專利名稱：減毒型牛病毒性腹瀉病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過使病毒基因組中一個特定基因失活而產(chǎn)生減毒型牛病毒性腹瀉(BVD)病毒的方法。該減毒型病毒或突變的病毒基因組可用來產(chǎn)生抗BVD病毒抗體或作為疫苗防止牛發(fā)生病毒感染。
牛病毒性腹瀉(BVD)病毒屬于瘟病毒屬和黃病毒類。它與可引起綿羊border病和豬典型性發(fā)熱的病毒密切相關(guān)。被感染的?？杀憩F(xiàn)出“粘膜病”，其特征有體溫升高、腹瀉、咳嗽及消化道粘膜產(chǎn)生潰瘍(Olafson等人，Cornell Vet.36205-213(1946)；Ramsey等人，北美獸醫(yī)學(xué)(North Am.Vet)34629-633(1953))。BVD病毒可穿過孕牛胎盤，導(dǎo)致產(chǎn)生持續(xù)感染的新生小牛(Malmquist美國獸醫(yī)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會雜志(J.Am.Vet.Med.Assoc.188618-619(1986))。這些小牛對病毒發(fā)生免疫耐受，一生都將產(chǎn)生持續(xù)的病毒血癥。這些小牛易爆發(fā)粘膜病(Liess等人，Dtsch.Tieraerztl.wschr.81481-487(1974))并極易受到導(dǎo)致如肺類、腸炎等疾病的微生物感染(Barker等人，獸醫(yī)(Vet.Rec.)117459-464(1985))。
按照帶有兩種不同生物類型將BVD病毒分類。有“cp”生物類型的病毒可誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變，而“ncp”生物類型病毒不具備此效應(yīng)(Gillespie等人，Cornell Vet 5073-79(1960))。另外，已識別兩種主要的基因型(I型和II型)，二者都可產(chǎn)生一系列臨床癥狀(Pellerin等人，病毒學(xué)(Virology)203260-268(1994)；Ridpath等人，病毒學(xué)，20566-74(1994))。
BVD基因組長約12.5kb，含有一個開放閱讀框架，該框架位于5’和3’非翻譯區(qū)(NTR)之間(Collet等人，病毒學(xué)165191-199(1988))。從該框架可翻譯約438KD的多聚蛋白，并在細(xì)胞和病毒蛋白酶作用下將其加工成病毒的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白(Tautz等人，病毒學(xué)雜志(J.virol)715415-5422(1977)；Xu等人，病毒學(xué)雜志，5312-715322(1977)；Elber等人，病毒學(xué)雜志，704131-4135(1996)；和Wiskerchen等人，病毒學(xué)184341-350(1991)。參與該加工的病毒酶系有Npro和NS3蛋白酶。Npro是病毒開放閱讀框架編碼的第一個蛋白，可將自身從其余合成的多聚蛋白中切除(Stark等人，病毒學(xué)雜志677088-7093(1993)；Wiskerchen等人，病毒學(xué)654508-4514(1991))。
現(xiàn)有的BVD疫苗中的病毒是用化學(xué)方法滅活的(Mcclukin等人，Arch.Virol.58119(1978)；Fernelius等人，美國獸醫(yī)研究雜志(Am.J.Vet.Res.)331421-1431(1972)；和Kolar等人，美國獸醫(yī)學(xué)研究雜志，331415-1420(1972)。一般需多次劑量給予這些疫苗以產(chǎn)生初級免疫，所產(chǎn)生的免疫效應(yīng)作用短暫且不能防止胎體感染(Bolin，Vet.Clin.North.Am.Food Anim.Pract.11615-625(1995))。曾有報(bào)道在綿羊中制備出以純化的E2蛋白為基礎(chǔ)的亞基疫苗(Bruschke等人，疫苗(vaccine)151940-1945(1997))。但是，只有一種此類疫苗可保護(hù)胎體免受感染，且該保護(hù)僅僅針對一株同源病毒?？贵w效價與抗病毒感染力之間沒有聯(lián)系。
另外，可用BVD病毒來獲得修飾過的活病毒(MLV)，通過在牛或豬細(xì)胞中反復(fù)傳代(Coggins等人，Cornell Vet 51539(1961)；和Pillips等人，美國獸醫(yī)研究雜志，36135(1975))或用化學(xué)誘變產(chǎn)生溫度敏感的病毒表型達(dá)到使BVD病毒減毒之目的(Lobmann等人，美國獸醫(yī)研究雜志，452498(1984)和(Lobmann等人，美國獸醫(yī)研究雜志47557-561(1986))。已證明單次劑量MLV疫苗在經(jīng)接種的牛體內(nèi)足以產(chǎn)生免疫效應(yīng)，維持期可以是數(shù)年(Coria等人，Can.J.Con.Med.42239(1978))。另外，有報(bào)道表明MLV型疫苗接種的小?？僧a(chǎn)生交叉保護(hù)效應(yīng)(Martin等人，動物疾病研究者大會論文(Proceedings of the Conference Res.Workers’Anim.Dis，)75183(1994))。但是，使用這些疫苗有一主要問題就是安全性問題，比如病毒可能會轉(zhuǎn)移到胎體(Bolin，Vet.Clin.North Am.Food Amim.Pract 11615-625(1995))。
顯然需要新的有效疫苗控制BVD病毒的傳播?？紤]到該病毒所致疾病是牛群中傳播性最強(qiáng)、也最影響經(jīng)濟(jì)價值的疾病之一，此類疫苗在畜牧業(yè)中有重要意義。
本發(fā)明建立在下述發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上，該發(fā)現(xiàn)是使Npro蛋白酶基因缺失或失活可得到減毒型BVD病毒。在牛細(xì)胞系中這些病毒比相應(yīng)野生型病毒的感染力小得多，適于用作牛疫苗。在此公開了一個此類減毒病毒的全部基因組序列，以保藏號ATCC 203354號于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)保藏一種可編碼該病毒的質(zhì)粒即p BVDdN1。A.以BVDdN1減毒病毒為基礎(chǔ)的組合物和方法首先一個方面，本發(fā)明是以研究一種特定減毒BVD病毒株為基礎(chǔ)的。野生型病毒基因組突變?nèi)笔pro蛋白酶基因后得到該株，其全長序列見SEQ ID NO1和圖2自第39～12116核苷酸所示。因此，本發(fā)明涉及一種病毒，該病毒基因組包括如所示序列并優(yōu)選為基本上由所示序列組成。一般地，BVD具有RNA形式的病毒基因組。克隆后一般形式為DNA。除非特別指出，術(shù)語“核酸”指BVD病毒DNA和RNA序列。方便起見，序列表只列出DNA序列，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言相應(yīng)RNA序列不難推及。術(shù)語“基本上由…組成”是指基本上與結(jié)構(gòu)和功能均已明確的序列一樣的序列。因此，本發(fā)明不僅包括明確表述的序列，也包括增加有非必需序列或?qū)敕潜匦枞〈蛄械南鄳?yīng)序列。具體地，本發(fā)明包括編碼與SEQ ID NO1相同的BVD蛋白的簡并核酸序列。方便起見，該序列，即SEQ ID NO1自第39～12116核苷酸，及其編碼的相應(yīng)病毒被稱為“BVDdN1”基因組和病毒。病毒可以是較粗制品的一部分，也可以基本上為純化形式，即基本上無任何其它病毒類型的形式。
