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轉(zhuǎn)錄因子aprf的制作方法

文檔序號:6792705閱讀:464來源:國知局
專利名稱:轉(zhuǎn)錄因子aprf的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及新的轉(zhuǎn)錄因子,急性期反應(yīng)因子(下文縮寫為APRF),編碼它的DNA,尋找抗APRF功能的抑制劑的測定和篩選方法以及抗所述APRF功能的抑制劑。
更具體地說,本發(fā)明涉及與細(xì)胞中白細(xì)胞介素6(下文縮寫為IL-6)的信號傳遞有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子APRF,及其制備方法,編碼它的DNA,含所述DNA的復(fù)制和表達(dá)載體,用所述復(fù)制和表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞,尋找抗APRF功能的抑制劑的測定和篩選方法以及抗所述APRF功能的抑制劑。
生物信號傳遞物通過將生物活性物質(zhì)刺激的信號傳遞到細(xì)胞中,從而介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答。狹義上講,生物信號傳遞物是指一種物質(zhì),它從生物活性物質(zhì)的受體收到信號并調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)的基因表達(dá)。在所述的生物信號傳遞物質(zhì)中,與核DNA結(jié)合并調(diào)節(jié)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)被稱為轉(zhuǎn)錄因子。在本發(fā)明中,稱這些因子為轉(zhuǎn)錄因子。
通常轉(zhuǎn)錄因子本身是蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄因子具有從一級生物活性媒介物到細(xì)胞,將信息(信號)傳遞給核內(nèi)DNA的功能,并具有在轉(zhuǎn)錄階段,調(diào)節(jié)二級蛋白質(zhì)表達(dá)的功能。即當(dāng)?shù)谝簧锘钚晕镔|(zhì)作用于細(xì)胞并表達(dá)第二蛋白質(zhì)時(shí),轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞內(nèi)起作用。通過所述轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄包括提高(加速)表達(dá)和降低(限制)表達(dá)。在本發(fā)明中,通過第一蛋白質(zhì)的作用調(diào)節(jié)其表達(dá)的第二蛋白質(zhì)被稱為可誘導(dǎo)蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)的相應(yīng)基因被稱為可誘導(dǎo)基因。例如,由IL-6誘導(dǎo)的蛋白質(zhì),如結(jié)合珠蛋白被稱為IL-6誘導(dǎo)蛋白,而所述蛋白質(zhì)的基因如結(jié)合珠蛋白基因被稱為IL-6誘導(dǎo)的基因。
由IL-6促進(jìn)其表達(dá)的蛋白質(zhì)實(shí)例有上述的結(jié)合珠蛋白,hemopequisin,C-反應(yīng)蛋白,α2-巨球蛋白,α1-酸性糖蛋白,以及已知的在炎癥的急性期明顯出現(xiàn)的那些蛋白質(zhì)。相反,血清白蛋白是由IL-6抑制其表達(dá)的一種蛋白質(zhì)實(shí)例。
轉(zhuǎn)錄物質(zhì)與可誘導(dǎo)基因DNA的特定序列結(jié)合,然后調(diào)節(jié)所述可誘導(dǎo)基因的表達(dá)。通常,由轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA序列位于啟動子區(qū)附近??烧T導(dǎo)基因的上游。由轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA序列與轉(zhuǎn)錄因子的種類有內(nèi)在一致性。在文獻(xiàn)1(Montminy,M,Science 261,1694(1993))中描述了近期的轉(zhuǎn)錄因子研究。
迄今,已知NF-IL-6是與IL-6的細(xì)胞內(nèi)信號傳遞有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(參見文獻(xiàn)2Akira,S等人,EMBO,J.9,1897(1990),文獻(xiàn)3Poli,V.等人,Cell,63,643(1990),文獻(xiàn)4Kinoshita,S.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89,1473(1992)等)。
