)》(Bernard N.Fields等人編輯，1991)。C．化合物的制備方法下文實(shí)施例1中描述了由含有活性劑的鼠尾草屬物種，更優(yōu)選由SM和SY制備植物提取物的一般條件。所述化合物可以如下文合成制得。通過在0.1％NH4OH中將濃度為5mg/ml的各個(gè)化合物保溫24小時(shí)可生成含有β-(3,4-二羥基苯基)乳酸或丹酚酸和/或咖啡酸部分的不同化合物。這些包括丹酚酸的脫氫形式，偶聯(lián)二聚體和較大的聚合物。時(shí)間優(yōu)選是3-24小時(shí)。在0.1％NH4OH中保溫時(shí)間超過48小時(shí)可能導(dǎo)致化合物的失活?；罨瘯r(shí)間還取決于化合物的起始濃度。高濃度的化合物將需要較長的活化保溫時(shí)間。這種形成反應(yīng)也可以通過用其它堿性試劑將溶液中化合物的pH調(diào)節(jié)為大于pH=8來實(shí)現(xiàn)。通過加入酸(如1％乙酸)終止該反應(yīng)，由此所得溶液的pH小于或等于7。其它可影響新化合物形成的因素是溫度和氧合作用。D．藥物組合物及其給藥為了治療或醫(yī)治病毒性感染，本發(fā)明的化合物可以以含有常規(guī)無毒可藥用載體、輔劑和賦形劑的劑量單位制劑經(jīng)口服、局部、非腸道、吸入噴霧或直腸給藥。此處所用術(shù)語“非腸道”包括皮下注射，靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、血管內(nèi)注射或輸注技術(shù)。除了治療溫血?jiǎng)游锶缧∈蟆⒋笫?、馬、牛、綿羊、狗、貓等，本發(fā)明的化合物和組合物可有效治療人類對象中的病毒性感染。
為了向中樞神經(jīng)系統(tǒng)給藥，組合物可以給藥至腦脊液中。為了鞘內(nèi)給藥，非腸道給藥的載體，特別是如存在于水中的葡萄糖或鹽水載體是適用的。組合物還可以制備為脂質(zhì)體以加強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過膜屏障。組合物也可被制成貼劑用于經(jīng)皮給藥。疏水性化合物給藥所用的溶劑也適用于此目的，例如DMSO或可穿透皮膚屏障的油。
為了非腸道給藥，可以制備本發(fā)明治療性化合物的溶液，例如采用芝麻油或花生油或丙二醇水溶液。如果必要，應(yīng)適當(dāng)緩沖水溶液(優(yōu)選pH大于8)，并且液態(tài)稀釋劑首先要等滲。此類水溶液適合于靜脈內(nèi)注射。油性溶液適合關(guān)節(jié)內(nèi)、肌肉內(nèi)和皮下注射。通過所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)制藥技術(shù)很容易實(shí)施所有這些溶液在無菌條件下的制備。
含有活性成分的藥物組合物可以是適合口服的形式，例如片劑、含片、錠劑、水或油混懸液、可分散粉末或顆粒劑、乳液、硬或軟膠囊、糖漿劑或酏劑。用于口服的組合物可以根據(jù)任何制備藥物組合物的已知方法制備，并且此類組合物可以含有一種或多種選自如下的試劑甜味劑、矯味劑、著色劑和防腐劑，從而提供藥學(xué)上適口的制劑。片劑可以含有與適合制備片劑的無毒可藥用賦形劑混合的活性成分。
為了口服給藥，含有多種賦形劑如微晶纖維素、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸二鈣和甘氨酸的片劑可以與多種崩解劑合用，如淀粉(并且優(yōu)選玉米、馬鈴薯或木薯淀粉)、藻酸和某些復(fù)合硅酸鹽，同時(shí)結(jié)合制粒粘合劑如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明膠和阿拉伯膠。此外，潤滑劑如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉和滑石粉常用于制片。類似的固體組合物也可以在明膠膠囊中用作填充劑；優(yōu)選的材料還包括乳糖或奶糖，以及高分子量聚乙二醇。當(dāng)需要水混懸液和/或酏劑用于口服給藥時(shí)，活性化合物或化合物的混合物可以與不同的甜味劑或矯味劑、著色物或染料合用，并且如果必要，還可與乳化劑和/或助懸劑以及稀釋劑如水、乙醇、丙二醇、甘油及其不同的組合合用。口服制劑也可以以硬明膠膠囊提供，其中活性成分與惰性固體稀釋劑混合，如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土；或以軟明膠膠囊提供，其中活性成分與水或油性介質(zhì)混合，如花生油、液體石蠟或橄欖油。