本發(fā)明包括攜帶有本發(fā)明中BVDdN1核酸分子的宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括任何帶有BVDdN1核酸分子的原核細(xì)胞，及任何感染過病毒或帶有BVDdN1核酸分子的真核細(xì)胞。原核細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌(E.Coli)的STBL2株(GibcoBRL)擴(kuò)增質(zhì)粒效果最佳，一般優(yōu)選該菌株。真核細(xì)胞中哺乳動物細(xì)胞的MDBK細(xì)胞(ATCC CCL-22)和RD細(xì)胞(穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的牛睪丸細(xì)胞)一般為優(yōu)選。然而也可用其它培養(yǎng)的細(xì)胞。本發(fā)明還包括此類宿主細(xì)胞產(chǎn)生的子代病毒。
可用有效劑量BVDdN1病毒感染動物誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗體，該有效劑量是指可刺激抗體產(chǎn)生的足夠劑量。正常用于此目的的任何動物類型(如小鼠、免、山羊、綿羊)都可產(chǎn)生此抗體，但優(yōu)選在牛體內(nèi)產(chǎn)生該抗體。在此所用的術(shù)語“抗BVD病毒抗體”是指與BVD病毒株的親和力比任何其它非BVD病毒株高至少100倍的抗體。盡管非優(yōu)選，還可在將病毒注入動物之前進(jìn)行化學(xué)處理滅活病毒，包括如福爾馬林、多聚甲醛、苯酚、乳丙酸鹽、補(bǔ)骨脂素、鉑復(fù)合體、臭氧或其它雜病毒劑。這些方法產(chǎn)生的抗體本身屬于本發(fā)明范圍內(nèi)，可以用該領(lǐng)域已熟知的方法分離出抗體(見如Harlow等人，抗體實(shí)驗(yàn)手冊(AntibodieoA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1988))?？砂言摽贵w用于檢測生物或?qū)嶒?yàn)室樣本中的BVD的方法中。
另一方面，本發(fā)明涉及包含BVDdN1病毒和獸醫(yī)可接受的載體的一種疫苗。該疫苗可包含一般用于該制品的任何佐劑及其它試劑。一定劑量下給牛施用該疫苗可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，此劑量應(yīng)足以誘導(dǎo)產(chǎn)生針對其后BVD病毒感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)。一般地，用非腸道途徑施用疫苗，但其它給藥方式也適合本發(fā)明。需要的話，定期如每隔2至8周進(jìn)行兩次或多次接種?？捎帽绢I(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法優(yōu)化免疫步驟。B以BVDdN1基因組核酸為基礎(chǔ)的組合物和方法近來的工作表明，將編碼免疫原的核酸注入動物體內(nèi)來制備有效的疫苗是可能的。制備和施用這些“DNA疫苗”的方法已有詳述(見如美國專利第5,589,466、5,580,859和5,703,055號專利)，而且可用于BVDdN1基因組核酸。因此，另一方面，本發(fā)明涉及一種核酸分子，優(yōu)選為基本上純的形式，該分子包括SEQID NO1中自第39至12116核苷酸之間的序列，或其簡并的變異體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種核酸分子，優(yōu)選基本上純的形式，該分子基本上由SEQ IDNO1中自第39至12116核苷酸之間的序列組成。如此處所述，“基本上純的”是指所需產(chǎn)物基本上無雜質(zhì)。例如，一種“基本上純的”的核酸分子是指樣品中基本上無其它雜質(zhì)核酸分子，而且一般包括至少85％(重量)該核酸分子，優(yōu)選更高的百分比。測定核酸純度的一個方法是將制備物在基質(zhì)如聚丙烯酰胺或瓊脂糖中電泳。染色后若只出現(xiàn)單一區(qū)帶則證明該分子是純的。其它分析純度的方法包括色譜法及分析離心。
可將BVDdN1基因組核酸作為獨(dú)立密碼元件連接到載體上。短語“獨(dú)立的密碼元件”指可翻譯成病毒多肽且最終成為病毒的該載體上的一部分。它的獨(dú)立在于它不包括任何其它可實(shí)質(zhì)上改變BVDdN1產(chǎn)物的翻譯元件。可用該載體，或BVDdN1核酸本身轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞以獲得減毒的子代病毒。
本發(fā)明還包括誘導(dǎo)抗BVD抗體產(chǎn)生的方法，該方法是通過將BVDdN1核酸或含有該核酸的載體直接注射入動物中?？捎媚墚a(chǎn)生抗體的任何動物，一般優(yōu)選牛。此法制備的抗體屬于本發(fā)明的一部分，而且可自動物中純化并用于，如檢測培養(yǎng)基或生物液體中是否存在BVD病毒的方法中。
在BVDdN1基因組核酸的基礎(chǔ)上結(jié)合獸醫(yī)可接受的載體可制備施用于牛的疫苗(見上述引用的參考文獻(xiàn))，在優(yōu)化的免疫方案中用其誘導(dǎo)產(chǎn)生抗繼后病毒感染的保護(hù)性免疫。C野生型BVD基因組突變方法大體上，本發(fā)明涉及一種方法，以修飾來自基本上純的野生型BVD病毒的基因組使之適于用作疫苗。此處所用術(shù)語“基本上純”是指病毒制品，其優(yōu)選地由單一BVD病毒株組成而無其它類型病毒存在。本方法主要突出的特點(diǎn)是使基因組突變以失活Npro蛋白酶基因。本文中，如果沒有產(chǎn)物產(chǎn)生(如基因缺失)，或產(chǎn)生的產(chǎn)物不再能行使正常生物功能(如蛋白水解切割)，或產(chǎn)生的產(chǎn)物雖有正常生物功能但效率明顯下降的話，均被視為基因失活?？墒褂玫哪苁筃pro蛋白酶失活的任何方法。例如，用標(biāo)準(zhǔn)方法從野生型BVD病毒分離出基因組RNA，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA后進(jìn)行克隆。再用一些方法使Npro蛋白酶基因引入突變，比如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、定點(diǎn)突變方法、合成及連接DNA片段以使Npro部分或全部消除、或隨機(jī)誘變技術(shù)包括，如接觸本領(lǐng)域已知的化學(xué)誘變劑或射線，或者這些方法的組合。
一旦修飾BVD病毒基因組使Npro基因失活，可將其克隆到合適的載體上并大量擴(kuò)增。如上所述，載體應(yīng)含有BVD序列，該序列作為一獨(dú)立元件包含突變的野生型病毒序列，或基本上由突變野生型病毒序列組成?？蓪⑼蛔兊腂VD基因組或含有該基因組的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞，用于病毒核酸或病毒本身大量擴(kuò)增。
如上有關(guān)BVDdN1基因組DNA所述，向動物施用由上述方法突變的任何野生型BVD病毒基因組可以獲得抗BVD病毒抗體。一般地，優(yōu)選在牛體內(nèi)產(chǎn)生抗體，但也可使用其它動物。
已獲得包含有突變BVD基因組核酸的疫苗，并按照標(biāo)準(zhǔn)的DNA免疫方法用其在牛體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)(如美國專利第5,589,466、5,580,859和5,703,055號中所述)。用在此談及的方法所得到的疫苗、抗體及核酸均屬于本發(fā)明的一部分。D產(chǎn)生減毒BVD病毒的方法已發(fā)現(xiàn)當(dāng)BVD病毒核酸突變以使Npro蛋白酶基因失活時，可以產(chǎn)生對培養(yǎng)細(xì)胞的感染力大大降低的減毒病毒。這些減毒病毒的復(fù)制速率相對較慢，可使動物以一定方式調(diào)動起其免疫防御機(jī)制，這在迅速增殖的野生型病毒感染的情況中是不可能的。因此，如上所述產(chǎn)生BVDdN1突變病毒基因組的方法直接導(dǎo)致了一種產(chǎn)生減毒BVD病毒的普遍方法，使之適合用作疫苗。大體上該方法包括分離野生型BVD病毒、克隆其基因組核酸、突變克隆的核酸以使Npro蛋白酶基因失活、再將已突變的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入宿主以產(chǎn)生減毒病毒。盡管可使用上面所述可產(chǎn)生突變的任何方法，優(yōu)選使Npro蛋白酶基因全部/部分缺失的方法。