然而,在上述文獻(xiàn)中,還沒有關(guān)于轉(zhuǎn)錄物質(zhì)直接從IL-6受體將轉(zhuǎn)錄信號傳遞給IL-6誘導(dǎo)基因的描述。另一方面,已知序列CTGGGA位于該IL-6可誘導(dǎo)基因的上游。因此,在文獻(xiàn)5(Wegenka,U.M.等人,Mol.Cell Biol.,13,276,1993)中提供了某些由IL-6激活并結(jié)合所述序列的物質(zhì),但在該文獻(xiàn)中,盡管提出了所述蛋白質(zhì)因子的存在,但未弄清所述因子的序列、結(jié)構(gòu)、物理或化學(xué)特性如分子量。在該文獻(xiàn)中,未公開轉(zhuǎn)錄因子APRF這種物質(zhì)本身。
轉(zhuǎn)錄物質(zhì)存在于細(xì)胞內(nèi),并且當(dāng)生物活性物質(zhì)(第一蛋白質(zhì))與上文描述的細(xì)胞受體結(jié)合后,通常它通過被磷酸化,移到核內(nèi)并與適當(dāng)DNA序列結(jié)合,而調(diào)節(jié)可誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄。因此,可以影響所述轉(zhuǎn)錄物質(zhì)的作用如抑制的物質(zhì),可被作為與上述生物活性物質(zhì)有關(guān)的疾病的治療藥劑。
從上述角度看,本發(fā)明人的目的在于與炎癥等疾病有關(guān)的IL-6。本發(fā)明人分離并純化了APRF并確定了部分氨基酸序列,克隆了所述基因,確定了作為轉(zhuǎn)錄因子的APRF的全部核苷酸序列和推測的全部氨基酸序列,并首次得到作為物質(zhì)的APRF本身。
本發(fā)明人繼續(xù)研究并建立了利用APRF確定和尋找可用于治療由IL-6誘導(dǎo)的疾病(如炎癥疾病,白血病,癌,由活化的破骨細(xì)胞誘發(fā)的骨破折,肺動脈高壓等)的物質(zhì)的方法。而且本發(fā)明人還得到了所述抑制劑。本發(fā)明是以這些知識為基礎(chǔ)完成的。
本發(fā)明提供實(shí)質(zhì)上純化的哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子APRF。
實(shí)質(zhì)上純化的形式指,例如對于SEQ ID NO 1或5所述多肽的情況下,在制品中的多肽,其中制品中90%以上,如95%,98%,或99%的多肽是SEQ ID NO.1或5的多肽。
上述本發(fā)明的APRF具有新的一級氨基酸序列。當(dāng)用計(jì)算機(jī)將本發(fā)明多肽的氨基酸序列與Swiss Prot(Swiss Prot Release 2.0)數(shù)據(jù)庫中的所有已知序列進(jìn)行比較時(shí),沒有具有等同于本發(fā)明的多肽的氨基酸序列的多肽。此外,當(dāng)用計(jì)算機(jī)與Gen Bank(Gen Bank Release 70.0)數(shù)據(jù)庫中的所有已知序列進(jìn)行比較時(shí),也沒有編碼等同于本發(fā)明多肽的核苷酸序列。
本發(fā)明APRF的詳細(xì)描述如下可以用下文描述的具體方法完成有關(guān)APRF的分離、純化、部分氨基酸序列的確定,CDNA的克隆,全部氨基酸序列的確定。該方法綜述如下。
即給小鼠施用IL-6,并在施用15分鐘后將其殺死。從肝中提取核蛋白部分。用固定有具下列序列的DNA寡聚物的柱純化提取物CCTTCCGGAATTC然后在聚丙烯酰胺凝膠上電泳純化。
用賴氨酰內(nèi)肽酶水解純化的產(chǎn)物。用高效液體色譜分離由此得到的消化產(chǎn)物并分離各個(gè)峰。用自動氨基酸序列分析儀從N-末端開始確定上述得到的肽片段的氨基酸序列。
根據(jù)上述確定的部分氨基酸序列合成相應(yīng)的DNA寡聚物。用DNA寡聚物從哺乳動物肝或胎盤的CDNA文庫中分離APRF的CDNA。從APRF的CDNA序列確定APRF蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
在本發(fā)明中,哺乳動物的實(shí)例是人、小鼠、大鼠等。雖然在相同的種中,但根據(jù)生產(chǎn)的組織或細(xì)胞也可以產(chǎn)生其中有某些氨基酸被取代,缺失或插入的APRF。本發(fā)明也包括上述亞類APRF。
本發(fā)明包括作為一個(gè)實(shí)施方案的人APRF。本發(fā)明具體包括具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽、其同系物,其片段。
本發(fā)明提供了編碼上述人APRF的DNA。本發(fā)明還提供具有SEQ ID NO.2和3所示核苷酸序列的DNA可與所述DNA和其片段雜交的DNA。
特別是,根據(jù)發(fā)明有提供(1)具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽,(2)編碼上述(1)多肽的DNA,(3)具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的DNA,和
(4)具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的DNA,為實(shí)施方案。
本發(fā)明包括作為實(shí)施方案的小鼠APRF。具體地說,本發(fā)明包括具有SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的多肽,其同系物和其片段。
