專利名稱：轉(zhuǎn)錄因子nf－κb的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及使用氨基二氫茚酮抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的方法。這類化合物尤其可用于治療其中涉及NF-κB活化的疾病。更具體地說，這些化合物抑制IκB磷酸化和隨后的降解。這類化合物可用于治療各種與NF-κB活化有關(guān)的疾病，包括炎癥性疾?。挥绕涫穷愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病和哮喘；皮膚病，包括牛皮癬和特應(yīng)性皮炎；自身免疫性疾??；組織和器官排斥反應(yīng)；阿爾茨海默氏病；中風(fēng)；動脈粥樣硬化；再狹窄；癌癥，包括何杰金氏?。缓湍承┎《拘愿腥?，包括AIDS；骨關(guān)節(jié)炎；骨質(zhì)疏松；以及Ataxia Telangiestasia。
背景技術(shù)：
最近有關(guān)急慢性炎癥性疾病和癌癥的介質(zhì)的科學(xué)研究進展導(dǎo)致了探索有效治療的新戰(zhàn)略。傳統(tǒng)的方法包括直接靶向介入治療，例如使用特異性抗原、受體拮抗劑或酶抑制劑。最近有關(guān)各種介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)機制的突破性闡述提高了人們對涉及基因轉(zhuǎn)錄水平的治療方法的興趣。
NF-κB屬于與由Rel/NF-κB族多肽的各種結(jié)合物構(gòu)成的二聚轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物密切相關(guān)的一族物質(zhì)。該族物質(zhì)包括哺乳動物中的五種獨特的基因產(chǎn)物，RelA(p65)、NF-κB1(p50/p105)、NF-κB2(p49/p100)、c-Rel和RelB，所有這些都可形成雜聚或均聚的二聚體。這些蛋白都擁有高同源性的300個氨基酸的“Rel同源結(jié)構(gòu)域”，該結(jié)構(gòu)域包含DNA結(jié)合和二聚化結(jié)構(gòu)域。在Rel同源結(jié)構(gòu)域的C端是在NF-κB從胞漿中轉(zhuǎn)運到細胞核中具有重要意義的細胞核易位序列。另外，p65和cRel在它們的C末端具有有效反式激活結(jié)構(gòu)域。
NF-κB的活性通過其與一類IκB族蛋白抑制劑的相互作用來調(diào)節(jié)。該相互作用有效地阻斷NF-κB蛋白上細胞核定位序列，由此阻止二聚體向細胞核的遷移。種類眾多的刺激物通過可能是多信號傳導(dǎo)途徑活化NF-κB。包括有細菌產(chǎn)物(LPS)、某些病毒(HIV-1、HTLV-1)、炎癥性細胞因子(TNFα、IL-1)和環(huán)境應(yīng)力。對于所有刺激物明顯相同的是磷酸化和隨后的IκB降解。IκB通過最近鑒別的IκB激酶(IKK-α和IKK-B)在其兩個N末端絲氨酸上被磷酸化。與位點有關(guān)的誘變研究表明這些磷酸化對隨后的NF-κB活化具有重要意義，即，一旦被磷酸化蛋白就通過遍在蛋白-蛋白激酶途徑被標(biāo)記降解。從IκB上游離出來，活性NF-κB復(fù)合物可易位至細胞核，在這里它們選擇性地與優(yōu)選的基因特異性增強子序列結(jié)合。通過NF-κB調(diào)節(jié)的基因包括各種細胞因子、細胞粘附分子和急性期蛋白。
眾所周知，NF-κB在調(diào)節(jié)眾多促炎性介體的表達中起著關(guān)鍵作用，所述介體包括細胞因子，例如IL-6和IL-8；細胞粘附分子，如ICAM和VCAM；以及一氧化氮合成誘導(dǎo)酶(iNOS)。這些介體已知在炎癥部位的白細胞募集中起作用，并且在某些炎癥和自身免疫疾病中，iNOS可導(dǎo)致器官的破壞。
通過對包括哮喘在內(nèi)的呼吸道炎癥的研究，更增強了NF-κB在炎癥中的重要性，據(jù)顯示在哮喘中NF-κB被活化。這種活化作用可能是這些疾病中細胞因子產(chǎn)生增加和白細胞浸潤的基礎(chǔ)。另外，已知吸入類甾醇(steroids)可減弱呼吸道的過度反應(yīng)性并抑制哮喘呼吸道的炎癥反應(yīng)。鑒于最近有關(guān)糖皮質(zhì)激素對NF-κB的抑制作用的發(fā)現(xiàn)，人們可能會想到這些作用是通過抑制NF-κB介導(dǎo)的。
其它有關(guān)NF-κB在炎癥性疾病中的作用的證據(jù)來自類風(fēng)濕性滑膜的研究。雖然NF-κB一般以沒有活性的復(fù)合物形式存在于胞漿中，但最近的免疫組織化學(xué)研究表明在包含類風(fēng)濕性滑膜的細胞中，NF-κB存在于細胞核中，因此是有活性的。此外，據(jù)顯示在對TNF-K敏感的人滑膜細胞中NF-κB是活化形式的。這種分布可能是該組織特征性細胞因子和類花生酸產(chǎn)生增加的基礎(chǔ)機制。參見Roshak,A.K.等，J.Biol.Chem.,271,31496-31501(1996)。
NF-κB/Rel和IκB蛋白可能還在腫瘤的轉(zhuǎn)化中起作用。作為過度表達、基因擴增、基因重排或易位的結(jié)果，家族成員與體外或體內(nèi)細胞轉(zhuǎn)化有關(guān)。另外，在20-25％的某些人類淋巴腫瘤中可觀察到編碼這些蛋白的基因的重排和/或擴增。再者，據(jù)報道，NF-κB在調(diào)節(jié)細胞程序死亡中的作用增強了該轉(zhuǎn)錄因子在控制細胞增殖中的作用。
下列文獻中記載了數(shù)種NF-κB抑制劑C.Wahl等，J.Clin.Invest.101(5),1163-1174(1998)；R.W.Sullivan等，J.Med.Chem.41,413-419(1998)；J.W.Pierce等，J.Biol.Chem.272,21096-21103(1997)。