所述賦形劑可為例如惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣、磷酸鈉；制粒崩解劑，如玉米淀粉或藻酸；粘合劑，如淀粉、明膠或阿拉伯膠；和潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可以未包衣，或可以通過已知技術(shù)包衣以延遲在胃腸道中的崩解和吸收，并由此在較長時(shí)間內(nèi)提供緩釋作用。例如，可采用時(shí)間延遲材料如甘油一硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。也可以通過美國專利號4256108、4166452和4265874中所述的技術(shù)包衣形成控釋或延遲的滲透治療片劑。
水混懸液可以含有與適合制備水混懸液的賦形劑混合的活性物質(zhì)。所述賦形劑包括助懸劑，如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠和阿拉伯膠；分散或濕潤劑可以是天然磷脂，如卵磷脂，或氧化烯與脂肪酸的縮合產(chǎn)物，如聚氧乙烯硬脂酸酯；或氧化乙烯與長鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物，如十七亞乙氧基鯨蠟醇；或氧化乙烯與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物，如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯；或氧化乙烯與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物，如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單硬脂酸。所述水混懸液也可以含有一種或多種防腐劑，例如對羥基苯甲酸乙酯或正丙酯。
通過將活性成分懸浮在植物油(如花生油、橄欖油、芝麻油或椰油)或礦物油(如液體石蠟)中可制得油性混懸液。油性混懸液可以含有增稠劑，如蜂蠟、固體石蠟或鯨蠟醇。通過加入抗氧劑如抗壞血酸保存這些組合物。
可分散粉末和顆粒劑通過與水混合適合制備為水混懸液。這些組合物可以提供與分散或濕潤劑、助懸劑和一種或多種防腐劑混合在一起的活性成分。適用的分散或濕潤劑和助懸劑是如上文所例舉的那些。
本發(fā)明的藥物組合物也可以是水包油乳液形式。油相可以是植物油，例如橄欖油或花生油；礦物油，例如液體石蠟；或它們混合物。適用的乳化劑可以是天然樹膠，例如阿拉伯膠或黃蓍膠；天然磷脂，如大豆、卵磷脂；和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如脫水山梨糖醇一硬脂酸酯)；和該偏酯與氧化乙烯的縮合產(chǎn)物(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇一硬脂酸酯)。
除其他本領(lǐng)域已知的方法外，含有本發(fā)明藥物組合物的軟膏通過將活性成分與介質(zhì)(由二元醇、低級烷醇和水組成)、膠凝劑和任選的輔劑(如己二酸二異丙酯、癸二酸(sevacate)二乙酯、己酸(carproate)乙酯和月桂酸乙酯)混合制得。適當(dāng)?shù)亩及ū?、丁二醇、聚乙二醇等。通常，用有機(jī)胺(如二異丙基胺和三乙胺)預(yù)中和的羧乙烯基聚合物或纖維素(例如羥乙基纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素)用作膠凝劑。
本發(fā)明的化合物和組合物也可以以栓劑的形式經(jīng)直腸給藥。這些組合物可以通過將藥物與適當(dāng)?shù)臒o刺激賦形劑混合制得，該賦形劑在常溫(如室溫)下為固體但在直腸溫度下為液體并且由此在直腸內(nèi)熔融釋放出藥物。適用的材料是可可脂和聚乙二醇類。
可以和載體物質(zhì)混合以產(chǎn)生單一劑量的活性化合物或化合物混合物的量取決于被治療的宿主和給藥的具體方式。單位劑量通常含有約25mg至約1g的活性成分。活性成分的日劑量一般是在口服時(shí)為約1至約300mg/kg體重并且在常規(guī)注射給藥時(shí)為約0.1至100mg/kg體重。藥量可以一次給予或分二或多個(gè)等份在1天中給藥。但應(yīng)理解，對于任一特定患者或?qū)ο蟮奶囟▌┝克綉?yīng)取決于多種因素，包括所用特定化合物的活性、被治療對象的年齡、體重、一般健康狀態(tài)、性別、飲食、給藥時(shí)間、給藥途徑、排泄速率、合用藥物、病毒感染的時(shí)間和被治療的特定病毒感染的嚴(yán)重性。
本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)或與可藥用載體或稀釋劑組合在一起、通過任何有效途徑給藥，優(yōu)選上述三種途徑中的一種給藥途徑。給藥可以以單劑量或多劑量進(jìn)行。具體而言，本發(fā)明的新的治療劑可以以多種不同的劑型給藥，即，它們可以與多種可藥用惰性載體混合成為片劑、膠囊、錠劑、含片、硬糖、散劑、噴霧劑、霜?jiǎng)?、油膏劑、栓劑、膠凍、凝膠、糊劑、洗劑、軟膏、水懸液、注射液、酏劑、糖漿劑等，如上文所述。