此外,本發(fā)明還提供編碼所述小鼠APRF多肽的DNA。具體地說,提供分別具有SEQ ID NO.6或7所示核苷酸序列的DNA,可與所述核苷酸和其片段雜交的DNA。
特別是,根據(jù)本發(fā)明提供(5)包括SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的多肽(6)編碼上述(5)多肽的DNA(7)具有SEQ ID NO.6所示核苷醇序列的DNA,和(8)具有SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的DNA,為實(shí)施方案。
在本發(fā)明說明書中,具有SEQ ID NO.1或5所示氨基酸序列的(1)和(5)中所述多肽,不僅包括具有SEQ ID NO.1或5所示氨基酸序列的多肽(天然成熟蛋白質(zhì)),也包括在其N-或C-末端增加了適當(dāng)?shù)牟煌陌被峄蛏儆?0%的SEQ ID NO.1或5所示全部氨基酸的氨基酸序列,優(yōu)選的是少于5%的氨基酸序列的多肽,以及包括下文所述的其同系物和片段的衍生物(其中改變(缺失,其他氨基酸序列的取代,加入其他氨基酸序列,插入等)了與功能無關(guān)的氨基酸或氨基酸序列),假設(shè)它們具有等同的生物和藥物學(xué)特性。
SEQ ID NO.1或5的多肽同系物一般是一個(gè)大于至少有100,優(yōu)選的至少150,例如200,250或300個(gè)連續(xù)氨基酸的區(qū)域,且至少70%,優(yōu)選的至少80或90%并最好至少95%同源于SEQ ID NO.1或5所示多肽。下文將稱上述多肽同系物為本發(fā)明多肽。
此外,本發(fā)明的多肽片段至少是10,優(yōu)選的至少15,例如20,25,30,40,50或60個(gè)氨基酸長,并也為下文所用術(shù)語“本發(fā)明多肽”所包括。
除具有SEQ ID NO.1或5所示氨基酸序列的多肽外的多肽和本發(fā)明所述的其片段,具有等同于SEQ ID NO.1或5所示氨基酸序列的多肽的生理學(xué)和藥理學(xué)特性。因此,本發(fā)明不僅提供具有SEQ ID NO.1或5所示氨基酸序列的多肽,而且提供具有等同生理學(xué)或藥物學(xué)特性的同源多肽。
可以與SEQ ID NO.2,3,6或7所示DNA雜交的DNA有不只一個(gè)至少100,優(yōu)選的至少150,例如200,250,或300個(gè)連續(xù)核苷酸序列的區(qū)域,且至少70%,優(yōu)選的至少80或90%,而且最好至少95%同源于SEQ ID NO.2,3,6或7所示的DNA。下文稱上述DNA同系物為本發(fā)明的DNA。
本發(fā)明的DNA片段指核苷酸部份含至少10,優(yōu)選的15,如20,25,30或40個(gè)本發(fā)明DNA的核苷酸,并且上述片段等同于本發(fā)明的DNA。
本發(fā)明的DNA(在(2)或(6)中說明的)包括編碼SEQ ID NO.1或5所示多肽的一組核苷酸序列。
正如熟知的,有一到六種密碼子編碼一種氨基酸(如,已知蛋氨酸(Met)是一種密碼子。而亮氨酸(Leu)有六種密碼子)。
可圖示說明編碼SEQ ID NO.1或5所示氨基酸序列的代表性核苷酸序列,SEQ ID NO2,3,6或7所示的核苷酸序列。本發(fā)明的DNA包括選擇隨意密碼子而不改變所編碼的氨基酸序列的DNA。通過改變核苷酸序列,有可能提高多肽的產(chǎn)率。
(3)或(7)中說明的DNA分別是(2)或(6)所示DNA的實(shí)施方案,并且是天然形式的序列。
(4)和(8)所示的DNA表示(3)或(7)中定義的帶非轉(zhuǎn)譯區(qū)的DNA序列。
可以用已知方法,如基因重組、化學(xué)合成法等制備本發(fā)明的DNA(包括其片段,下文中相同)。在下列實(shí)施例中詳細(xì)說明制備方法。例如,可以按下列方法制備具有SEQ ID NO.3和7中所示核苷酸序列的DNA,即(ⅰ)從生產(chǎn)本發(fā)明多肽的細(xì)胞中分離mRNA,(ⅱ)從由此得到的mRNA制備第一條鏈(單鏈RNA),然后制備第二條鏈(雙鏈DNA)(合成cDNA),(ⅲ)將由此得到的CDNA插入適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體中,(ⅳ)用由此得到的重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(制備cDNA文庫)(ⅴ)用雜交方法從cDNA文庫分離含所需DNA的質(zhì)粒,和(ⅵ)確定所需的核苷酸序列。
詳細(xì)地說,用哺乳動物,如人或大鼠,被認(rèn)為表達(dá)APRF的組織優(yōu)選的,可以用肝,巨噬細(xì)胞,胎盤組織細(xì)胞或細(xì)胞系,按Okayama,H等人(在Methods in Enzymology,Vol.154,P3,(1987)中描述的)的方法,或用Chirgwin,J.M.等人(在Biochem.,18,5294(1979)描述的)的方法完成步驟(ⅰ)。