已知海洋天然產(chǎn)物hymenialdisine抑制NF-κB。Roshak,A.等，JPET,283,955-961(1997)。Breton,J.J.和Chabot-Fletcher,M.C.,JPET,282,459-466(1997)。
氨基二氫茚酮是已知化合物。氨基二氫茚酮類似物的通用制備方法記載于G.Maury,E.-M.Wu.N.H.Cromwell,J.Org.Chem.1968,33,1900-1907。3-溴中間體的合成記載于B.D.Pearson,R.P.Ayer.N.H.Cromwell,J.Org.Chem.1962,27,3038-3044。2-亞芐基二氫茚酮的合成記載于A.Hassner,N.H.Cromwell,J.Org.Chem1958,80,893-900。
現(xiàn)在我們發(fā)現(xiàn)了一種使用氨基二氫茚酮抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化的新方法。
發(fā)明簡述本發(fā)明的目的是提供一種治療可通過改變轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性治療緩和的疾病的方法。
因此，一方面，本發(fā)明提供一種含有式Ⅰ化合物和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
另一方面，本發(fā)明提供一種治療疾病的方法，其中所述疾病的病理學(xué)可通過抑制NF-κB得以治療緩和。
特別是，本發(fā)明提供治療與NF-κB活化有關(guān)的各種疾病的方法，所述疾病包括炎癥性疾?。挥绕涫穷愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病和哮喘；皮膚病，包括牛皮癬和特應(yīng)性皮炎；自身免疫性疾病；組織和器官排斥反應(yīng)；阿爾茨海默氏??；中風(fēng)；動脈粥樣硬化；再狹窄；癌癥，包括何杰金氏病；和某些病毒性感染，包括AIDS；骨關(guān)節(jié)炎；骨質(zhì)疏松；以及Ataxia Telangiestasia。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種治療與NF-κB活化有關(guān)的疾病的方法，包括給需此治療的動物，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人施用式Ⅰ化合物及其可藥用鹽、水合物和溶劑化物 其中R1是芳基；R2選自H、C1-6烷基和芳基；R3選自C1-6烷基和C3-8環(huán)烷基；并且R2和R3可一起形成一個5-7個原子的雜環(huán)，所示原子選自C、N、O和S。
本發(fā)明優(yōu)選提供一種治療下列疾病的方法炎癥性疾??；尤其是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病和哮喘；皮膚病，包括牛皮癬和特應(yīng)性皮炎；自身免疫性疾??；組織和器官排斥反應(yīng)；阿爾茨海默氏?。恢酗L(fēng)；動脈粥樣硬化；再狹窄；癌癥，包括何杰金氏病；和某些病毒性感染，包括AIDS；骨關(guān)節(jié)炎；骨質(zhì)疏松；以及Ataxia Telangiestasia。
優(yōu)選將選自下面組的式Ⅰ化合物用于本發(fā)明的方法3-[(N-丁基)氨基]-2-亞芐基二氫茚酮；3-[(N-環(huán)己基)氨基]-2-亞芐基二氫茚酮；3-嗎啉基-2-亞芐基二氫茚酮；和3-哌啶基-2-亞芐基二氫茚酮。
定義本發(fā)明包括本發(fā)明化合物的所有水合物、溶劑化物、復(fù)合物和前藥的應(yīng)用。前藥是在體內(nèi)釋放式Ⅰ的活性母體藥物的任何共價鍵合的化合物。如果在本發(fā)明的化合物中存在一個手性中心或另一種形式的異構(gòu)體中心，則本發(fā)明包括所有形式的這類異構(gòu)體，包括對映體和非對映體。包含一個手性中心的本發(fā)明化合物可以外消旋混合物形式使用，富含一種對映體的混合物或外消旋混合物可采用熟知的技術(shù)分離，也可單獨使用對映體。在化合物具有不飽和碳-碳雙鍵的情況下，順式(Z)和反式(E)異構(gòu)體均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。在其中化合物可以互變異構(gòu)體形式存在的情況下，例如酮-烯醇式互變異構(gòu)體，無論是平衡還是一種形式占主導(dǎo)存在的各種互變異構(gòu)體形式均應(yīng)包括在本式Ⅰ或其亞結(jié)構(gòu)式中存在的任何取代基的含義是彼此獨立的，除非另有說明，在任何其它情況下，才具有任何其它取代基的含義。
本文的“C1-6烷基”是指包括取代和未取代的甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基和叔丁基、戊基、正戊基、異戊基、新戊基和己基及其簡單的脂族異構(gòu)體。任何C1-6烷基可任選獨立地被一或兩個鹵素、SR’、OR’、N(R’)2、C(O)N(R’)2、氨基甲?；駽1-4烷基取代，其中R’是C1-6烷基。
本文的“C3-8環(huán)烷基”是指包括取代和未取代的環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)辛基、環(huán)庚基和環(huán)辛基及其簡單的脂族異構(gòu)體。任何C3-8環(huán)烷基可任選獨立地被一個或兩個鹵素、SR’、OR’、N(R’)2、C(O)N(R’)2、氨基甲酰基或C1-4烷基取代，其中R’是C1-6烷基。
本文的“鹵素”包括F、Cl、Br和I。
本文的“Ar”或“芳基”包括苯基或萘基，它們可任選獨立地被一個或多個下述的基團取代Ph-C0-6烷基、Het-C0-6烷基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、Ph-C0-6烷氧基、Het-C0-6烷氧基、OH、CN、CO2R’或鹵素。C0烷基是指在所述結(jié)構(gòu)部分不存在烷基。因此，Ar-C0烷基相當(dāng)于Ar。兩個C1-6烷基可聯(lián)合形成5-7元環(huán)，該環(huán)可以是飽和的或不飽和的、與Ar環(huán)稠合的。Ph可任選地被一個或多個C1-6烷基、C1-6烷氧基、OH、CO2R’或鹵素取代。