下文提供的實(shí)施例僅供舉例說明本發(fā)明的某些實(shí)施方案并不對本發(fā)明構(gòu)成限定。
實(shí)施例1從SM和SY提取抗病毒劑SM和SY的植物提取物制備如下步驟1干燥的SY在Milli-Q蒸餾水(dH2O)(18.0mOhm/cm)中煮沸且濃縮為終密度為1.30g/ml。隨后用dH2O 1∶5稀釋該提取物，在GS-3轉(zhuǎn)子中以8000rpm在25℃下離心90分鐘。棄去沉淀，保留上清液。向該上清液中加入十分之一體積的1.0N HCl溶液使HCl的終濃度為0.1N。將此上清液在25℃下保溫過夜。該溶液在GS-3轉(zhuǎn)子中以8000rpm在25℃下離心90分鐘，所得沉淀用95％乙醇洗滌，隨后經(jīng)0.2μm過濾系統(tǒng)過濾。重復(fù)該操作直至洗滌溶液變澄清。隨后室溫下令沉淀在過濾部件中干燥，隨后在70℃的烘箱中保溫過夜。將粉末以沉淀與水1∶5的比例重新懸浮在dH2O中，所得產(chǎn)物在Ti45轉(zhuǎn)子中以25000rpm在25℃下離心30分鐘。棄去上清，所得沉淀重懸在50％乙醇中。另外，上清液也可以重懸在50％甲醇中。
步驟2將重懸液過濾除去不溶物。
步驟3將濾液濃縮至原體積的五分之一(1/5)形成沉淀。沉淀用蒸餾水洗滌。隨后將洗滌的沉淀冷凍干燥過夜。干燥、洗滌后的沉淀稱作部分1。
步驟4將由步驟3獲得的干燥粉末溶解在50％甲醇中。將該溶液離心除去任何不溶物。將上清液加載在用蒸餾水平衡的SephadexLH-20柱上。用大量蒸餾水沖洗該柱且以下列順序的溶液洗脫含15％甲醇的水(v/v)，含30％甲醇和1％醋酸的水(v/v)，含40％甲醇的水(v/v)，含50％甲醇的水(v/v),75％甲醇的水(v/v)，和100％甲醇。所用溶液的順序取決于起始溶液。濃縮用50％甲醇水溶液洗脫出的流分且加載在HPLC反相柱(Ultrasphere ODS,4.6×250mm,5μM)上，其用10％甲醇和0.1％甲酸平衡。該柱利用10％甲醇/0.1％甲酸和100％甲醇/0.1％甲酸的25分鐘梯度以1ml/min洗脫。通過在275nm監(jiān)測吸收度來檢測化合物。
步驟5通過質(zhì)譜法分析由HPLC反相柱洗脫出的各流分的分子量。質(zhì)譜鑒定出下列化合物MW化合物1 180 啡酸(#1)2 198 D-(3,4-二羥基苯基)乳酸(#2)3 359迷迭香酸(#3)4 387 迷迭香酸的鹽形式(Yunnaneic acid C和Yunnaneic acid D)5 494 2-(3,4-二羥基苯基乙烯基)咖啡酸(#5)或丹酚酸7 717紫草酸B(#7)8 739 紫草酸鎂B(#8)9 853迷迭香酸和2-(3,4-二羥基苯基乙烯基)咖啡酸的組合(#9)10 987 MW為987的#5的二聚體(#10)，如下文實(shí)施例4所述這些化合物的結(jié)構(gòu)式如下
Yunnaneic Acid C
Yunnaneic Acid D 實(shí)施例2抗病毒試驗(yàn)病毒抑制的功效體外HIV-1整合酶試驗(yàn)已研制出用于監(jiān)測HIV-1整合酶活性的體外試驗(yàn)，如下文所述。這些試驗(yàn)利用純化的重組HIV-1整合酶和代表病毒DNA的LTR末端的寡核苷酸底物。體外試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)的重要作用在于試驗(yàn)反映了體內(nèi)發(fā)生的實(shí)際功能活動(dòng)。已開發(fā)出熒光分析(Lee等人，《分析生物化學(xué)》227:295-301(1995))和放射性試驗(yàn)用來改進(jìn)上述公開的體外試驗(yàn)(Lee等人《生物化學(xué)》34:10205-10214(1995)；Lee等人《生物化學(xué)》34:10215-10223(1995))。此外，我們改進(jìn)了酶制劑，它提高了HIV-1整合酶樣本的質(zhì)量(Lee & Han，《生物化學(xué)》35:3837-3844(1996)；Lee等人，《生物化學(xué)》36:173-180(1997))。體外試驗(yàn)和樣本制劑的上述改進(jìn)已經(jīng)能夠更好地反映出體內(nèi)發(fā)生的活動(dòng)。因此，當(dāng)尋找有效整合酶抑制劑時(shí)，該體外試驗(yàn)的結(jié)果是極其有效的病毒傳染性的預(yù)示變量。