本發(fā)明不僅包括產(chǎn)生減毒病毒的方法，還包括病毒本身、病毒感染的宿主細(xì)胞和這些宿主細(xì)胞產(chǎn)生的子代病毒。用有效劑量的減毒型BVD病毒感染動物，優(yōu)選牛，可以產(chǎn)生針對減毒BVD病毒的抗體。用該方法產(chǎn)生的抗體屬于本發(fā)明的一部分，可分離這些抗體并把其用于診斷或檢測細(xì)胞培養(yǎng)物中的BVD是否存在。
如上述有關(guān)BVDdN1所述，可將特征為Npro蛋白酶基因失活的減毒病毒摻入到疫苗中，用于誘導(dǎo)牛的免疫反應(yīng)。可優(yōu)化劑量與免疫方法以使接種過的動物產(chǎn)生抗繼后病毒感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)。


圖1(A組和B組)A組是質(zhì)粒pVVNADL圖解說明。該質(zhì)粒經(jīng)突變使開放閱讀框架中的第一個基因，即Npro蛋白酶，缺失。產(chǎn)生的突變質(zhì)粒為p BVDdN1，見B組圖解。圖1還顯示了幾個其它基因區(qū)。C代表編碼包裝基因組RNA及形成病毒顆粒的核心結(jié)構(gòu)蛋白的基因。緊接著是編碼三個包膜糖蛋白-E0、E1和E2的基因。P7編碼未知功能的非結(jié)構(gòu)蛋白，緊接著是名為“NS2-插入?yún)^(qū)-NS3”的區(qū)域。NS2編碼含有一個鋅指基序的高疏水性蛋白。NS3為高親水性，是致細(xì)胞病變性BVD病毒的標(biāo)志。ncp病毒在被感染動物體內(nèi)復(fù)制時通過基因重組可轉(zhuǎn)化成cp生物型，該重組過程包括在NS2和NS3編碼區(qū)之間插入附加的病毒或細(xì)胞RNA序列。該重組的結(jié)果是釋放出游離的NS2和NS3蛋白。后者，即NS3，是負(fù)責(zé)多數(shù)非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)加工的蛋白酶。NS4A緊挨NS3，已知其編碼涉及NS3蛋白酶活性的輔因子。緊挨NS4A的是編碼病毒蛋白質(zhì)NS4B和NS5A的兩個基因，蛋白質(zhì)功能未知。最后一個基因是NS5B，編碼RNA依賴的RNA聚合酶，負(fù)責(zé)病毒復(fù)制。B組所示核苷酸序列(SEQ ID NO9)為p BVDdN1起始密碼周圍序列。
圖2所示為質(zhì)粒p BVDdN1的全部核苷酸序列。BVDdN1基因組序列為自第39至12116核苷酸之間的序列。
圖3數(shù)據(jù)顯示了施用BVDdN1病毒后牛體內(nèi)血清轉(zhuǎn)化的情況。A BVDdN1和編碼該病毒的核酸的制備本發(fā)明涉及因缺失Npro蛋白酶基因而被減毒的BVD病毒。該病毒命名為BVDdN1，并且如術(shù)語“減毒”所指，它在易感細(xì)胞系體內(nèi)(如牛睪丸細(xì)胞系(RD)、或牛腎細(xì)胞系(MDBK))中的復(fù)制速率比野生型病毒慢得多。另外，BVDdN1不會在胎牛氣管細(xì)胞(EBTr)或牛鼻甲細(xì)胞(BT-2)中引起產(chǎn)毒性感染，這與野生型病毒感染后可導(dǎo)致產(chǎn)毒性感染形成對比。BVDdN1病毒在不同的牛細(xì)胞系中的緩慢生長，提示其在動物中組織趨向性減毒作用廣泛。BVDdN1遺傳穩(wěn)定，在牛RD細(xì)胞系中傳至10代仍能保持Npro缺失。盡管自然界中病毒基因組為RNA，可以將其逆轉(zhuǎn)錄后再進(jìn)行克隆。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處提及的核酸和BVD病毒序列不僅包括自病毒RNA序列逆轉(zhuǎn)錄而來的DNA序列，也包括相應(yīng)的RNA本身。
BVDdN1病毒基因組的完整核苷酸序列見SEQ ID NO1中自第39至12116核苷酸所示。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不僅包括如所示精確序列的病毒基因組，也包括與之結(jié)構(gòu)或功能基本上沒有差異的其它序列，包括如建立在遺傳密碼簡并性基礎(chǔ)上編碼與SEQ IDNO1所示的BVD蛋白質(zhì)相同的序列。另外，例如，可以用已熟知的技術(shù)如定點(diǎn)誘變使核酸結(jié)構(gòu)中引入變異。用此法或類似方法或用本領(lǐng)域已知的隨機(jī)誘變法產(chǎn)生的BVD病毒核酸序列的突變也屬于本發(fā)明，前提是所產(chǎn)生的病毒至少保留一個基本上與其所衍生自的病毒相同的主要生物特性。具體地，基本不改變BVDdN1之感染特性的突變均落入本發(fā)明的范圍。
突變的BVDdN1突變核酸來自國家動物疾病實(shí)驗(yàn)室(NADL)的BVD株，該株獲自ATCC(VR-534)。將其連接到載體上再用如下述實(shí)施例中所示的選擇性PCR和再連接法使全長Npro蛋白酶基因缺失。盡管可用該方法獲得病毒基因組及最終病毒本身，已將含有完整BVDdN1基因組序列的名為BVDdN1的質(zhì)粒保藏于ATCC，保藏號203354。該質(zhì)粒為分離過程中的優(yōu)選來源?？捎脴?biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增和純化質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染入可維持病毒生產(chǎn)的宿主細(xì)胞。用于質(zhì)粒擴(kuò)增的原核宿主細(xì)胞優(yōu)選大腸桿菌STBL2細(xì)胞(來自Gioco BRL)，但也可使用其它細(xì)胞類型?？梢栽谡婧思?xì)胞如RD或MDBK細(xì)胞中制備病毒，再用已知分離方法如蔗糖梯度離心以其高純化形式從中分離出來，以用作疫苗或用來產(chǎn)生抗體。另外，質(zhì)?？捎糜诜蛛xBVDdN1基因組序列，這可直接用于產(chǎn)生抗體或用于疫苗。B其它減毒BVD病毒株的制備可將產(chǎn)生BVDdN1病毒和基因組核酸的基本方法同樣用于其它BVD野生病毒株。每種情況下，分離出野生型病毒，使Npro蛋白酶基因失活而達(dá)到減毒目的。優(yōu)選用如此處用于BVDdN1的以PCR為基礎(chǔ)的方法，使整個基因缺失而達(dá)到減毒目的。但也可用其它使基因失活的方法，如使序列部分缺失，或者隨機(jī)或于特定位置引入突變。所有情況下，目的是產(chǎn)生感染后低速增殖的突變病毒。如實(shí)施例部分所述，可用免疫組化的方法用特異性針對BVD病毒的單克隆抗體體外測定病毒的感染性。C抗BVD減毒型病毒的抗體的制備可在一般用來產(chǎn)生抗體的任何一種動物中制備抗BVD病毒抗體，包括如小鼠、免等。但優(yōu)選在牛體內(nèi)產(chǎn)生抗體。用任意途徑給予動物含有病毒的組合物，但一般途徑為肌肉注射、皮下注射或靜脈給藥注入動物?？傮w上，病毒制劑包括一種佐劑如弗氏完全或不完全佐劑。有關(guān)注射用合適制劑、注射方法等等在本領(lǐng)域已熟知，可以使用之(見如Harlow等人，抗體實(shí)驗(yàn)手冊.Coldspring Harbor Lab.N.Y.(1988)；Klein，免疫學(xué)自身-非自身識別科學(xué)(Immunology；The Science of self-Nonself Discrimination(1982))。也可用標(biāo)準(zhǔn)方法制備單克隆抗體(Kennett等人單克隆抗體與雜交瘤生物學(xué)分析新思維(Monoclonal Antibodies andHybridomasA New Dimension in Biological Analyses)(1980)；Campell “單克隆抗體技術(shù)”(Monoclonal Antibody Technology)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology)(1984)。