本文采用的“Het”或“雜環(huán)”表示穩(wěn)定的5-7元單環(huán)，該環(huán)可以是飽和的或不飽和的，其由碳原子和選自N、O和S的一至三個雜原子構(gòu)成并且其中的氮雜原子和硫雜原子可任選地被氧化，氮雜原子還可任選地被季銨化；以及包括上面定義的任何雜環(huán)與苯環(huán)稠合的任何雙環(huán)基團。所述雜環(huán)可在任何雜原子或碳原子處進行連接，其結(jié)果是產(chǎn)生一個穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，并且可任選地被選自下列的一個或多個基團取代Ph-C0-6烷基、Het-C0-6烷基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、Ph-C0-6烷氧基、Het-C0-6烷氧基、OH或CN。兩個C1-6烷基可聯(lián)合形成5-7元環(huán)，該環(huán)可以是飽和的或不飽和的、與Het環(huán)稠合的。Ph可任選地被一個或多個C1-6烷基、C1-6烷氧基、OH、CO2R’或鹵素取代。這類雜環(huán)的實例包括哌啶基、哌嗪基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、2-氧代吖庚因基、吖庚因基、吡咯基、4-吡啶酮基、吡咯烷基、吡唑基、吡唑烷基、咪唑基、吡啶基、吡嗪基、噁唑烷基、噁唑啉基、噁唑基、異噁唑基、嗎啉基、噻唑烷基、噻唑啉基、噻唑基、奎寧啶基、吲哚基、喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、苯并噁唑基、呋喃基、吡喃基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、噻吩基、苯并噁唑基、硫代嗎啉基亞砜、硫代嗎啉基砜和噁二唑基環(huán)。
制備方法在本發(fā)明方法中使用的化合物可通過下面的反應(yīng)路線

圖1所示的方法方便地制備。
氨基二氫茚酮類似物的通用制備方法記載于G.Maury,E.-M.Wu.N.H.Cromwell,J.Org.Chem.1968,33,1900-1907。3-溴中間體的合成記載于B.D.Pearson,R.P.Ayer.N.H.Cromwell,J.Org.Chem.1962,27,3038-3044。2-亞芐基二氫茚酮的合成記載于A.Hassner,N.H.Cromwell,J.Org.Chem 1958,80,893-900。通用制備方法反應(yīng)路線圖1中顯示了通用制備方法。在堿中，用苯甲醛處理二氫茚酮得到2-亞芐基二氫茚酮。在CCl4中用NBS溴化2-亞芐基二氫茚酮，得到3-溴-2-亞芐基二氫茚酮。在苯中，用烷基伯胺或仲胺處理3-溴-2-亞芐基二氫茚酮，得到3-烷基氨基-2-亞芐基二氫茚酮。
反應(yīng)路線圖1 有關(guān)上面反應(yīng)路線圖1中所示的制備式Ⅰ化合物的方法，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員都清楚，本發(fā)明應(yīng)包括制備式Ⅰ化合物所需的所有新的中間體。
本文使用的原料是市售的或者可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法制備，參見普通參考書，例如COMPENDIUM OF ORGANICSYNTHETIC METHODS,Vol.Ⅰ-Ⅵ(Wiley-Interscience出版)。
式Ⅰ化合物的酸加成鹽可在適宜的溶劑中，由母體化合物和過量的酸以標(biāo)準(zhǔn)方法制備，所述酸是，例如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、馬來酸、琥珀酸或甲磺酸。某些化合物形成內(nèi)鹽或兩性離子也是可接受的。陽離子鹽通過用包含適合陽離子的過量的堿性試劑(例如氫氧化物、碳酸鹽或醇化物)；或用適合的有機胺處理母體化合物來制備。存在于可藥用鹽中的陽離子實例是，例如Li+、Na+、K+、Ca++、Mg++和NH4+。存在于可藥用鹽中的陰離子實例是鹵離子、硫酸根、磷酸根、鏈烷酸根(例如乙酸根和三氟乙酸根)、苯甲酸根和磺酸根(例如甲磺酸根)。
本發(fā)明提供一種藥物組合物，該組合物含有式Ⅰ的化合物和可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。因此，式Ⅰ化合物可用于制備藥物。如上文所述制備的式Ⅰ化合物的藥物組合物可配制成用于非胃腸給藥的溶液或凍干粉末。粉末可在臨用前通過加入適宜的稀釋劑或其它可藥用載體重新配制。液體制劑可以是緩沖的等滲水溶液。適宜稀釋劑的實例是生理等滲鹽水溶液、標(biāo)準(zhǔn)的5％葡萄糖水溶液或緩沖的乙酸鈉或乙酸銨溶液。這類制劑尤其適于非胃腸給藥，但也可用于口服或盛于計量劑量的吸入器或霧化器中用于吹入給藥。加入賦形劑，例如聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥基纖維素、阿拉伯膠、聚乙二醇、甘露醇、氯化鈉或檸檬酸鈉也是可取的。
或者，可將這些化合物制成口服給藥的膠囊、片劑或者制備成乳液或糖漿形式?？杉尤肟伤幱玫墓腆w或液體載體以增強或提高組合物的穩(wěn)定性或有助于該組合物的制備。固體栽體包括淀粉、乳糖、二水合硫酸鈣、石膏、硬脂酸鎂或硬脂酸、滑石、果膠、阿拉伯膠、瓊脂或明膠。液體載體包括糖漿、花生油、橄欖油、鹽水和水。載體還包括緩釋材料，例如甘油一硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，或者它們與蠟的混合物。固體載體的用量可以變化，但每劑量單位優(yōu)選含約20mg至約1g固體載體。藥物制劑由常規(guī)的制藥技術(shù)制備，制備片劑，需要時，包括研磨、混合、制粒和壓制；制備硬明膠膠囊，包括研磨、混合和填充。當(dāng)使用液體載體時，制劑可以是糖漿、酏劑、乳液或水性或非水性懸浮液形式的。這類液體制劑可直接口服給藥(p.o.)或填充到軟明膠膠囊中。