部分1在抑制HIV-1整合酶中的活性測定如下。首先將部分1溶解在適當(dāng)體積的0.1％NH4OH(w/v)使終濃度為15mg/ml。隨后將這些樣本以10000rpm離心30分鐘。如果形成沉淀，分離出上清液；干燥沉淀且進(jìn)一步溶解在0.1％NH4OH(w/v)中。所得溶液是提取物的儲(chǔ)備液。由此儲(chǔ)備液，進(jìn)行以下的稀釋1∶10,1∶50,1∶100,1∶200,1∶300,1∶400,1∶500,1∶600,1∶700,1∶800,1∶900,1∶1000,1∶2000,1∶3000,1∶4000,1∶5000和1∶10000。將各種這些稀釋液的1μl分別加入各反應(yīng)混合物中，它們的終濃度分別相應(yīng)為75,15,7.5,3.75,2.5,1.875,1.5,1.25,1.07,0.9375,0.833,0.75,0.375,0.25,0.1875,0.15和0.075μg/ml。隨后按已述方法進(jìn)行試驗(yàn)(Lee，《生物化學(xué)》34:10205-10214(1995)；Lee等人，《生物化學(xué)》34:10215-10233(1995)；Lee ＆ Han(1996))。
為了測定各部分的IC50和IC90，將凝膠暴露于PHOSPHORIMAGERTM屏并且通過分子動(dòng)力學(xué)PHOSPHORIMAGERTM測定裂解百分比。通過由陽性對照的裂解百分比減去各部分的裂解百分比并且隨后將該值除以陽性對照的裂解百分比可測出抑制百分率。結(jié)果證實(shí)部分1在培養(yǎng)基中具有0.2-1.2μg/ml的IC50和2.5-3.5μg/ml的IC90。所以，在活哺乳動(dòng)物中，血濃度高達(dá)約100X，該水平可被耐受和有效。
實(shí)施例3SM提取物的體外試驗(yàn)貓免疫缺陷病毒(FIV)模型是一種被接受的動(dòng)物模型，用于研究抗HIV感染的藥物。FIV是分離自貓的T細(xì)胞營養(yǎng)性慢病毒。FIV在生物學(xué)上和生物化學(xué)上類似于HIV，包括FIV和HIV整合酶間的高同源性。FIV感染的貓會(huì)患貓獲得性免疫缺陷綜合征(FAIDS)，其類似于人體中的成熟AIDS。
細(xì)胞培養(yǎng)中的體外FIV模型Crandell-Reese貓腎(CrFK)細(xì)胞系對FIV感染敏感且支持病毒復(fù)制。CrFK細(xì)胞是生產(chǎn)病毒和分析FIV感染的有效工具。雖然FIV不導(dǎo)致FIV感染的CrFK細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，但已有篩選組織培養(yǎng)物中的FIV感染的診斷試驗(yàn)。研究證實(shí)了SY的功效。
ED50的測定對部分1保護(hù)CrFK細(xì)胞不被FIV感染的作用進(jìn)行試驗(yàn)。以一式三份，將CrFK細(xì)胞鋪板，密度為1×105細(xì)胞/T25瓶。隨后培養(yǎng)24小時(shí)使細(xì)胞附著并且生長，將化合物的溶液加入細(xì)胞培養(yǎng)物中24小時(shí)。該溶液是通過將本發(fā)明的活性劑溶解在磷酸鹽緩沖液(pH8)中使?jié)舛葹?00mg/ml來制備，隨后25℃下在Ti45轉(zhuǎn)子中以25000rpm離心30分鐘。除去上清液，在開式真空下通過離心將三份1ml等份試樣干燥用于測定溶液的濃度。將活性劑進(jìn)一步稀釋為2mg/ml，經(jīng)0.2μm醋酸纖維膜過濾，通過測定干燥溶質(zhì)的質(zhì)量與標(biāo)定對照對比來測出濃度。
結(jié)果證實(shí)，部分1防止CrFK細(xì)胞的FIV感染的ED50為0.1至1.0μg/ml；ED90為0.2至2.5μg/ml。通過這些結(jié)果，本發(fā)明的組合物可以在可藥用載體中給藥并且應(yīng)以足夠的劑量給藥以使血藥濃度為10nM至1000nM。然而，在一些情況下必須施用獲得高達(dá)10000nM的血藥濃度的劑量?；钚愿叩乃巹┛梢栽诘椭?nM的血藥濃度下有效。
實(shí)施例4丹酚酸的偶聯(lián)在堿性條件下，丹酚酸(化合物1)可以產(chǎn)生另外三種脫氫形式(化合物2-4)。丹酚酸及其衍生物(丹酚酸的脫氫形式)偶聯(lián)為二聚體形式導(dǎo)致形成若干種結(jié)構(gòu)如下的化合物。這些偶聯(lián)是丹酚酸與其脫氫形式的均聚二聚體和/或雜二聚體。這些化合物在小于1μg/ml的濃度下顯示出抗HIV-1整合酶活性。
丹酚酸的基本結(jié)構(gòu)(化合物1)為(如下所示) A、B、C和D分別代表化合物1的碳24、27、35和38上的氫。這些氫是偶聯(lián)的潛在位點(diǎn)。所以，丹酚酸與其自身(化合物1)的偶聯(lián)，即均聚二聚體導(dǎo)致下列組合的形成(化合物5-13)化合物5是A與A偶聯(lián)(圖1)；化合物6是A與B偶聯(lián)(圖2)；化合物7是A與C偶聯(lián)(圖3)；化合物8是A與D偶聯(lián)(圖4)；化合物9是B與B偶聯(lián)(圖5)；化合物10是B與C偶聯(lián)(圖6)；化合物11是C與C偶聯(lián)(圖7)；化合物12是C與D偶聯(lián)(圖8)；化合物13是D與D偶聯(lián)(圖9)；化合物24是化合物1的B與化合物1的D偶聯(lián)(圖13)。