步驟(ⅱ),(ⅲ)和(ⅳ)是制備CDNA文庫的系列步驟,并可按Gubler &Hoffman(Gene,Vol.25,PP263,1983)的方法,經(jīng)輕微改動來完成。作為在步驟(ⅲ)中所用的質(zhì)粒載體的實(shí)例,可以使用已知的許多在E.Coli菌株中發(fā)揮功能的載體(如pBR322)和在枯草芽孢桿菌中發(fā)揮功能的載體(如pUB110),和最好使用在E.coli中發(fā)揮功能的λ-ZAP Ⅱ等。在步驟(ⅳ)中,可以使用任何宿主細(xì)胞,最好用按Gene 96,23,(1990)中描述的方法制備的DH5感受態(tài)細(xì)胞。最近,可以從市場上得到各種動物組織的CDNA文庫。例如,可以從Clontech買到小鼠肝λgt11的CDNA文庫和人胎盤的CDNA文庫。最好用市場上的所述CDNA文庫。
可以用本身已知的方法,如噬菌斑雜交法,菌落雜交法(Gene,10,63(1980))完成步驟(Ⅴ)。其他動物的APRF DNA,其同系物,其片段可作為適當(dāng)?shù)奶结槨?br> 步驟(ⅵ)本身是已知的,可以按雙脫氧終止子法或Maxam-Gilbert的方法完成。
一旦確定了SEQ ID NO.2,3,6和7中所示的核苷酸序列,可用化學(xué)合成法,PCR法或利用本發(fā)明的DNA片段為探針的雜交法得到本發(fā)明的DNA。此外,將插入本發(fā)明的DNA的載體DNA轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)乃拗髦?,然后培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體,可以得到所需量的本發(fā)明DNA。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供含本發(fā)明DNA的復(fù)制和表達(dá)載體。所述載體可以是帶復(fù)制原點(diǎn),以及選擇性地含有表達(dá)所述DNA的啟動子和啟動子調(diào)節(jié)子的例如質(zhì)粒,病毒或噬菌體載體。該載體可含一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記基因,如氨芐青霉素抗性基因。
本發(fā)明還提供由用于復(fù)制和表達(dá)本發(fā)明DNA的載體(包括含其開放閱讀框架的DNA SEQ ID NO.2,3,6或7)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。在轉(zhuǎn)化中使用的宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌、酵母、昆蟲或哺乳動物的細(xì)胞。可用通常所用的各方法完成轉(zhuǎn)化。
在有效表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體細(xì)胞可以表達(dá)(生產(chǎn))和積累本發(fā)明的多肽(包括其片段下文中相同)。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞,培養(yǎng)條件也是熟知的。利用所述多肽的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性,可以用常規(guī)的分離方法分離并純化所述轉(zhuǎn)化體細(xì)胞生產(chǎn)并積累的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的所需多肽。因此,可以以工業(yè)規(guī)模制備本發(fā)明的多肽,即APRF。因而,本發(fā)明還提供用基因重組制備多肽APRF的方法。
可以通過(1)從培養(yǎng)細(xì)胞中分離和純化,(2)化學(xué)合成,或(3)基因重組優(yōu)選的,通過(3)中描述的用于工業(yè)化的方法制備本發(fā)明的多肽(如SEQ ID NO.1或5中所示的)。
更優(yōu)選的用如下的表達(dá)系統(tǒng)(宿主-載體系統(tǒng))用基因重組制備本發(fā)明的多肽。
例如,通過將編碼蛋白質(zhì)的DNA(如具有SEQ ID NO.2或6所示核苷酸序列的DNA)連接至適當(dāng)啟動子(如trp啟動子,lac啟動子,λPL啟動子,T7啟動子等)的下游,然后插入在E.coli菌株中發(fā)揮作用的載體(如pBR322,pUC18,pUC19等)之中以制備表達(dá)載體,從而完成在E.coli中的表達(dá)。
然后,可以在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)用由此得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的E.coli菌株(如E.coli DH1菌株E.coli JM 109菌株,E.coli HB101菌株)以得到所需的多肽。若利用細(xì)菌的信號肽,也可在外周胞質(zhì)中產(chǎn)生所需的多肽。此外,也很容易生產(chǎn)與其他多肽的融合蛋白。
另外,通過將SEQ ID NO.3或7中所示的DNA插入適當(dāng)載體(如反轉(zhuǎn)錄病毒載體,乳頭瘤病毒載體,牛痘病毒載體,SV40載體等)中的適當(dāng)啟動子(如,SV40 啟動子,LTR啟動子,金屬硫蛋白啟動子等)的下游,以得到表達(dá)載體,用由此得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)牟溉閯游锛?xì)胞(如猴COS-7細(xì)胞,中國倉鼠CHO細(xì)胞,小鼠L細(xì)胞等),然后在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體以便在該培養(yǎng)基內(nèi)得到所需的多肽,從而完成在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)。