為了直腸給藥，本發(fā)明的化合物也可與賦形劑，例如椰子油、甘油、明膠或聚乙二醇混合并鑄模為栓劑。
本發(fā)明的方法包括局部施用式Ⅰ化合物。局部給藥是指非系統(tǒng)給藥，包括對表皮外用、對頰口腔施用本發(fā)明的化合物和將這類化合物滴注到耳、眼和鼻中，其中化合物劑量不明顯進入血流。系統(tǒng)給藥是指口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)和肌內(nèi)給藥。通過局部給藥產(chǎn)生治療或預(yù)防作用所需的式Ⅰ化合物(下文稱為活性化合物)的量隨所選擇的化合物、所治療適應(yīng)癥的性質(zhì)和嚴重程度及進行治療的動物而變化，當(dāng)然最終是由醫(yī)師決定。
雖然活性成分可以化學(xué)原料形式給藥，但優(yōu)選以藥物制劑形式給藥。用于局部給藥時，活性成分可占制劑的0.01％-5.0％。
無論是獸用還是人用，本發(fā)明的局部制劑都含有活性成分與一種或多種可接受的載體，以及可任選的其它治療性成分。載體須是“可接受的”，即意為可與制劑中的其它成分相容并且對接受者不產(chǎn)生危害。
適于局部給藥的制劑包括適于滲透通過皮膚進入所需治療部位的液體或半固體制劑，例如搽劑、洗劑、霜劑、軟膏或糊劑，以及適于眼、耳或鼻給藥的滴劑。
本發(fā)明的滴劑可含有無菌的水性或油性溶液或者懸浮液，它們可通過將活性成分溶于適合的殺菌和/或殺真菌和/或任何其它適宜的防腐劑的水溶液中來制備，該水溶液中優(yōu)選含有表面活性劑。然后通過過濾使所得溶液澄明，轉(zhuǎn)移至適合的容器中，然后密封并用高壓釜或者在90-100℃保持1.5小時進行滅菌。或者，可通過過濾進行滅菌，然后采用無菌技術(shù)轉(zhuǎn)移至容器中。適于包括在滴劑中的殺菌劑或殺真菌劑的例子包括硝酸苯汞或乙酸苯汞(0.002％)、苯扎氯銨(0.01％)和醋酸洗必太(0.01％)。制備油性溶液的適宜溶劑包括甘油、稀乙醇和丙二醇。
本發(fā)明的洗劑包括適用于皮膚或眼的那些。洗眼劑可包含可任選地含有殺菌劑的無菌水溶液，它可通過類似于制備滴劑的方法進行制備。應(yīng)用于皮膚的洗劑或搽劑也可包括加速干燥和使皮膚涼爽的物質(zhì)，例如乙醇或丙酮；和/或保溫劑，例如甘油或油(例如蓖麻油和花生油)。
本發(fā)明的霜劑、軟膏或糊劑是外用的活性成分的半固體制劑。可借助適宜的機器，通過將活性成分以細粉形式本身地或者以其在水性或非水性液體中的溶液或懸浮液形式與油性或非油性基質(zhì)混合來制備半固體制劑?；|(zhì)可包括烴類，例如硬的、軟的或液體石蠟，甘油、蜂蠟、金屬皂；粘漿；天然來源的油，例如杏仁、玉米、花生、蓖麻或橄欖油；羊毛脂或其衍生物，或者脂肪酸(如硬脂酸或油酸)與醇(例如丙二醇或聚乙二醇)的混合物。該制劑可摻入任何適宜的表面活性劑，例如陰離子性、陽離子性或非離子性表面活性劑，例如脫水山梨醇酯或其聚氧化乙烯衍生物。也可包含懸浮劑，例如天然的樹膠、纖維素衍生物或無機材料，如含硅的硅石，以及其它成分，例如羊毛脂。
本發(fā)明實用性式Ⅰ化合物是有用的NF-κB抑制劑。本發(fā)明提供所述化合物的有用組合物和制劑，包括所述化合物的藥物組合物和制劑。
本發(fā)明還提供與NF-κB活化有關(guān)的疾病的治療方法，該方法包括給需此治療的動物，尤其是哺乳動物，最優(yōu)選是人施用式Ⅰ的化合物。本發(fā)明優(yōu)選提供包括下列疾病的治療方法炎癥性疾??；尤其是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病和哮喘；皮膚病，包括牛皮癬和特應(yīng)性皮炎；自身免疫性疾??；組織和器官排斥反應(yīng)；阿爾茨海默氏??；中風(fēng)；動脈粥樣硬化；再狹窄；癌癥，包括何杰金氏病；和某些病毒性感染，包括AIDS；骨關(guān)節(jié)炎；骨質(zhì)疏松；以及Ataxia Telangiestaisa。
對于急性治療，優(yōu)選將式Ⅰ化合物通過非胃腸給藥。本發(fā)明化合物在5％葡萄糖水溶液或5％葡萄糖的生理鹽水溶液中的靜脈輸液是最有效的，當(dāng)然肌內(nèi)快速濃注也有效。非胃腸給藥劑量典型地是約0.01-50mg/kg；優(yōu)選0.1-20mg/kg，以使藥物的血漿濃度維持在有效抑制NF-κB活化的濃度。為獲得約0.4-80mg/kg/日的每日總劑量，化合物可每日給藥一至四次。治療有效的本發(fā)明化合物的精確劑量和最佳給藥途徑很容易由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過將所述化合物的血液水平與產(chǎn)生治療效果所需的濃度進行比較來確定。
式Ⅰ化合物還可以足以抑制NF-κB或者治療本文所公開的任何其它適應(yīng)癥的藥物濃度口服給藥于患者。含有所述化合物的藥物組合物一般以約0.1-50mg/kg的口服劑量給藥(以與患者的適應(yīng)癥相一致)。口服劑量優(yōu)選為約0.5-20mg/kg。
式Ⅰ化合物也可以足以抑制NF-κB或者治療本文所公開的任何其它適應(yīng)癥的藥物濃度局部給藥于患者。含有所述化合物的藥物組合物一般以約0.01％-5％w/w的局部制劑給藥。
當(dāng)本發(fā)明的化合物按照本發(fā)明給藥時，預(yù)期沒有不可接受的毒副作用。
本文所述的化合物抑制NF-κB活化的能力可由其抑制驅(qū)動(driven)NF-κB的報道基因的能力清楚地證明(見表1)。本發(fā)明的NF-κB抑制劑在治療疾病中的實用性前提是NF-κB活化在各種疾病中具有重要意義。