在碳24和38、碳24和35及碳27和38上脫氫可形成丹酚酸的三種脫氫形式(化合物2-4)。這些形式具有如下基本結(jié)構(gòu)化合物2,24-38(圖10) 化合物3,24-35(圖11) E代表偶聯(lián)位點(diǎn)?；衔?,27-38(圖12) F代表偶聯(lián)的位點(diǎn)。
丹酚酸的脫氫形式(化合物2-4)可以形成均聚二聚體。這意味著化合物3可以與其自身在位點(diǎn)E偶聯(lián)形成化合物14，并且化合物4與其自身在位點(diǎn)F偶聯(lián)形成化合物15。
這些脫氫形式也可以與丹酚酸形成雜聚二聚體。形成的潛在雜聚二聚體是化合物1的A與化合物3的E偶聯(lián)形成化合物16；化合物1的B與化合物3的E偶聯(lián)形成化合物17；化合物1的C與化合物3的E偶聯(lián)形成化合物18；化合物1的D與化合物3的E偶聯(lián)形成化合物19；化合物4的F與化合物1的A形成化合物20；化合物4的F與化合物1的B偶聯(lián)形成化合物21；化合物4的F與化合物1的C偶聯(lián)形成化合物22；和化合物4的F與化合物1的D偶聯(lián)形成化合物23。
除了這些二聚體，可以形成此類的三聚體和更高聚合物。這些化合物結(jié)構(gòu)中的變化應(yīng)為所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知。
可以預(yù)見，這些化合物可被修飾為含有乙?；?、成為該化合物的酯類、酚酐或可藥用鹽。
實(shí)施例5偶聯(lián)所致的抗整合酶活性的時(shí)間依賴性活化實(shí)施例4的化合物1被純化并且利用質(zhì)譜和NMR確認(rèn)。隨后化合物1與0.1％NH4OH在濃度5mg/ml下保溫不同的時(shí)間(5分鐘，30分鐘，1小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)，4小時(shí)，5小時(shí)和24小時(shí))。加入1％乙酸終止該反應(yīng)并且測定抗HIV-1整合酶活性。結(jié)果證明經(jīng)在0.1％NH4OH中保溫，樣品被時(shí)間依賴性地活化。這種活化作用是化合物1的不同偶聯(lián)物的結(jié)果。結(jié)果如表3所示表3
將MW為492的純化化合物(例如化合物2-4，如上所述)與0.1％NH4OH在濃度5.0mg/ml下保溫不同的時(shí)間(5分鐘，30分鐘，1小時(shí)，1.5小時(shí)，2.0小時(shí)和3.0小時(shí))。加入1％乙酸終止該反應(yīng)并且測定抗HIV-1整合酶活性。結(jié)果證明經(jīng)在0.1％NH4OH中保溫，化合物2-4被時(shí)間依賴性地活化。但這種活化作用不如化合物1的偶聯(lián)物那么大。結(jié)果如表4所示表4
實(shí)施例6活化化合物1的抗HIV-1整合酶活性將0.8g的實(shí)施例4的化合物1在80ml的0.1％NH4OH中以終濃度10mg/ml保溫8小時(shí)。此活化樣品隨后加載在SEPHADEXLH20柱上并用濃度遞增的甲醇水溶液洗脫。將洗脫流分冷凍干燥且分析抗HIV-1整合酶活性。結(jié)果如表5所示表5
50％的樣本具有最佳活性，隨后利用質(zhì)譜分析。質(zhì)譜顯示出492和986的兩個(gè)主峰。這些峰與丹酚酸的單體和丹酚酸的二聚體相對應(yīng)，這表明這些物質(zhì)是活性的抗病毒成分。所以，這些結(jié)果顯示，產(chǎn)生整合酶抑制作用的活性抗病毒劑是丹酚酸和/或其二聚體形式。
這些流分的抗HIV-1感染活性的功效采用CEMTART細(xì)胞評定。這些細(xì)胞是對CEM按照實(shí)施例8中所述進(jìn)行工程化。采用如實(shí)施例8中所述的HIVp24抗原捕獲試驗(yàn)。結(jié)果在下表6中所示表6
實(shí)施例7抗HIV-1整合酶活性將實(shí)施例1的部分1溶解在40％甲醇(水中)中并且在GSA轉(zhuǎn)子中以8000rpm離心30分鐘。將上清液部分加載在用40％甲醇(水中)平衡的SEPHADEXLH20柱上。該柱用40％甲醇溶液(水中)沖洗并且用50％、60％、70％、80％和90％的甲醇溶液(水中)洗脫。隨后將樣本冷凍干燥并且溶解在適當(dāng)體積的甲醇中以使最終的儲(chǔ)備濃度為5mg/ml。這些流分用于測定抗HIV-1整合酶活性。試驗(yàn)濃度為5,2.5,2,1.5,1.25,1,0.8,0.6,0.4和0.2μg/ml。通過由陽性對照的裂解百分比減去各流分的裂解百分比并且隨后將該值除以陽性對照的裂解百分比可得出抑制百分率。
表7體外HIV-1整合酶活性試驗(yàn)的結(jié)果