可將特異性針對BVD病毒(即與BVD親和力比其它類型病毒至少大100倍)的抗體或抗體片段用于任何免疫學(xué)分析。例如，在放射免疫分析或免疫測量分析中(又名“兩位點(diǎn)”或“三明治”分析)，用該抗體檢測BVD病毒(見Chard“放射免疫分析及有關(guān)技術(shù)介紹”(An Introduction to Radioimmune Assay and RelatedTechniques)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，North Holland出版有限公司.N.Y.(1978)。在一般的免疫測量分析中，一定數(shù)量的未標(biāo)記抗體結(jié)合到固體支持物上，該支持物在待測液體如血液、淋巴、細(xì)胞抽提物等中是不溶的?？乖_始結(jié)合到固定的抗體上后，加入一定量可檢測的第二種抗體(可與第一種抗體相同，也可不同)以檢測及/或定量抗原(例如見放射免疫方法(RadioimmuneAssay Methods)Rirkham等人編輯199-206頁。E & SlivingstoneEdinburgh(1970)。本領(lǐng)域已知許多有關(guān)此類分析的不同方法，可將之用于檢測BVD病毒。D常規(guī)疫苗(制備)和接種方法許多文獻(xiàn)討論過利用BVD病毒的疫苗制備與接種方法(如見Fennelius等人，美國獸醫(yī)研究雜志，331421-1431(1972)；Kolar等人，美國獸醫(yī)研究雜志331415-1420(1972)；McClurkin等人，病毒學(xué)文獻(xiàn)(Arch.Virol)58119(1978)；Coggins等人，Cornellvet.51539(1961)；Pillips等人，美國獸醫(yī)研究雜志36135(1975)；Lobmann等人，美國獸醫(yī)研究雜志，452498(1984)；Coria等人，Can.J.Comp.Med.42239(1978)；Martin等人Proceedings of theconference Res workers Anim.Dis 75183(1994)；及美國專利第4,618,493號)。一般地，一株疫苗含有約1×106至1×108個病毒顆粒，以及獸醫(yī)可接受的載體，體積為0.5-5ml?？砂碦emington’s藥物科學(xué)(Mack Publishing CO.Easton，Pa第16版1982)中所述方法配制。本發(fā)明包容各種賦形劑和佐劑，其可按需要摻入到制劑中。例如，本發(fā)明中的疫苗組合物可按常規(guī)用標(biāo)準(zhǔn)緩沖鹽、載體、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑及助溶劑來配制，也可為方便持久釋放而配制。稀釋劑可包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等等。等滲添加劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、乳糖及其它。穩(wěn)定劑包括白蛋白及其它。非限制性佐劑例子有RIBI佐劑系統(tǒng)(Ribi Inc)、明礬、氫氧化鋁凝膠、水包油乳劑、油包水乳劑如弗氏完全和不完全佐劑、封閉共聚物(Block co polymer)(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emery Ville CA)、AMPHIGEN佐劑、皂苷、Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，CambridgeMA)或其它皂苷組分、單磷脂A、Avridine脂胺佐劑、大腸桿菌來源的不耐熱腸毒素(重組或其它)、霍亂毒素或胞壁酰二肽等。疫苗還可包括一種或更多其它免疫調(diào)節(jié)劑如白細(xì)胞介素、干擾素或其它細(xì)胞因子。疫苗一般用于非腸道途徑給予，但本發(fā)明也適用于其它途徑，比如口服、鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)、淋巴結(jié)內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、直腸或陰道給藥，或采用聯(lián)合途徑給藥。熟練的技術(shù)人員可按照選擇的途徑來配制疫苗組合物。
可用本領(lǐng)域熟知的方法優(yōu)化免疫方法?？蓡未蝿┝肯騽游锸┯?，或者另一種方式，每間隔2至10周給予兩次或多次接種。需要的話，收集接種動物的血清，檢測抗BVD病毒抗體的存在。
此處使用的術(shù)語“免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)”及類似用語，廣義地包括牛體內(nèi)對疫苗產(chǎn)生的任何基于免疫的反應(yīng)的誘導(dǎo)或增加，包括保護(hù)接種動物抵抗BVD病毒的抗體或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，或二者兼俱。此處所用術(shù)語“保護(hù)性免疫”、“保護(hù)性免疫反應(yīng)”、“保護(hù)”及類似用語不僅僅限于對牛病毒性腹瀉的絕對防護(hù)，或?qū)ε０l(fā)生BVD病毒感染的絕對防護(hù)，而意在包括，與未接種過的被感染動物相比，任何病原體感染程度或感染率的下降，或病原體感染后所致疾病的嚴(yán)重性或任何癥狀或狀態(tài)出現(xiàn)的任何緩解。E DNA疫苗關(guān)于利用核酸(DNA或mRNA)進(jìn)行疫苗制備和接種的方法之文獻(xiàn)包括美國專利第5,703,055號、第5,580,859號、5,589,466號、國際專利公開文本W(wǎng)O 98/35562，及各種科學(xué)出版物包括Ramsay等人，1997，免疫細(xì)胞生物學(xué)(Immunol.Cell Biol)75360-363；Davis，1997，生物技術(shù)當(dāng)今觀點(diǎn)(Cur.Opinion Biotech)8635-640；Manickan等人，1997，免疫學(xué)評論性綜述(Critical Rev.Immunol)17139-154；Robinson，1997，疫苗(Vaccine)15(8)785-787；Robinson等人，1996；AIDS Res.Hum.Retr.12(5)455-457；Lai和Bennet，1998，免疫學(xué)評論性綜述18449-484；及Vogel和Sarver，1995，臨床微生物學(xué)綜述(Clin.Microbiol，Rev)8(3)406-410，在此引用供參考?？捎眠@些方法產(chǎn)生抗BVD病毒的疫苗，其中，向牛施用對應(yīng)于BVDdN1核酸的核酸，或?qū)?yīng)于通過Npro蛋白酶基因失活而得到減毒的類似BVD病毒基因組或其簡并性變異體的核酸。也可使用含有這些核酸分子的載體。以這種方式遞送的免疫原一般既會激發(fā)體液免疫反應(yīng)，也會激發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
編碼減毒BVD病毒基因組的DNA或RNA均可用作疫苗。DNA或RNA分子可以是“裸露”形式，或與促進(jìn)細(xì)胞吸收的成分(如脂質(zhì)體或陽離子脂)一塊施用。施用方式一般是肌肉內(nèi)注射約0.1至5ml疫苗。疫苗中多核苷酸總量大體上應(yīng)在約0.1μg/ml至5mg/ml之間。多核苷酸可以為在懸浮液、溶液或乳劑的形式中，但一般優(yōu)選水載體。通過單次接種或多次接種完成免疫過程。需要的話，收集接種動物的血清并檢測抗BVD病毒抗體的存在。