表1對NF-κB驅(qū)動報道基因活性的抑制 NF-κB在調(diào)節(jié)眾多炎癥性介體的表達中起著關(guān)鍵作用，所述介質(zhì)包括細胞因子，例如IL-6和IL-8(Mukaida等，1990；Liberman和Baltimore,1990；Matsusaka等，1993)；細胞粘附分子，如ICAM和VCAM(Marui等，1993；Kawai等，1995；Ledebur和Parks,1995)；以及一氧化氮合成誘導(dǎo)酶(iNOS)(Xie等，1994；Adcock等，1994)。(所有這些文獻均附在該部分的最后)。這些介體已知在炎癥部位的白細胞募集中起作用，并且在某些炎癥和自身免疫疾病中，iNOS可導(dǎo)致器官的破壞(McCartney-Francis等，1993；Kleemann等，1993)。重要的是，本文所述的化合物抑制IL-8合成和一氧化氮(一種iNOS活性產(chǎn)物)的產(chǎn)生(見表2)。
表2表1中化合物2的抗炎活性
對哮喘患者的研究獲得了NF-κB在炎癥性疾病中的重要作用的證據(jù)。與取自正常的非變應(yīng)性對照相比，取自輕微變應(yīng)性哮喘的支氣管活檢顯示粘膜下層染色活化的NF-κB、總NF-κB和NF-κB調(diào)節(jié)的細胞因子，例如GM-CSF和TNF-α的細胞數(shù)量明顯增多(Wilson等，1998)。另外，表達NF-κB載體的免疫反應(yīng)性百分數(shù)同活檢樣品的表皮中的IL-8免疫反應(yīng)性一樣增高(Wilson等，1998)。因此，正如預(yù)期這些化合物對呼吸道炎癥具有有益效果所證實的那樣，通過抑制NF-κB來抑制IL-8的產(chǎn)生。
最近的研究表明NF-κB在炎癥性腸病(BID)的發(fā)病機理中也起著關(guān)鍵作用。在取自節(jié)段性回腸炎(Chron’s disease)和潰瘍性結(jié)腸炎患者的結(jié)腸活檢樣品中觀察到了活化的NF-κB(Ardite等，1998；Rogler等，1998；Schreiber等，1998)?；罨诎l(fā)炎的粘膜中明顯；在不發(fā)炎的粘膜中則不明顯(Ardite等，1998；Rogler等，1998)，并與這些相同部位IL-8 mRNA表達的增高有關(guān)(Ardite等，1998)。再者，皮質(zhì)類固醇的處理強烈地抑制腸的NF-κB活化并減弱了結(jié)腸炎癥(Ardite等，1998；Rogler等，1998；Schreiber等，1998)。另外，正如預(yù)期這些化合物在炎癥性腸病中具有有益效果所證實的那樣，通過抑制NF-κB來抑制IL-8的產(chǎn)生。
胃腸道炎癥的動物模型進一步支持了NF-κB是結(jié)腸炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑的觀點。在帶有活化復(fù)合物的主要成分p65的小鼠中，以2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)引發(fā)的結(jié)腸炎，在其巨噬細胞固有層中觀察到了NF-κB活性的提高(Neurath等，1996；Neurath和Pettersson,1997)。局部施與p65反義物消除了被治療動物中建立的結(jié)腸炎的信號，同時沒有出現(xiàn)毒性信號(Neurath等，1996；Neurath和Pettersson,1997)。因此，可以預(yù)言小分子NF-κB抑制劑可用于治療IBD。
關(guān)于NF-κB在炎癥性疾病中的作用的進一步的證據(jù)來自類風(fēng)濕性滑膜的研究。雖然NF-κB通常以沒有活性的胞漿復(fù)合物形式存在，但最近的免疫組織化學(xué)研究表明NF-κB還存在于包括人類風(fēng)濕性滑膜的細胞中的細胞核內(nèi)，因而是活性的(Handel等，1995；Marok等，1996；Sioud等，1998)，另外它還存在于該疾病的動物模型中的細胞核內(nèi)并因而是有活性的(Tsao等，1997)。染色與A型滑膜細胞和血管內(nèi)皮有關(guān)(Marok等，1996)。另外，在培養(yǎng)的滑膜細胞(Roshak等，1996；Miyazawa等，1998)和用IL-1β或TNF-α刺激的滑膜細胞培養(yǎng)物中(Roshak等，1996；Fujkawa等，1996；Roshak等，1997)，觀察到了NF-κB的組成活化。因此，NF-κB活化可成為細胞因子產(chǎn)生增加和炎癥性滑膜的特征性白細胞浸潤的基礎(chǔ)?？梢灶A(yù)言這些化合物抑制NF-κB的能力并由此抑制這些細胞產(chǎn)生類花生酸將對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生有益效果(見表2)。
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生物學(xué)分析用數(shù)種生物學(xué)分析方法之一測試本發(fā)明的化合物以確定產(chǎn)生給定藥理學(xué)作用所需的化合物濃度。
如Breton,J.J和Chabot-Fletcher,M.C.,JPET,282,459-466(1997)中所述，用細胞基熒光素酶報告分析分析NF-κB活性。概括地說，在加有250μg/ml遺傳霉素(硫酸G418,LifeTechnologies,Grand Island,NY)的上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)用NF-κB報道質(zhì)粒(見下)永久轉(zhuǎn)染的U937人組織細胞性淋巴細胞系。在轉(zhuǎn)染的U937克隆細胞中進行熒光素酶報告分析。在300xg下離心兩次(每次5分鐘)后，再懸浮于含10％FBS的RPMI 1640中至1×106個細胞/毫升。將每份1毫升的該懸浮液等份試樣加到24孔板的孔中。將化合物或二甲基亞砜(DMSO)載體(1μl)加到該適合的孔中，將培養(yǎng)板在37℃、5％CO2下保溫30分鐘。加入刺激物(5ng/ml TNFα,100ng/mlLPS或0.1μM PMA)，將該樣品在37℃、5％CO2下保溫5分鐘，轉(zhuǎn)移至1.9ml的聚丙烯管中，并于200xg下離心5分鐘。細胞沉淀物用不合Ca2+和Mg2+的1ml PBS洗滌兩次，并如上所示進行離心。將所得細胞沉淀物在50μl1×裂解緩沖液(Promega Corporation,Madison,WI)中裂解、渦旋并在室溫保溫15分鐘。將每份20μl的裂解物轉(zhuǎn)移至不透明的白底96孔培養(yǎng)板(Wallac Inc.,Gaithersburg,MD)中并在Micro Lumant LB 96 P發(fā)光計(EG&G Berthold,Bad Wilbad,Germany)中分析熒光素酶的產(chǎn)生。發(fā)光計將100μl的熒光素酶分析試劑(Promega Corporation,Madison,WI)分配到每個孔中并記錄整體發(fā)出的光20秒。以相對光單位(RLUs)測量發(fā)出的光量。