將SEPHADEXLH20柱60-80％的流分合并且溶解在40％甲醇水溶液中。將重懸樣本在GSA轉(zhuǎn)子中以8000rpm離心30分鐘。將上清液加載在用水中的40％甲醇平衡的MCI GEL CHP20P(75-150μ)柱上。該柱用40％甲醇溶液(水中)沖洗并且用50、60和70％的甲醇溶液(水中)洗脫。隨后將樣本冷凍干燥且按照上述方法在不同條件下分析。
表8體外HIV-1整合酶活性試驗(yàn)的結(jié)果
隨后通過質(zhì)譜法(負(fù)離子模式)分析MCI GEL CHP20P(75-150μ)樣品。結(jié)果顯示，MCI 40具有986的主峰和494的次峰。MCI 50具有492和986的主峰。MCI60具有984和986的主峰。通過質(zhì)譜和NMR測定可肯定494峰代表丹酚酸。492峰代表丹酚酸的脫氫形式。986峰代表丹酚酸的二聚體形式。984峰代表492和494的混合二聚體。這結(jié)果表明，部分1的活性成分是分子量為984和/或986的化合物。這些試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，分子量為984和986的二聚體化合物由化合物1生成。
實(shí)施例8活性劑的抗HIV-1活性試驗(yàn)用CEＭTART細(xì)胞評估MCI GEL CHP20P(75-150a)流分的抗HIV-1感染活性。這些細(xì)胞由CEM細(xì)胞通過基因工程獲得且在組成性地表達(dá)HIV-1tat和rev基因。CEMTART細(xì)胞提供了評價(jià)HIV感染的安全體系，因它們被基因工程化來生產(chǎn)HIV-1的復(fù)制不能形式，HIVΔtat/rev。利用HIV p24抗原捕獲試驗(yàn)評估化合物抑制HIV-1感染的功效。該試驗(yàn)采用p24核心蛋白單克隆抗體包被的96孔平板，其中將細(xì)胞培養(yǎng)基或血清培養(yǎng)2小時(shí)。在用HIVΔtat/rev感染至少1周后從細(xì)胞除去上清液。沖洗孔，隨后加入生物素化抗HIV-1 p24多克隆抗體。加入信號擴(kuò)增底物后，相對于已知標(biāo)準(zhǔn)直接定量p24的表達(dá)。
將MCI 40、50和60溶解在甲醇中，并且以下列濃度評定這些化合物抑制HIV-1感染的性能100,20,10,5和1μg/ml。向24孔組織培養(yǎng)皿中加入2ml的3.33×104CEMTART細(xì)胞和試驗(yàn)濃度的化合物。向其中加入5000 TCID50/106細(xì)胞的HIV-1接種物。每周更換2次培養(yǎng)基，以使0.8ml的細(xì)胞混懸液重新懸浮在2ml的更換培養(yǎng)基中。隨后在p24存在下分析無細(xì)胞上清液。7天和10天后通過對比藥物存在或不存在下的HIV-1 p24抗原生產(chǎn)來評定抗HIV-1功效。結(jié)果如表9和10所示表9第7天
表10第10天
上述所有參考文獻(xiàn)在此引入作為參考。還引入母專利申請美國申請?zhí)?9/104363(提交于1998.6.25)作為參考。
權(quán)利要求
1．一種通過施用組合物治療或預(yù)防病毒性感染的方法，所示組合物含有抑制病毒有效量的至少一種具有至少一個(gè)下式部分的活性劑 其中R1是-OH、-O-和一個(gè)鍵；R2是-H或一個(gè)鍵；R3是-OH或-O-；R4是一個(gè)鍵或 其中R5是-OH或一個(gè)鍵；R6是-H或一個(gè)鍵；并且R7是-H或一個(gè)鍵；該活性劑具有190道爾頓以上的分子量。
2．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述活性劑具有至少一個(gè)下式的部分 和至少一個(gè)下式的部分
3．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述活性劑是所述部分的二聚體、三聚體、四聚體或更大聚合物。
4．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述活性劑選自D-(2,3-二羥基苯基)乳酸，迷迭香酸，2-(3,4-二羥基苯基乙烯基)咖啡酸、紫草酸B、紫草酸鎂B、2-(3,4-二羥基苯基乙烯基)咖啡酸的二聚體，或
5．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒感染是由肝炎病毒、正粘病毒、乳頭瘤病毒、副粘病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、多瘤病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒引起。
6．按照權(quán)利要求5的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒是HIV或FIV。
7．按照權(quán)利要求5的方法，其中病毒感染是由產(chǎn)生整合酶或具有整合酶活性的蛋白的病毒引起。