下述實(shí)施例僅僅用作說明，并不意在限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1分析和實(shí)驗(yàn)方法DNA感染性全長pVVNADL克隆見圖1A。該質(zhì)粒含有一個來自于pGE4(Promega Corp.)的ColE1復(fù)制子，長度為14,578bp(Vassilev等人，病毒學(xué)雜志71471-478(1997))。T7RNA聚合酶啟動子被插至BVD病毒基因組上游，該啟動子可指導(dǎo)病毒合成RNA。BVD病毒基因組序列來自BVD病毒的NADL株(ATCCVR-534)。pVVNADL在大腸桿菌中擴(kuò)增一般地，在大腸桿菌中擴(kuò)增全長pVVNADL克隆是困難的。已報(bào)道在大腸桿菌中擴(kuò)增長瘟病病毒cDNA和全長克隆時會產(chǎn)生有害效應(yīng)(Moormann等人，病毒學(xué)雜志70763-770(1996)；Rugglie等人，病毒學(xué)雜志703478-3487(1996))。在幾種細(xì)菌宿主中檢測了pVVNADL的穩(wěn)定性，這些宿主包括大腸桿菌JM109(stratagene)、DH 5α(GibcoBRL)和STBL2細(xì)胞(GibcoBRL)。將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入這些菌株中后，檢測克隆大小并用限制性圖譜分析質(zhì)粒的大體結(jié)構(gòu)。用STBL2細(xì)胞獲得最佳結(jié)果。pVVNADL轉(zhuǎn)化入這些細(xì)胞可產(chǎn)生相對單一的小克隆群，并在限制性生長環(huán)境中(30℃下不超過20小時)未發(fā)現(xiàn)DNA重排的證據(jù)，且DNA產(chǎn)率合理。體外轉(zhuǎn)錄及RNA轉(zhuǎn)染按廠家說明用MEGAscript試劑(Ambion)用T7RNA聚合酶體外合成RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。用SacII使pVVNADL DNA模板線性化后，用T4 DNA聚合酶處理除去3’突出端。用凝膠電泳分析轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物。將1至5μg的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入至含有6μg脂轉(zhuǎn)染試劑(GibcoBRL)的200μl Opti-MEM(GibcoBRL)中，室溫下溫育RNA/脂樣品10至15分鐘。在此期間，把在6孔板(直徑35mm)上生長的單層(50～60％鋪滿)MDBK(來自Madin Darby牛腎細(xì)胞(克隆6))或RD(穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的牛睪丸細(xì)胞系)細(xì)胞用無RNase的PBS洗兩次，再用Opti-MEM洗一次。末次洗畢，每孔加入轉(zhuǎn)染混合物，室溫下輕搖溫育10分鐘。每孔再加入1ml Opti-MEM，37℃溫育3小時。每孔加入3ml含5％胎馬血清(RD細(xì)胞)或胎牛血清(MDBK細(xì)胞)的Opti-MEM。37℃溫育1至4天后，用80％丙酮固定細(xì)胞，通過免疫組化的方法觀察BVD病毒斑。實(shí)施例2Npro基因缺失的BVD病毒克隆的構(gòu)建為了獲得基因組中缺失Npro基因的病毒，先制備3個DNA片段，再連接之。確切過程如下所述。獲得PCR片段1“PCR片段1”含有Npro編碼序列的缺失。得到該片段需三個PCR擴(kuò)增反應(yīng)。首先，用5NTR3(+)和5NTR4(-)為引物擴(kuò)增Npro編碼序列上游5’NTR區(qū)域的一半。5’正性有義引物5’NTR3(+)序列為5’-AAAGGTCTCGAGATGCCACG-3’(寡核苷酸218-237，SEQ ID NO2)。3’負(fù)性反義引物5’NTR4(-)序列為5’-GTCTGACATGTGCCATGTACAGCAGAGATTTTTAGTAGC-3’(寡核苷酸895-890。+388-356，SEQ ID NO3)。兩引物均位于病毒基因組的5’NTR區(qū)，5NTR3(+)引物包含一個單一Xhol限制性酶切位點(diǎn)。5NTR4(-)引物5’端包含6個附加寡核苷酸，后者與BVD病毒C蛋白編碼序列的5’端同源。PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，采用終濃度為0.5μM的引物，10ng質(zhì)粒pVVNADL的DNA模板，Pfu DNA聚合酶2.5U(Stratagene，La Jolla，CA)。用下述條件進(jìn)行20次擴(kuò)增循環(huán)94℃變性30秒；55℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘。瓊脂糖凝膠電泳純化后產(chǎn)生的177堿基對的片段(片段A)重懸于TE緩沖液中。
用寡核苷酸NADLC6(+)和Seq23(-)作引物進(jìn)行另一個PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增Npro編碼序列的下游片段。5’正義引物NADLC6(+)序列為5’-CACATGTCAGACACGAAAGAAGAGGGAGC-3’(寡核苷酸383-388+890-913，SEQ ID NO4)。3’反義引物Seq 23(-)序列為5’-CAGGTTTGCAATCCAAGTGCCC-3’(寡核苷酸2480-2459，SEQ ID NO5)。引物NADLC6位于蛋白質(zhì)C的N端，包括與5’NTR的3’端同源的3個附加核苷酸，其5’端有一個起始密碼ATG。引物Seq 23(-)靠近E2蛋白質(zhì)N端。擴(kuò)增反應(yīng)中用質(zhì)粒pVVNADL作模板，反應(yīng)條件同上所述。用瓊脂糖凝膠電泳純化得到的DNA片段(片段B)，該片段長1596bp。
第三個擴(kuò)增反應(yīng)用0.5μM濃度的寡核苷酸5’NTR3(+)(SEQID NO2)和Seq 23(-)(SEQ ID NO5)作引物，片段A和片段B為模板，再加上2.5U Pfu DNA聚合酶(Stratagone，La folla，CA)。擴(kuò)增過程中前四個循環(huán)條件為94℃變性30秒；40℃退火1分鐘；72℃延伸2分鐘。緊接著20個循環(huán)的條件為94℃變性30秒；60℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘。如此獲得終產(chǎn)物為“PCR片段1”，長1767bp。其用于連接前先用XhoI和PvuI酶切該片段形成長1175bp的片段。獲得PCR片段II用寡核苷酸Seq 2(+)和Seq 24(-)作引物得到“PCR片段II”。5’正義引物Seq 2(+)序列如下5’-GGAGCATACGCTGCTTCCCC-3’(寡核苷酸1865-1884，SEQID NO6)。3’反義引物Seq 24(-)序列為5’-GCCTTGCCTATGAGGGAATGG-3’(寡核苷酸2963-2942，SEQID NO7)。寡核苷酸Seq 2(+)靠近E1N端處，寡核苷酸Seq 24(-)靠近E2區(qū)域中間。用質(zhì)粒pVVNADL DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件如上有關(guān)用A和B片段進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)所述。產(chǎn)生的片段稱“PCR片段II”，長1098bp。其用于連接前用PvuI和RsrII酶切形成929 bp的片段。獲得載體片段III用XhoI和RsrII酶切長14579bp的質(zhì)粒pVVDADL，得到長11974bp的片段，稱為“載體片段III”。獲得質(zhì)粒pBVDdN1以2∶2∶1的分子比混合PCR片段I和II和載體片段III，用200單位T4 DNA連接酶(Boehringer Mannheim)連接，16℃下過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌STBL2細(xì)胞，用小量DNA純化和特異性限制酶切法篩選異源克隆。對帶有預(yù)期長度(14079bp)的質(zhì)粒進(jìn)一步進(jìn)行序列分析。產(chǎn)生的p BVDdN1質(zhì)粒示于圖1，其包含有來自BVD病毒基因組的Npro蛋白酶基因的缺失。pBVDdN1載體背景與pVVNADL相同。