也可采用電泳遷移率變動分析(EMSA)測定NF-κB的活性來估測核中存在的NF-κB蛋白。將被分析細胞以1×106/ml進行培養(yǎng)。通過離心捕獲細胞，用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗滌后，再以1×107個細胞/毫升的密度懸浮于含Ca2+和Mg2+的PBS。為測定化合物對NF-κB活化的影響，在37℃下用不同濃度的藥物或載體(DMSO,0.1％)將細胞懸浮液處理30分鐘，然后用TNFα(5.0ng/ml)刺激15分鐘。如下制備細胞和核的提取物。概括地說是，在處理結(jié)束時，將細胞(1×107個細胞)用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗滌兩次。將所得細胞沉淀物再懸浮于20μl緩沖液A(10mM Hepes(pH7.9),10mM KCl,1.5mM MgCl2,0.5mM二硫蘇糖醇(DTT)和0.1％NP-40)并在冰中保溫10分鐘。在4℃下通過以3500rpm微量離心10分鐘使核沉淀。收集上清液作為細胞提取物，將核沉淀物再懸浮于15μl緩沖液C(20mM Hepes(pH7.9),0.42MNaCl,1.5mM MgCl2,25％甘油，0.2mM EDTA,0.5MM DTT和0.5mM苯甲基磺酰氟(PMSF))中。將該懸浮液在4℃輕輕攪拌20分鐘后，在4℃以14000rpm微量離心10分鐘。收集上清液并用緩沖液D(20mM Hepes(pH7.9),50mM KCl,20％甘油，0.2mM EDTA,0.5MM DTT和0.5mM PMSF)稀釋至60μl。將所有的樣品在保存在-80℃直至分析時。按照Bradford(Bradford,1976)的方法，用BioRad試劑測定提取物的蛋白濃度。
采用電泳遷移率變動分析(EMSA)用上述的處理過細胞的核提取物估測化合物對轉(zhuǎn)錄因子活化的影響。用T4多核苷酸激酶和[g-32P]ATP標(biāo)記雙鏈NF-κB共有的寡核苷酸(5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’)。結(jié)合的混合物(25μl)含有10mMHepes-NaOH(pH7.9),4mM Tris-HCl(pH7.9),60mM KCl,1mM EDTA,1mM二硫蘇糖醇，10％甘油，0.3mg/ml胎牛血清白蛋白和1μg多(dI-dC)·多(dI-dC)。在室溫下，在有或沒有未標(biāo)記的競爭物的存在下，將該結(jié)合的混合物(10μg核提取蛋白)與0.5ng32P-標(biāo)記的寡核苷酸(50000-100000cpm)保溫20分鐘，之后將該混合物加載到在1XTris硼酸鹽/EDTA中制備的4％聚丙烯酰胺凝膠上，在200伏下電泳2小時。電泳凝膠之后，進行干燥并與測定結(jié)合反應(yīng)的膜接觸。
可用蛋白印跡法監(jiān)測化合物對IκB磷酸化的影響。使細胞提取物在10％凝膠(BioRad,Hercules,CA)上進行月桂基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Hybond1m-ECL,Amersham Corp.,Arlington Heights,IL)。用直接抗IκBα或IκBβ的多克隆兔抗體，然后用過氧化物酶結(jié)合的驢抗兔第二代抗體(Amersham Corp.,Arlington Heights,IL)進行免疫印跡分析。用增強化學(xué)熒光(ECL)分析系統(tǒng)(Amersham Corp.,Arlington Heights,IL)監(jiān)測免疫反應(yīng)帶。
用人RSF的原代培養(yǎng)物評價人滑膜成纖維細胞(RSF)對類花生酸產(chǎn)生的影響。通過酶消化取自成人類風(fēng)濕患者的滑膜得到RSF。在37℃和5％CO2下，在Earl氏最低必需培養(yǎng)基(EMEM)中培養(yǎng)細胞，該培養(yǎng)基中還含有10％胎牛血清(FBS)、100單位/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素(GIBCO,Grand Island,NY)。為獲得更均勻的I型成纖維細胞群，使用在第4-9傳代細胞的培養(yǎng)物，對于某些研究，將成纖維細胞以5×104個細胞/ml密度加到直徑為16mm的24孔培養(yǎng)板(Costar,Cambridge,MA)。使細胞與最佳劑量的IL-1β(1ng/ml；Roshak等，1996a)(Genzyme,Cambridge,MA)接觸指定的時間。在加入IL-1之前15分鐘，往細胞培養(yǎng)物中加入DMSO載體中的藥物(1％)。用購自Cayman Chemcial Co.(Ann Arbor,MI)的酶免疫分析(EIA)試劑盒直接測定在培養(yǎng)結(jié)束時匯集在不含細胞的培養(yǎng)基中的前列腺素E2水平。用實驗培養(yǎng)基制備樣品和標(biāo)準(zhǔn)稀釋液。