如上所述,通過在核內(nèi)結(jié)合IL-6誘導(dǎo)基因的特定DNA部分,本發(fā)明的多肽,即轉(zhuǎn)錄因子APRF具有調(diào)節(jié)與細(xì)胞內(nèi)信號傳送有關(guān)的轉(zhuǎn)錄的功能。因此,APRF可用于如闡明由于IL-6的作用誘導(dǎo)的疾病病理,用于研究或研制用于治療所述疾病的所述抑制劑。
利用本發(fā)明,可以完成尋找并確定抑制APRF作用的物質(zhì)。本發(fā)明還提供用于尋找抑制APRF功能的物質(zhì)的篩選方法。
APRF的功能包括其自身的磷酸化,傳遞到核內(nèi),與DNA結(jié)合。所述的抑制指對至少一種上述APRF功能的抑制。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)APRF存在于特定細(xì)胞內(nèi),當(dāng)IL-6作用于細(xì)胞時(shí),通過磷酸化而被激活。已知當(dāng)該因子被磷酸化后,轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入核內(nèi),然后與特定的DNA序列結(jié)合。因此,通過抑制磷酸化階段,或向核內(nèi)的傳遞或APRF的自身表達(dá)階段等,可達(dá)到抑制目的。
再者,本發(fā)明還提供含APRF功能抑制劑為活性成分的藥劑。
上述活性成分包括,例如,具有含SEQ ID NO.1或5的氨基酸序列的多肽,其同系物,其片段,從所述多肽的同系物或片段免疫過的哺乳動物中得到的抗體,可結(jié)合APRF的核酸或其衍生物,APRF基因的反義核酸,含反義核酸的表達(dá)載體,可降解APRF的mRNA的核糖酶(ribozyme)
可以很容易地用常規(guī)方法,如根據(jù)APRF的氨基酸序列合成作為合適免疫原的肽或本發(fā)明施用該肽免疫動物來制備抑制APRF功能的APRF抗體。
上述得到的抗體是有用的APRF功能抑制劑,并且對于了解APRF本身在細(xì)胞或活體中的行為也是很重要的??梢园此隹贵w的識別部分設(shè)計(jì)低分子的APRF抑制劑。本發(fā)明包括所述的低分子APRF抑制劑。
為了抑制APRF的功能,將APRF基因本身的反義核酸或用所述反義核酸轉(zhuǎn)染的適當(dāng)表達(dá)載體施用于細(xì)胞或活體??梢杂盟龅姆戳x核酸或含所述反義鏈的表達(dá)載體作為本發(fā)明APRF功能抑制劑的活性成分。
另外,降解本發(fā)明APRF mRNA的核糖酶也抑制APRF的功能,因此,也可用核糖酶作為APRF功能抑制劑的活性成分。
可以用經(jīng)基因重組方法部分修飾的APRF蛋白質(zhì)或其衍生物互補(bǔ)或抑制APRF在細(xì)胞或活體內(nèi)的功能。將經(jīng)基因重組方法部分修飾的APRF基因或其基因衍生物施用于細(xì)胞或活體可達(dá)到相同的目的。
本發(fā)明還提供含抑制本發(fā)明APRF功能的抑制劑的抑制藥劑。可以以使其在細(xì)胞或活體內(nèi)發(fā)揮功能的適當(dāng)劑型(施用形式)施用所述的抑制藥劑。例如,可將該藥劑制成脂質(zhì)體等,在其表面進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎椧允够钚猿煞直恢苯訑z入核內(nèi),也可根據(jù)劑型從適當(dāng)?shù)耐緩绞┯谩?br> 通過使用本發(fā)明的抑制劑,找到了治療由IL-6誘導(dǎo)的疾病的新方法。
APRF是本發(fā)明人最新分離并測定的一種與IL-6的細(xì)胞內(nèi)信號傳送有關(guān)的蛋白質(zhì)。另一方面,在某些情況下,一種特定的轉(zhuǎn)錄因子還涉及其他生物活性物質(zhì)的信號傳遞。因此,APRF的抑制作用不僅可用于IL-6誘導(dǎo)的疾病,也可用于由其他生物活性物質(zhì)誘發(fā)的疾病,其中APRF介導(dǎo)信號傳遞。本發(fā)明人獨(dú)立發(fā)現(xiàn)實(shí)際上,APRF的磷酸化作用是由除IL-6外的其他細(xì)胞激活素,如制瘤素M,白血病抑制因子,白細(xì)胞介素11,睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子等誘導(dǎo)的。也可用本發(fā)明有的APRF功能抑制藥劑治療由所述細(xì)胞激活素誘導(dǎo)的疾病。
實(shí)施例下列實(shí)施例詳細(xì)具體地說明但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1APRF的分離從施用人IL-6并在施用后15分鐘殺死的小鼠肝的核提取物中分離APRF。
(1)分離核提取物用稍微改動的Wegenka,U.M.等人(Mol.Cell. Biol.,13,276(1993))的方法制備核提取物。