實(shí)施例3Npro基因缺失的BVD病毒克隆之表征Npro基因缺失的BVD病毒克隆p BVDdN1的感染性如前所述體外合成p BVDdN1和pVVNADL(陽性對照)的RNA，用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑于RD單層細(xì)胞上進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48、72和96小時，收集已轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液，用其重感染新鮮RD單細(xì)胞層。用80％丙酮固定被轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用Vectastain Elite ABC試劑盒(Vector Laboratories)進(jìn)行免疫組化分析。用于檢測BVD特異性病毒的單克隆抗體是15C5(特異性針對E0)和CA3(特異性針對E2)(Pfizer inhouse)，也可用標(biāo)準(zhǔn)方法制備針對這些抗原的其它單克隆抗體，并用于同樣的方法中。使用時這些抗體稀釋度為1∶1000。用來自親代病毒RNA轉(zhuǎn)染后24小時可檢出E0和E2包膜蛋白及產(chǎn)生病毒。與之不同的是，用p BVDdN1的RNA轉(zhuǎn)染后48小時細(xì)胞中才檢出E0和E2蛋白。直到轉(zhuǎn)錄后72小時才產(chǎn)生BVDdN1病毒。表型分析用早期傳代(第3代)的BVDdN1病毒株接種RD和MDBK單層細(xì)胞。將這些細(xì)胞與接種了親代病毒的對照細(xì)胞比較。轉(zhuǎn)染后20小時(RD細(xì)胞)或24小時(MDBK細(xì)胞)用80％丙酮固定單層細(xì)胞。用1∶1000稀釋的E2特異性單克隆抗體CA3對固定細(xì)胞進(jìn)行免疫組化分析，并在顯微鏡下鏡檢。兩種細(xì)胞類型中均發(fā)現(xiàn)親代病毒復(fù)制速率比BVDdN1病毒復(fù)制速率快得多?；蛐头治霭磸S家說明用UltraspecTMRNA試劑(biotect)從被感染的RD單層細(xì)胞中純化親本病毒和BVDdN1(3代)的RNA。用RT-PCR玻珠(Pharmacia Biotech)和寡核苷酸NADLE 07(-)和5NTR3(+)進(jìn)行RT/PCR反應(yīng)。5NTR3(+)寡聚核苷酸序列與位置如上所述。NADLE07(-)寡核苷酸序列為5’-CACTTGCATCCATCATACC-3’(反義，寡核苷酸1379-1361，SEQ ID NO8)。該寡聚核苷酸位于距E0的N末端約150bp處。發(fā)現(xiàn)RT/PCR自親代病毒RNA可得到1162bp大小的片段。RT/PCR自BVDdN1的RNA可得到661bp大小的片段，這與預(yù)期的缺失Npro蛋白酶基因的片段大小相同。對自親代病毒和BVDdN1的RNA獲得的RT/PCR片段測序，兩種情況中，所得序列均如預(yù)期，相應(yīng)于圖1所示元件的排列。BVDdN1的完整序列見SEQ ID NO1中第39至12116核苷酸所示。實(shí)施例4BVDdN1功效研究本研究目的是評價含BVDdN1的疫苗使小牛發(fā)生血清轉(zhuǎn)化的能力。15頭動物被隨機(jī)分至一個房間(10頭進(jìn)行雙劑量接種，5頭作為觀察對照)。另外10頭動物隨機(jī)分至另一房間(單劑量接種，無觀察對照)。將2.0mlMDBK細(xì)胞裂解液中的BVDdN1病毒以107TCID50/動物的劑量皮下施予動物。進(jìn)行免疫時，讓5頭被指定為觀察對照的動物離開房間。剩下的10頭小牛接種BVDdN1病毒。免疫后約24小時，使觀察對照動物返回接種房間。首次劑量后約28天用同樣方式給前10頭動物接種第二次劑量的疫苗。
在第-1、0(接種前)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天(所有組動物)和第27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38天(雙劑量組動物)測量直腸溫度。在第0天收集雙劑量組動物的血樣，以后每周收集一次(即在第7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77、84和91天)。在第0、7、14、21、28、35、42、49、56和63天收集單劑量組動物的血樣。
用SN分析法檢測血清中和抗體(I型用BVD病毒分離物5960，II型用分離物890)，以監(jiān)測是否存在預(yù)期的同源和異源保護(hù)效應(yīng)。
總體的觀察或直腸溫度均未觀察到明顯差異。研究期間觀察對照動物均未觀察到血清轉(zhuǎn)化現(xiàn)象(數(shù)據(jù)未列)。
I型血清中和分析發(fā)現(xiàn)，所有接種過BVDdN1病毒的動物發(fā)生了血清轉(zhuǎn)化。單次劑量接種后第28天，60％的動物中出現(xiàn)了1∶8或更高的陽性效價，第35天90％的動物中出現(xiàn)1∶8或更高的陽性效價，且以后維持在高效價水平(圖3A)。II型血清中和分析發(fā)現(xiàn)，接種后63天70％的動物是陽性(數(shù)據(jù)未列)。雙劑量接種后，I型血清中和分析表明，所有動物在第7天出現(xiàn)1∶64或更高的陽性效價，以后維持在類似的血清轉(zhuǎn)化水平(圖3A)。II型血清中和分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)動物第二次接種后7天出現(xiàn)陽性效價，在第28天至少60％動物出現(xiàn)1∶8或更高的陽性效價(圖3B)。這些結(jié)果表明，BVDdN1病毒可以在牛體內(nèi)復(fù)制，并誘導(dǎo)產(chǎn)生抗I型和II型病毒的陽性中和血清，說明該病毒可被用來作為抗BVD病毒的疫苗。生物材料保藏質(zhì)粒p BVDdN1于1988年10月20日在美國Manassas，VA，20110的10801大學(xué)Blvd，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)進(jìn)行保藏，保藏號為ATCC203354。
上面提及的所有專利、專利申請及出版物在此全部引入供參考。
本發(fā)明中的實(shí)施例僅僅表述了本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明范圍并不限于此。同樣功能的組合物與方法在本發(fā)明范圍之內(nèi)。事實(shí)上，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，根據(jù)前面的描述不難推及除在此提及內(nèi)容以外的多種修飾方法。此類修飾應(yīng)落入所附權(quán)利要求的范圍。
序列表<110>輝瑞產(chǎn)品公司<120>減毒型牛病毒性腹瀉病毒<130>PC10435A<140><141><150>60/107,908<151>1998-11-10<160>9<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>14078<212>DNA<213>牛減毒型腹瀉病毒<400>1cacgcgtatc gatgaattcg ttaatacgac tcactatagt atacgagaat tagaaaaggc 60actcgtatac gtattgggca attaaaaata ataattaggc ctagggaaca aatccctctc 120agcgaaggcc gaaaagaggc tagccatgcc cttagtagga ctagcataat gaggggggta 180gcaacagtgg tgagttcgtt ggatggctta agccctgagt acagggtagt cgtcagtggt 240tcgacgcctt ggaataaagg tctcgagatg ccacgtggac gagggcatgc ccaaagcaca 300tcttaacctg agcgggggtc gcccaggtaa aagcagtttt aaccgactgt tacgaataca 360gcctgatagg gtgctgcaga ggcccactgt attgctacta aaaatctctg ctgtacatgg 420cacatgtcag acacgaaaga agagggagca acaaaaaaga aaacacagaa acccgacaga 