用佛波酯誘發(fā)的小鼠耳部炎癥模型評價體內(nèi)抗炎活性。將乙酸肉桂酸佛波酯(PMA)(4μg/20μl丙酮)施用于雄性Balb/c小鼠(6只/組)(Charles River Breeding Laboratories,Wilmington,MA)左耳的內(nèi)表面和外表面4小時后，將溶解在25μl丙酮中的化合物施用在同一耳朵上。20小時后用刻度式測微計(Mitutoyo,Japan)測量兩只耳朵的厚度，并局部施用第二次劑量的化合物。24小時后，測量耳部的厚度，數(shù)據(jù)以治療耳和未治療耳的厚度變化(×10-3cm)表示。然后切下發(fā)炎的左耳并貯存于-70℃直至分析用于分析髓過氧化物酶(MPO)的活性，該酶活性是一種炎癥細胞浸潤的量度。
通過測量發(fā)炎耳組織中存在的髓過氧化物酶活性評價炎癥細胞的浸潤。將部分融化的耳組織切碎，然后用Tissumizer勻漿器(Tekmar Co.,Cincinnati,OH)在含0.5％HTAB的50mM磷酸鹽緩沖液(pH 6)中勻化(10％w/v)。對組織勻化物進行三次冷凍-融化循環(huán)，然后進行短暫超聲(10秒)。如下測定勻化物中的MPO活性。在460nm用分光光度法測定鄰二甲氧基苯胺(0.167mg/加ml,SigmaChemical,St.Louis,MO)和過氧化氫(0.0005％)的MPO-依賴性反應(yīng)的有色產(chǎn)物的出現(xiàn)。用Bechman DU-7分光光度計和動力學(xué)分析設(shè)備(Beckman Instruments,Inc.,Sommerset,NJ)動力學(xué)定量上清液的MPO活性(以15秒的間隔取樣，測量3分鐘的吸收變化)。一單位的MPO活性被定義為25℃下每分鐘分解一微摩爾的過氧化物。
在體外軟骨分離塊系統(tǒng)中測定對炎癥介導(dǎo)的軟骨破裂的影響。在該模型中，在有或沒有試驗化合物的存在下，將牛關(guān)節(jié)軟骨分離塊或該分離塊和rHuIL-1α一起保溫4天/96小時，以促進軟骨破裂。取出上清液用于進行一氧化氮分析。用Greiss反應(yīng)并以分光光度計讀取530nm處的數(shù)據(jù)測定一氧化氮。該反應(yīng)測定二氧化氮(NO2)，它是一氧化氮的穩(wěn)定終產(chǎn)物。
通述在250、300或400Mhz下，分別使用Bruker AM 250、Bruker 300或Bruker AC 400光譜儀測定核磁共振譜。CDCl3是氘代氯仿，DMSO-d6是六氘代二甲基亞砜，CD3OD是四氘代甲醇?；瘜W(xué)位移值以與內(nèi)標(biāo)四甲基硅烷相比的低場位移(downfield)的百萬分之一為單位報告。NMR數(shù)據(jù)中的縮寫如下s=單峰，d=雙重蜂，t=三重峰，q=四重峰，m=多重峰，dd=雙重雙峰，dt=雙三重峰，app=清晰可見的峰，br=寬峰。J表示在Hertz中測量的NMR偶合常數(shù)。在Perkin Elmer683紅外光譜儀上記錄連續(xù)波紅外光譜(IR)，在Nicolet Impact 400D紅外光譜儀上記錄傅立葉變換紅外光譜(FTIR)。以傳輸方式記錄IR和FTIR，以反波數(shù)為單位(cm-1)記錄譜帶的位置。在VG 70 FE、PESyx API Ⅲ或VG ZAB HF儀上，使用快速原子轟擊(FAB)或電噴(ES)離子化技術(shù)測定質(zhì)譜。用Perkin-Elmer 240C元素分析儀進行元素分析。在Thomas-Hoover熔點儀上測定熔點，但沒有校正。所有的溫度均以攝氏度報告。
用Analtech Silica Gel GF和E.Merck Silica Gel 60F-254薄層板進行薄層色譜。用E.Merck Kieselgel 60(230-400目)硅膠進行快速色譜和重力色譜。
如下面所示，某些原料購自Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,Wisconsin。
實施例在下列合成實施例中，溫度以攝氏度(℃)表示。除非另有說明，所有原料均從市場獲得。無需進一步的闡述，相信本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過前面的描述最大程度的實現(xiàn)本發(fā)明。這些實施例用于說明本發(fā)明，而非限制其范圍。發(fā)明者要求保護的是下面提到的權(quán)利要求書。
實施例13-[(N-丁基)氨基]-2-亞芐基二氫茚酮的制備a)2-亞芐基二氫茚酮按照A.Hassner,N.H.Cromwell,J.Org.Chem.1958,80,893-900的方法，在0℃下，將苯甲醛(6.05ml,53.6mmol)加到二氫茚酮(Aldrich,7.08g,53.6mmol)的乙醇溶液和KOH(600mg,10.6mmol)中，將該反應(yīng)物放置在冰箱中過夜。將反應(yīng)混合物過濾，用50％乙醇水溶液洗滌，然后在熱乙醇中重結(jié)晶，得到5.84g 2-亞芐基二氫茚酮。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.93(d,1H,J=7.7),7.75-7.35(m,8H),4.08(s,2H)。
b)3-溴-2-亞-芐基二氫茚酮按照B.D.Pearson,R.P.Ayer,N.H.Cromwell,J.Org.Chem.1962,27,3038-3044的方法，在四氯化碳(15ml)中，將實施例1(a)得到的化合物(1.0g,4.55mmol)用NBS(810mg,4.55mmol)和過氧化苯甲酰(50mg)處理，并將該混合物用熱燈加熱回流1小時。將反應(yīng)物冷卻，過濾并蒸發(fā)濾液，得到3-溴-2-亞芐基二氫茚酮，該產(chǎn)物無需純化即可使用。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.1-7.2(m,10H),6.40(s,2H)。