給小鼠靜脈內(nèi)施用人IL-6(5μg/小鼠),并在施用15分鐘后殺死。立即將小鼠肝免疫接種到含1mM原釩酸鹽的冰冷HANKS溶液中。然后用在冰上發(fā)動機(jī)驅(qū)動的Teflonglass均漿器、經(jīng)20個(gè)循環(huán)將勻漿緩沖液中的肝勻漿,所述勻漿緩沖液含10mMHEPES(PH7.6),0.5mM亞精胺,0.15mM精胺,25mM KCl,1mM EDTA,1mM EGTA,1mM二硫蘇糖醇(DTT),1mM苯基甲基磺基氟化物(PMSF),10%含0.3M蔗糖的甘油(每個(gè)肝3ml)。
勻漿前加入抑肽酶(10μg/ml),亮肽素(2μg/ml),胃蛋白酶抑制素(2μg/ml)和1mM原釩酸鹽。將核置于含2M蔗糖的均漿緩沖液中勻漿后,用一個(gè)SW28 rotor(Hitachi)以27,000rpm在4℃離心30分鐘分離核。
除去上清液后,將來自10個(gè)肝的核重懸于含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的1mM核提取緩沖液(50mM Tris(PH7.8),420mMKcl,5mM Mgcl2,0.1mM EDTA,2mM DTT,0.5mM PMSF)中。在4℃緩慢攪動30分鐘后,用SW28 rotor以27,000rpm將混合物離心30分鐘,然后使上清液在含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的透析緩沖液(20mM HEPES.(PH7.8),50mMKCl,12.5mM Mgcl2,1mM EDTA,1mM DTT,1mM PMSF,0.1 Nonidet P-40(BDH Laboratory),20%甘油)中透析。將提取物離心以除去不溶的沉淀。
(2)分離APRF將在(1)中制備的核提取物(從3000個(gè)小鼠肝中得到的)在存在鮭精DNA(200μg/ml)的情況下,與含高親和APRF結(jié)合位點(diǎn)寡核苷酸(5-biothinylated串連的回文APRF一致序列,2XCCTTCCGGGAATTC)的抗生蛋白鏈菌素共軛的順磁珠(Dynabeads M-280抗生蛋白鏈菌素,Dynal)在4℃溫育30分鐘。
用洗滌溶液(20mM HEPES(PH7.9),1mM EDTA,5mM MgCl2,0.05% Np-40,10%甘油)粗略洗滌結(jié)合的蛋白質(zhì),然后用含1MKCl的洗滌溶液洗脫。立即用洗滌溶液稀釋洗脫液,再與帶APRF結(jié)合位點(diǎn)的磁珠一起溫育。
三個(gè)循環(huán)的DNA親和層析后,用SDS-PAGE分離洗滌物。純化的產(chǎn)物含95kd多肽(主帶),85kd和75kd多肽(次帶)。所有蛋白質(zhì)均在酪氨酸殘基被磷酸化。在未用IL-6處理的細(xì)胞提取物中檢測不到所述蛋白質(zhì)。
從凝膠上洗脫95kd的磷蛋白帶,用10%(v/v)三氯乙酸沉淀,用丙酮洗滌,并溶解于含8M脲和10mM Tris,PH9.0的緩沖液中。用賴氨?;鶅?nèi)肽酶將該蛋白質(zhì)在37℃消化6小時(shí)。通過使用在1mm×25cm PP-300柱(Applied Biosystems提供)上的0.1%(V/V)三氟乙酸和乙腈梯度的反相高壓液體層析分離所得的肽。
收集分離的肽并通過在Applied Biosystems Model 477A測序儀上的自動Edman降解定序。確定了所述肽的氨基酸序列。下文稱該片段為肽3。
Thr Gln Ile Gln Ser Val Glu Pro Tyr實(shí)施例2APRF的CDNA克隆用-來自肽3的簡并寡核苷酸5′-AC(AGCT)CA(AG)AT(ACT)CA(AG)TC(AGCT)GT-3′和-λgt11載體反引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增來自小鼠肝λgt11 CDNA文庫(CLML 1035b;Clontech)的一份噬菌體模板DNA,得到含特有DNA序列的PCR產(chǎn)物,所述序列編碼肽3提取物的氨基酸序列。用94℃1分鐘,55℃1分鐘,72℃2分鐘為一循環(huán),完成30個(gè)循環(huán)的PCR。
證實(shí)將上述擴(kuò)增的CDNA亞克隆至PT7 Blue T載體(Novagen)中得到了具有正確肽3氨基酸序列的PCR產(chǎn)物。
用PCR產(chǎn)物為探針,經(jīng)噬菌斑雜交分別篩選到約1.5×106個(gè)小鼠肝噬菌斑和巨噬細(xì)胞λgt 11 CDNA文庫(受讓于Dr.Shigekazu Nagata of Osaka Bioscience Laboratory)。
在添加了5×Denhardt′s溶液(0.1%Fico11,0.1%聚乙烯基吡咯烷酮和0.1%牛血清白蛋白)和0.5%SDS(十二烷基硫酸鈉)的6×SSC中,于65℃雜交反應(yīng)15小時(shí)。用含1%SDS的2×SSD,在65℃洗滌濾器二次,每次30分鐘。
分離陽性克隆并進(jìn)行序列分析。通過用雙鏈的雙脫氧鏈終止法分析CDNA的核苷酸序列。
所述陽性菌落經(jīng)分析為具有2310bp(SEQ ID NO.6所示)開放閱讀框架的小鼠APRF的全長CDNA克隆。
所述全長核苷酸序列示于SEQ ID NO.7。從開放閱讀框架推測的氨基酸序列列于SEQ ID NO.5。
用相同的探針和相同的條件,通過篩選人胎盤CDNA文庫(CLHL 1008b;Clontech)分離人APRF的CDNA。