8．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物經(jīng)鼻、經(jīng)口、透皮、非腸道、鞘內(nèi)的或靜脈內(nèi)給藥。
9．一種通過給治療對象施用組合物來治療或預(yù)防其病毒性感染的方法，所述組合物含有病毒抑制有效量的兩種或多種活性劑，且所述活性劑至少兩種含有至少下式之一 其中R1是-OH、-O-或一個(gè)鍵；R2是-H或一個(gè)鍵；R3是-OH或-O-；R4是一個(gè)鍵或 其中R5是-OH或一個(gè)鍵；R6是-H或一個(gè)鍵；并且R7是-H或一個(gè)鍵；所述活性劑具有190道爾頓以上的分子量。
10．按照權(quán)利要求9的方法，其中所述活性劑是所述部分的二聚體、三聚體、四聚體或更大聚合物。
11．按照權(quán)利要求9的方法，其中所述活性劑選自D-(2,3-二羥基苯基)乳酸，迷迭香酸，2-(3,4-二羥基苯基乙烯基)咖啡酸、紫草酸B、紫草酸鎂B、2-(3,4-二羥基苯基乙烯基)咖啡酸的二聚體，或
12．按照權(quán)利要求9的方法，其中所述病毒感染是由肝炎病毒、正粘病毒、乳頭瘤病毒、副粘病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、多瘤病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒引起。
13．按照權(quán)利要求12的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒是HIV或FIV。
14．按照權(quán)利要求12的方法，其中病毒感染是由產(chǎn)生整合酶或具有整合酶活性的蛋白的病毒引起。
15．按照權(quán)利要求9的方法，其中所述組合物經(jīng)鼻、經(jīng)口、透皮、非腸道、鞘內(nèi)的或靜脈內(nèi)給藥。
16．一種含有兩種或多種活性劑的抗病毒組合物，其中所述活性劑含有至少一個(gè)下式部分 其中R1是-OH、-O-或一個(gè)鍵；R2是-H或一個(gè)鍵；R3是-OH或-O-；R4是一個(gè)鍵或 其中R5是-OH或一個(gè)鍵；R6是-H或一個(gè)鍵；并且R7是-H或一個(gè)鍵；所述活性劑具有190道爾頓以上的分子量；其中該組合物在施用給需要它的對象時(shí)能夠抑制病毒性感染。
17．一種從鼠尾草屬植物鑒定抗病毒劑的方法，該方法包括步驟(a)由含有下式部分之一或所述部分的偶聯(lián)物的植物提取活性劑 其中R1是-OH、-O-或一個(gè)鍵；R2是-H或一個(gè)鍵；R3是-OH或-O-；R4 是一個(gè)鍵或 其中R5是-OH或一個(gè)鍵；R6是-H或一個(gè)鍵；并且R7是-H或一個(gè)鍵；和(b)將所述第一活性劑與含有與第一活性劑不同的部分或偶聯(lián)物的第二活性劑合并；和(c)分析該第一活性劑和該第二活性劑的混合物的抗病毒活性。
18．一種偶聯(lián)產(chǎn)物，其是丹酚酸和/或丹酚酸的脫氫形式的單體單元的均聚物或雜聚物，所述偶聯(lián)物具有等于或大于約492的分子量，或其含乙?；苌?、其酯、或酸酐衍生物，或其可藥用鹽。
19．按照權(quán)利要求18的偶聯(lián)產(chǎn)物，其具有約492至約986的分子量。
20．按照權(quán)利要求19的偶聯(lián)產(chǎn)物，其具有約492的分子量。
21．按照權(quán)利要求19的偶聯(lián)產(chǎn)物，其具有約984的分子量。
22．按照權(quán)利要求19的偶聯(lián)產(chǎn)物，其具有約986的分子量。
23．按照權(quán)利要求19的偶聯(lián)產(chǎn)物，其是丹酚酸和/或丹酚酸的脫氫形式Ⅱ或Ⅲ的單體單元的均聚物或雜聚物，所述丹酚酸具有結(jié)構(gòu)(Ⅰ) 所述丹酚酸的脫氫形式具有如下結(jié)構(gòu) 其中R1、R2、R3、R4、R5和R6是氫或一個(gè)鍵，并且該均聚物和雜聚物的單體單元彼此通過R1、R2、R3、R4、R5和R6鍵合。
24．權(quán)利要求23的偶聯(lián)產(chǎn)物，其是均聚二聚體。
25．權(quán)利要求24的偶聯(lián)產(chǎn)物，其中所述單體單元通過R1-R1、R2-R2、R3-R3、R4-R4、R5-R5或R6-R6鍵鍵合在一起。
26．權(quán)利要求24的偶聯(lián)產(chǎn)物，其中所述單體單元通過R1-R2、R1-R3、R1-R4、R2-R3、R2-R4或R3-R4鍵鍵合在一起。
27．權(quán)利要求23的偶聯(lián)產(chǎn)物，其是雜聚二聚體。
28．權(quán)利要求27的偶聯(lián)產(chǎn)物，其中所述單體單元通過R1-R5、R2-R5、R3-R5或R4-R5鍵鍵合在一起。
29．權(quán)利要求27的偶聯(lián)產(chǎn)物，其中所述單體單元通過R1-R6、R2-R6、R3-R6、R4-R6或R5-R6鍵鍵合在一起。