c)3-[(N-丁基)氨基]-2-亞芐基二氫茚酮按照G.Maury,E.-M.Wu.N.H.Cromwell,J.Org.Chem.1968,33,1900-1907的方法，在苯中將實施例1(b)得到的化合物用正丁基胺(300μl,3.04mmol)處理并將該溶液在室溫下攪拌24小時。蒸發(fā)反應(yīng)物，殘余物經(jīng)快速色譜(硅膠，10％乙酸乙酯的己烷溶液)純化，得到353mg 3-[(N-丁基)氨基]-2-亞芐基二氫茚酮。在乙醚中，將一部分游離堿用1N鹽酸的乙醚溶液處理，得到固體狀的鹽酸鹽。ES-MS(M+H)+m/e 292；H NMR(300MHz,CDCl)δ8.2(d,1H,J=7.0Hz),9.03(s,1H),7.98(d,1H,J=6Hz),7.84(t,1H,J=6Hz),7.75-7.50(m,7H),6.7(brs,1H),2.48(brs,1H),2.28(brs,1H),1.6-1.3(m,2H),0.95-0.8(m,2H),0.65(t,3H,J=6.5Hz)。
上述說明書和實施例充分公開了如何制備和使用本發(fā)明的化合物。但本發(fā)明不限于上文描述的特定實施方案，而是包括本發(fā)明范圍內(nèi)其所有的改變。本文引述的各種期刊、專利和其它出版物文獻包括了現(xiàn)有技術(shù)的描述，將它們?nèi)慕Y(jié)合到本文中以供參考。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，含有式Ⅰ化合物 其中R1是芳基；R2選自H、C1-6烷基和芳基；R3選自C1-6烷基和C3-8環(huán)烷基；并且R2和R3可一起形成一個5-7個原子的雜環(huán)，所示原子選自C、N、O和S；以及可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中R2是H。
3.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中R3選自丁基和環(huán)己基。
4.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中R2和R3可一起聯(lián)合形成5-7個原子的雜環(huán)，所述原子選自C、N、O和S。
5.權(quán)利要求4的藥物組合物，其中R3選自嗎啉基和哌啶基。
6.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述化合物選自3-[(N-丁基)氨基]-2-亞芐基二氫茚酮；3-[(N-環(huán)己基)氨基]-2-亞芐基二氫茚酮；3-嗎啉基-2-亞芐基二氫茚酮；和3-哌啶基-2-亞芐基二氫茚酮。
7.一種抑制NF-κB的方法，包括對需此抑制的患者施用有效量的式Ⅰ化合物其中 R1是芳基；R2選自H、C1-6烷基和芳基；R3選自C1-6烷基和C3-8環(huán)烷基；并且R2和R3可一起形成一個5-7個原子的雜環(huán)，所示原子選自C、N、O和S。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述化合物選自3-[(N-丁基)氨基]-2-亞芐基二氫茚酮；3-[(N-環(huán)己基)氨基]-2-亞芐基二氫茚酮；3-嗎啉基-2-亞芐基二氫茚酮；和3-哌啶基-2-亞芐基二氫茚酮。
9.一種以NF-κB過度活化為特征的疾病的治療方法，包括通過對需此治療的患者施用有效量的式Ⅰ化合物及其可藥用鹽、水合物和溶劑化物抑制所述過度活化 其中R1是芳基；R2選自H、C1-6烷基和芳基；R3選自C1-6烷基和C3-8環(huán)烷基；并且R2和R3可一起形成一個5-7個原子的雜環(huán)，所示原子選自C、N、O和S。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述化合物選自3-[(N-丁基)氨基]-2-亞芐基二氫茚酮；3-[(N-環(huán)己基)氨基]-2-亞芐基二氫茚酮；3-嗎啉基-2-亞芐基二氫茚酮；和3-哌啶基-2-亞芐基二氫茚酮。
11.權(quán)利要求9和10的方法，其中所述疾病是炎癥性疾病。
12.權(quán)利要求14的方法，其中所述疾病選自類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病和哮喘。
13.權(quán)利要求9和10的方法，其中所述疾病是皮膚病。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述疾病選自牛皮癬和特應(yīng)性皮炎。
15.權(quán)利要求9和10的方法，其中所述疾病選自自身免疫性疾病；組織和器官排斥反應(yīng)；阿爾茨海默氏病；中風(fēng)；動脈粥樣硬化；再狹窄；骨關(guān)節(jié)炎；骨質(zhì)疏松；和Ataxia Telangiestaisa。
16.權(quán)利要求9和10的方法，其中所述疾病是癌癥。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述癌癥是何杰金氏病。
18.權(quán)利要求9和10的方法，其中所述疾病是AIDS。
全文摘要
本發(fā)明提供轉(zhuǎn)錄因子NF－ΚB的氨基二氫茚酮抑制劑及其可藥用鹽、水合物和溶劑化物,這些化合物的藥物組合物,以及治療其中涉及NF－ΚB活化的疾病的方法。更具體地說,本發(fā)明通過對需此治療的患者施用本發(fā)明的化合物提供了各種與NF－ΚB活化有關(guān)的疾病的治療方法,它們包括炎癥性疾病;尤其是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病和哮喘;皮膚病,包括牛皮癬和急性皮炎;自身免疫性疾病;組織和器官排斥反應(yīng);阿爾茨海默氏病;中風(fēng);動脈粥樣硬化;再狹窄;癌癥,包括何杰金氏病;和某些病毒性感染,包括AIDS;骨關(guān)節(jié)炎;骨質(zhì)疏松;以及AtaxiaTelangiestasia。
文檔編號A61P1/04GK1306428SQ99807572
公開日2001年8月1日 申請日期1999年6月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月19日
發(fā)明者J·F·卡拉漢, M·C·查波特－弗萊特徹爾 申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司