全長核苷酸序列和開放閱讀框架核苷酸序列分別列于SEQ ID NO.3和2。從開放閱讀框架推測的氨基酸序列列于SEQ ID NO.1。
實(shí)施例3Northern印跡分析用氯化銫梯度法從小鼠組織制備總RNA。用Oligo-dT Latex(Oligotex-dT30,Roche)純化Poly(A)+RNA。使3μg的poly(A)+RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,然后將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜(HybondPlus;Amersham)上。對于人組織,從Clontech買-RNA印跡膜(Human Multiple Tissue Northern Blot)。
將膜與放射標(biāo)記的DNA探針雜交,所述探針分別含小鼠樣品小鼠APRF的核苷酸806-1200,人樣品人APRF的核苷酸238-726。洗滌膜,然后干燥并放射自顯影。作為內(nèi)對照,用肌動蛋白探針再與膜雜交。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人(A)姓名KISHIMOTO,TADAMITSU(B)街道3-5-31,Nakanocho(C)城市Tondabayashi-shi,(D)州Osaka(E)國家日本(F)郵編(ZIP)584(ⅱ)發(fā)明名稱轉(zhuǎn)錄因子APRF(ⅲ)序列數(shù)8(2)SEQ ID NO1的資料(ⅰ)序列特征(A)長度770個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1


(2)SEQ ID NO2的資料(ⅰ)序列特征(A)長度2310個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型mRNA的CDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2


(2)SEQ ID NO3的資料(ⅰ)序列特征(A)長度2787個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型mRNA的CDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3


(2)SEQ ID NO4的資料(ⅰ)序列特征(A)長度2787個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型mRNA的CDNA(ⅵ)來源(A)生物體Homo Sapiens(F)組織類型胎盤(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置221.2533(C)鑒定方法P(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4




(2)SEQ ID NO5的資料(ⅰ)序列特征(A)長度770個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5



(2)SEQ ID NO6的資料(ⅰ)序列特征(A)長度2310個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型mRNA的CDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6

(2)SEQ ID NO7的資料(ⅰ)序列特征(A)長度2652個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型mRNA的CDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7


(2)SEQ ID NO8的資料(ⅰ)序列特征(A)長度2652個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型mRNA的CDNA(ⅵ)來源(A)生物體小鼠(F)組織類型肝(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置259..2571(C)鑒別方法P(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8




權(quán)利要求
1.實(shí)質(zhì)純化形式的哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子APRF。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的APRF,它來自于人。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的APRF,它選自含SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽,其同系物和其片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的APRF,含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