480ctagaaaggg ggaaaatgaa aatagtgccc aaagaatctg aaaaagacag caaaactaaa 540cctccggatg ctacaatagt ggtggaagga gtcaaatacc aggtgaggaa gaagggaaaa 600accaagagta aaaacactca ggacggcttg taccataaca aaaacaaacc tcaggaatca 660cgcaagaaac tggaaaaagc attgttggcg tgggcaataa tagctatagt tttgtttcaa 720gttacaatgg 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taattgtgat 3300cctactgatg attggggatg tggtaaaggc cgattcaggg ggccaagagt acttggggaa 3360aatagacctc tgttttacaa cagtagtact aatcgtcata ggtttaatca tagctaggcg 3420tgacccaact atagtgccac tggtaacaat aatggcagca ctgagggtca ctgaactgac 3480ccaccagcct ggagttgaca tcgctgtggc ggtcatgact ataaccctac tgatggttag 3540ctatgtgaca gattatttta gatataaaaa atggttacag tgcattctca gcctggtatc 3600tgcggtgttc ttgataagaa gcctaatata cctaggtaga atcgagatgc cagaggtaac 3660tatcccaaac tggagaccac taactttaat actattatat ttgatctcaa caacaattgt 3720aacgaggtgg aaggttgacg tggctggcct attgttgcaa tgtgtgccta tcttattgct 3780ggtcacaacc ttgtgggccg acttcttaac cctaatactg atcctgccta cctatgaatt 3840ggttaaatta tactatctga aaactgttag gactgataca gaaagaagtt ggctaggggg 3900gatagactat acaagagttg actccatcta cgacgttgat gagagtggag agggcgtata 3960tctttttcca tcaaggcaga aagcacaggg gaatttttct atactcttgc cccttatcaa 4020agcaacactg ataagttgcg tcagcagtaa atggcagcta atatacatga gttacttaac 4080tttggacttt atgtactaca tgcacaggaa agttatagaa gagatctcag gaggtaccaa 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cacgaaaaat gccacattaa tatactggat aaactaaccg catttttcgg 5040gatcatgcca agggggacta cacccagagc cccggtgagg ttccctacga gcttactaaa 5100agtgaggagg ggtctggaga ctgcctgggc ttacacacac caaggcggga taagttcagt 5160cgaccatgta accgccggaa aagatctact ggtctgtgac agcatgggac gaactagagt 5220ggtttgccaa agcaacaaca ggttgaccga tgagacagag tatggcgtca agactgactc 5280agggtgccca gacggtgcca gatgttatgt gttaaatcca gaggccgtta acatatcagg 5340atccaaaggg gcagtcgttc acctccaaaa gacaggtgga gaattcacgt gtgtcaccgc 5400atcaggcaca ccggctttct tcgacctaaa aaacttgaaa ggatggtcag gcttgcctat 5460atttgaagcc tccagcggga gggtggttgg cagagtcaaa gtagggaaga atgaagagtc 5520taaacctaca aaaataatga gtggaatcca gaccgtctca aaaaacagag cagacctgac 5580cgagatggtc aagaagataa ccagcatgaa caggggagac ttcaagcaga ttactttggc 5640aacaggggca ggcaaaacca cagaactccc aaaagcagtt atagaggaga taggaagaca 5700caagagagta ttagttctta taccattaag ggcagcggca gagtcagtct accagtatat 5760gagattgaaa cacccaagca tctcttttaa cctaaggata ggggacatga aagaggggga 5820catggcaacc gggataacct atgcatcata cgggtacttc tgccaaatgc ctcaaccaaa 5880gctcagagct gctatggtag aatactcata catattctta gatgaatacc attgtgccac 5940tcctgaacaa ctggcaatta tcgggaagat ccacagattt tcagagagta taagggttgt 6000cgccatgact gccacgccag cagggtcggt gaccacaaca ggtcaaaagc acccaataga 6060ggaattcata gcccccgagg taatgaaagg ggaggatctt ggtagtcagt tccttgatat 6120agcagggtta aaaataccag tggatgagat gaaaggcaat atgttggttt ttgtaccaac 6180gagaaacatg gcagtagagg tagcaaagaa gctaaaagct aagggctata actctggata 6240ctattacagt ggagaggatc cagccaatct gagagttgtg acatcacaat ccccctatgt 6300aatcgtggct acaaatgcta ttgaatcagg agtgacacta ccagatttgg acacggttat 6360agacacgggg ttgaaatgtg aaaagagggt gagggtatca tcaaagatac ccttcatcgt 6420aacaggcctt aagaggatgg ccgtgactgt gggtgagcag gcgcagcgta ggggcagagt 6480aggtagagtg aaacccggga ggtattatag gagccaggaa acagcaacag ggtcaaagga 6540ctaccactat gacctcttgc aggcacaaag atacgggatt gaggatggaa tcaacgtgac 6600gaaatccttt agggagatga attacgattg gagcctatac gaggaggaca gcctactaat 6660aacccagctg gaaatactaa ataatctact 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9240caacagggat gcgaggccct tcatcatgat cctgggctca aggaattcca tatcaaatag 9300ggcaaagact gctagaaata taaatctgta cacaggaaat gaccccaggg aaatacgaga 9360cttgatggct gcagggcgca tgttagtagt agcactgagg gatgtcgacc ctgagctgtc 9420tgaaatggtc