30．權(quán)利要求18的偶聯(lián)產(chǎn)物，其是均聚三聚體。
31．權(quán)利要求18的偶聯(lián)產(chǎn)物，其是雜聚三聚體。
32．權(quán)利要求18的偶聯(lián)產(chǎn)物，其是4個(gè)或更多個(gè)單體單元的均聚聚合物。
33．權(quán)利要求18的偶聯(lián)產(chǎn)物，其是4個(gè)或更多個(gè)單體單元的雜聚聚合物。
34．一種通過施用組合物治療或預(yù)防病毒性感染的方法，所述組合物含有抑制病毒有效量的如權(quán)利要求18所述的偶聯(lián)產(chǎn)物。
35．按照權(quán)利要求34的方法，其中所述偶聯(lián)產(chǎn)物是均聚二聚體、雜聚二聚體、均聚三聚體或雜聚三聚體。
36．按照權(quán)利要求34的方法，其中所述病毒感染是由肝炎病毒、正粘病毒、乳頭瘤病毒、副粘病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、多瘤病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒引起。
37．按照權(quán)利要求36的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒是HIV或FIV。
38．按照權(quán)利要求36的方法，其中病毒感染是由產(chǎn)生整合酶或具有整合酶活性的蛋白的病毒引起。
39．按照權(quán)利要求34的方法，其中所述偶聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)鼻、經(jīng)口、透皮、非腸道、鞘內(nèi)的或靜脈內(nèi)給藥。
40．一種制備抗病毒劑的方法，該方法包括在堿性pH下保溫丹酚酸，由此形成均聚物或雜聚物，它們具有高于丹酚酸的抗病毒活性。
41．按照權(quán)利要求40的方法，其中所述均聚物或雜聚物具有等于或大于約492的分子量。
42．按照權(quán)利要求40的方法，其中所述均聚物或雜聚物具有約492至約986的分子量。
43．按照權(quán)利要求42的方法，其中所述均聚物或雜聚物具有約492的分子量。
44．按照權(quán)利要求42的方法，其中均聚物或雜聚物具有約984的分子量。
45．按照權(quán)利要求42的方法，其中所述均聚物或雜聚物具有約986的分子量。
46．按照權(quán)利要求42的方法，其中所述均聚物或雜聚物含有丹酚酸和/或丹酚酸的脫氫形式Ⅱ或Ⅱ的單體單元，該丹酚酸具有結(jié)構(gòu) 所述丹酚酸的脫氫形式具有如下結(jié)構(gòu) 其中R1、R2、R3、R4、R5和R6是氫或一個(gè)鍵，并且該均聚物和雜聚物的單體單元彼此通過R1、R2、R3、R4、R5和R6鍵合。
47．按照權(quán)利要求46的方法，其中形成均聚二聚體。
48．按照權(quán)利要求47的方法，其中其中所述單體單元通過R1-R1、R2-R2、R3-R3、R4-R4、R5-R5或R6-R6鍵鍵合在一起。
49．權(quán)利要求47的方法，其中所述單體單元通過R1-R2、R1-R3、R1-R4、R2-R3、R2-R4或R3-R4鍵鍵合在一起。
50．權(quán)利要求46的方法，其中形成雜聚二聚體。
51．權(quán)利要求50的方法，其中所述單體單元通過R1-R5、R2-R5、R3-R5或R4-R5鍵鍵合在一起。
52．權(quán)利要求40的方法，其中所述單體單元通過R1-R6、R2-R6、R3-R6、R4-R6或R5-R6鍵鍵合在一起。
53．按照權(quán)利要求50的方法，其中形成均聚三聚體。
54．按照權(quán)利要求40的方法，其中形成雜聚三聚體。
55．按照權(quán)利要求40的方法，其中形成4個(gè)或更多個(gè)單體單元的均聚物。
56．按照權(quán)利要求40的方法，其中形成4個(gè)或更多個(gè)單體單元的雜聚物。
全文摘要
本申請?zhí)峁┖芯哂兄辽僖粋€(gè)得自β－(3,4－二羥基苯基)乳酸和/或咖啡酸的部分的分子之組合物,這些分子見于鼠尾草屬植物的提取物中,所述部分是式(Ⅰ),活性劑具有至少190道爾頓的分子量。一類優(yōu)選的活性劑是含有上述部分的偶聯(lián)成為二聚體、三聚體、四聚體和更大聚合物的那些。最優(yōu)選丹酚酸二聚體、三聚體、四聚體和更大聚合物。所述化合物和組合物可以在可藥用載體和賦形劑中全身或局部給藥用于治療病毒性感染。
文檔編號A61K31/19GK1312722SQ99809677
公開日2001年9月12日 申請日期1999年6月25日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月25日
發(fā)明者M·K·漢恩, P·李 申請人:喬治敦大學(xué)