5.編碼權(quán)利要求1APRF的DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的DNA,它編碼權(quán)利要求2,3或4的APRF。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的DNA,它選自權(quán)利要求6所述具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的DNA,以及能與SEQ ID NO.2雜交的DNA和其片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的DNA,它選自權(quán)利要求6所述具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的DNA,以及能與SEQ ID NO.3雜交的DNA和其片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的APRF,它來自小鼠。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的APRF,它選自含有SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的多肽,其同系物和其片段。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的APRF,它具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求5的DNA,它編碼權(quán)利要求9,10或11的APRF。
13.根據(jù)權(quán)利要求5的DNA,它選自權(quán)利要求12具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的DNA,以及能與SEQ ID NO.6雜交的DNA和其片段。
14.根據(jù)權(quán)利要求5的DNA,它選自權(quán)利要求12具有SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的DNA,以及能與所述DNA雜交的DNA和其片段。
15.一種含權(quán)利要求5到8和12到14任一項(xiàng)的DNA的復(fù)制或表達(dá)載體。
16.用權(quán)利要求15的復(fù)制或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
17.一種生產(chǎn)APRF的方法,包括在有效表達(dá)權(quán)利要求1到4和9到11的APRF的條件下,培養(yǎng)權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞。
18.一種尋找對APRF的功能具有抑制活性的產(chǎn)物的篩選方法,包括使用權(quán)利要求1的APRF。
19.一種抑制藥劑,含有作為活性成分的,對權(quán)利要求1APRF的功能具抑制活性的產(chǎn)物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的抑制藥劑,其中所述產(chǎn)物是權(quán)利要求1的抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的抑制藥劑,其中所述抗體來自用多肽免疫的哺乳動物,所述多肽含SEQ ID NO.1或5所示的氨基酸序列,其同系物或其片段。
22.根據(jù)權(quán)利要求19的抑制藥劑,其中所述產(chǎn)物是能與權(quán)利要求1APRF結(jié)合的核酸或其衍生物。
23.根據(jù)權(quán)利要求19的抑制藥劑,其中所述產(chǎn)物是權(quán)利要求1APRF的反義核酸或含所述反義核酸的表達(dá)載體。
24.根據(jù)權(quán)利要求19的抑制藥劑,其中所述產(chǎn)物是能降解權(quán)利要求1的APRF的mRNA的核糖酶。
全文摘要
哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子APRF,制備它的方法,編碼所述產(chǎn)物的DNA,含所述DNA的復(fù)制和表達(dá)載體,用所述復(fù)制和表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞,尋找APRF功能抑制藥劑的確定和篩選方法以及抗所述APRF功能的抑制藥劑。本發(fā)明的肽可用于補(bǔ)充或抑制APRF的功能,篩選抗APRF功能的抑制藥劑。以本發(fā)明的所述產(chǎn)物為活性成分的抑制劑也可用于治療與細(xì)胞激活素即IL-6有關(guān)的疾病,即炎癥疾病。
文檔編號H01L23/525GK1113517SQ95104590
公開日1995年12月20日 申請日期1995年4月4日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月4日
發(fā)明者審良靜男, 岸本忠三 申請人:岸本忠三
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