gatttcaagg ggactttttt agatagggag gccctggagg ctctaagtct 9480cgggcaacct aaaccgaagc aggttaccaa ggaagctgtt aggaatttga tagaacagaa 9540aaaagatgtg gagatcccta actggtttgc atcagatgac ccagtatttc tggaagtggc 9600cttaaaaaat gataagtact acttagtagg agatgttgga gagctaaaag atcaagctaa 9660agcacttggg gccacggatc agacaagaat tataaaggag gtaggctcaa ggacgtatgc 9720catgaagcta tctagctggt tcctcaaggc atcaaacaaa cagatgagtt taactccact 9780gtttgaggaa ttgttgctac ggtgcccacc tgcaactaag agcaataagg ggcacatggc 9840atcagcttac caattggcac agggtaactg ggagcccctc ggttgcgggg tgcacctagg 9900tacaatacca gccagaaggg tgaagataca cccatatgaa gcttacctga agttgaaaga 9960tttcatagaa gaagaagaga agaaacctag ggttaaggat acagtaataa gagagcacaa 10020caaatggata cttaaaaaaa taaggtttca aggaaacctc aacaccaaga aaatgctcaa 10080cccagggaaa 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1.一種減毒型牛病毒性腹瀉(BVD)病毒，其中該病毒基因組核酸序列包括SEQ ID NO1中自第39至12116核苷酸之間的序列，或其簡并性變異體。
2.權(quán)利要求1的減毒BVD病毒，其中該病毒基因組核酸序列基本上由SEQ 1D NO1中自第39至12116核苷酸之間的序列或其簡并性變異體組成。
3.權(quán)利要求1的病毒，其為基本上純的形式。
4.一種用權(quán)利要求1的病毒感染的宿主細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的子代病毒。
6.一種包括權(quán)利要求1的減毒BVD病毒和獸醫(yī)可接受的載體的疫苗。
7.一種核酸分子，包括SEQ ID NO1中自第39至12116核苷酸之間的序列，或其簡并性變異體。
8.權(quán)利要求7的核酸分子，其基本上由SEQ ID NO1中自第39至12116核苷酸之間的序列或其簡并性變異體組成。
9.權(quán)利要求7的核酸分子，其為基本上純的形式。
10.一種包含一個基本上由權(quán)利要求7的核酸分子組成的獨(dú)立密碼元件的載體。
11.權(quán)利要求10的載體，即p BVDdN1質(zhì)粒(ATCC No.203354)。
12.一種用權(quán)利要求7的核酸分子或權(quán)利要求10中的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
13.用權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的子代BVD病毒。
14.一種包含權(quán)利要求7的核酸分子及獸醫(yī)可接受的載體的疫苗。
15.一種修飾已分離的野生型BVD病毒基因組以使之適用作疫苗的方法，包括使所述已分離的野生型BVD病毒基因組核酸突變導(dǎo)致Npro蛋白酶基因失活。
16.權(quán)利要求15的方法，其中使所述Npro蛋白酶基因失活是用下列方法實(shí)現(xiàn)的，包括a)將該野生型BVD病毒基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；b)克隆a)步驟中的cDNA；c)使b)步驟中克隆的cDNA中的Npro蛋白酶基因突變，從而該基因無法產(chǎn)生具有完全活性的基因產(chǎn)物；并且d)克隆c)步驟中突變的cDNA。
17.權(quán)利要求16的方法，其中通過刪除所述野生型BVD病毒基因組的全部或部分Npro蛋白酶基因序列使該基因失活。
18.一種用權(quán)利要求15的方法獲得的BVD病毒基因組。
19.一種載體，其包括一個基本上由權(quán)利要求18的BVD病毒基因組組成的獨(dú)立序列元件。
20.一種用權(quán)利要求18的病毒基因組或權(quán)利要求19的載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
21.用權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的子代BVD病毒。
22.一種包含權(quán)利要求18的病毒基因組和獸醫(yī)可接受的載體的疫苗。
23.一種使野生型BVD病毒減毒以便適用于疫苗的方法，包括使該病毒基因組核酸突變導(dǎo)致Npro蛋白酶基因失活。
24.權(quán)利要求23的方法，其中減毒通過下列方法實(shí)現(xiàn)，包括a)分離所述野生型BVD病毒；b)克隆a)步驟中已分離病毒的基因組核酸；c)使b)步驟中克隆的基因組核酸突變導(dǎo)致Npro蛋白酶基因失活；并且d)將c)步驟中突變的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞以獲得減毒病毒。
25.權(quán)利要求24的方法，其中通過從所述野生型BVD病毒基因組中缺失全部或部分Npro蛋白酶基因使該基因失活。
26.一種用權(quán)利要求23的方法獲得的減毒BVD病毒。
27.一種用權(quán)利要求26的減毒病毒感染的宿主細(xì)胞。
28.權(quán)利要求27的被感染宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞為MDBK細(xì)胞(ATCC CCL-22)。
29.用權(quán)利要求28的宿主細(xì)胞獲得的子代病毒。
30.一種包含權(quán)利要求26的BVD減毒病毒和獸醫(yī)可接受的載體的疫苗。
31.一種誘導(dǎo)牛體內(nèi)免疫反應(yīng)的方法，包括以一定劑量將權(quán)利要求6、14、22或30的疫苗施予所述牛，該劑量應(yīng)足以誘導(dǎo)產(chǎn)生針對繼后BVD病毒感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)。
32.權(quán)利要求31的方法，其中保護(hù)性免疫既來自體液免疫反應(yīng)也來自細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
33.一種在可產(chǎn)生抗體的動物體內(nèi)誘導(dǎo)抗BVD病毒抗體的產(chǎn)生的方法，包括以一定劑量施予所述動物(a)權(quán)利要求1的病毒；(b)權(quán)利要求7的核酸分子；(c)權(quán)利要求10的載體；(d)權(quán)利要求18的病毒基因組；(e)權(quán)利要求19的載體；或(f)權(quán)利要求26的減毒病毒，該劑量應(yīng)能有效誘導(dǎo)上述抗體的產(chǎn)生。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述抗體在牛體內(nèi)產(chǎn)生。
35.權(quán)利要求33的方法，其還包括從所述動物中分離該抗體。
36.用權(quán)利要求33的方法制備的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使N
文檔編號A61K48/00GK1254756SQ9912352
公開日2000年5月31日 申請日期1999年11月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月10日
發(fā)明者X·M·曹, M·G·舍帕德 申請人:輝瑞產(chǎn)品公司