專利名稱：含紅細胞糖苷脂的藥物組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含紅細胞糖苷脂(Globoside)的藥物組合物及其應(yīng)用，特別是可用來治療腦膠質(zhì)瘤、腎癌、肺癌等腫瘤的藥物組合物及其應(yīng)用。
已知鞘糖脂大多位于細胞膜上，根據(jù)其結(jié)構(gòu)中有無唾液酶分為神經(jīng)節(jié)苷脂和中性鞘糖脂，前者含有唾液酸。鞘糖脂由寡糖鏈和神經(jīng)酰胺組成，以親水有的寡糖鏈伸向細胞外側(cè)，作為細胞表面糖萼的成分之一。根據(jù)以上特點，經(jīng)過大量實驗研究，普通認為鞘糖脂參與細胞識別、分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、相互作用等。自從Hakomori提出鞘糖脂與腫瘤的關(guān)系以來，大量的實驗研究發(fā)現(xiàn)細胞惡變時，某些鞘糖脂的缺失或發(fā)生的某些變化，可使細胞喪失接觸抑制性，從而導(dǎo)致一些生命信號物質(zhì)缺失，突變物質(zhì)增加。目前國內(nèi)外對鞘糖脂的研究集中于酸性鞘糖脂，即神經(jīng)節(jié)苷脂，對中性鞘糖脂的研究較少。已有的研究集中在某些細胞菌毒素和微生物的受體、血型抗原、腫瘤相關(guān)抗原、胚胎特異性抗原等，對腫瘤相關(guān)鞘糖脂的研究則集中于發(fā)生機理方面，尚未見中性鞘糖脂作用于腫瘤藥物治療的報導(dǎo)。
本發(fā)明的目的是提供一種可用來治療腦膠質(zhì)瘤、腎癌、肺癌等腫瘤的藥物。
腦膠質(zhì)瘤是腦部最常見的原發(fā)性腫瘤，其發(fā)病機理及生物學(xué)行為至今尚不清楚。近十年來膠質(zhì)瘤的治療常規(guī)采用手術(shù)、放療、化疔等綜合治療手段，均難以取得令人滿意的效果，而嚴重的不良反應(yīng)也限制了傳統(tǒng)化療藥物的劑量和療程，加上腫瘤的特異性和血腦屏障的影響，進一步削減了藥物的療效。因此膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的機理成為近年來研究的熱點。
有關(guān)腦腫瘤相關(guān)鞘糖脂的研究是腫瘤鞘糖脂研究領(lǐng)域中研究得較為深入和廣泛的一部分。研究發(fā)現(xiàn)①腦膠須瘤細胞株及瘤組織樣本表達的神經(jīng)節(jié)苷脂主要有GM2、GD2、GD3及3′-isoLM，其中3′-isoLM特異性較強；②singh-LP等發(fā)現(xiàn)各種病理類型的腦膠質(zhì)瘤中性鞘糖脂的組成具有異質(zhì)性其中多形性成膠質(zhì)細胞瘤(AA)總的中性鞘糖脂、CMH及CDH的含量較高，而水的含量低。不含CTH和Globoside；神經(jīng)胚層腫瘤(PNET)總的中性鞘糖脂及CMH含量低。但常出現(xiàn)CTH和Globoside；低度惡性的星形膠質(zhì)瘤(LGA)水含量高，總脂及CMH含量低；而高度惡性的星形膠質(zhì)瘤(HGA)，所有中性糖脂的成分均具備，且含量中等；少突膠質(zhì)瘤CMH含量高，水成分含量低，較少出現(xiàn)CTH和Globoside；③鞘糖脂的含量或節(jié)苷脂的相對百分含量與腦膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后相關(guān)。
我們研究發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤、腎癌、肺癌組織中性鞘糖脂的表達存在著異性，與正常人相應(yīng)組織相比，大部分腫瘤細胞CDH及CTH的表達較正常組織強，它們均不含有中性鞘糖Globoside，而正常組織中性鞘糖脂的表達雖然也存在著一定的異質(zhì)性，但它們均含有一定的Globoside，提示Globoside的缺乏可能是細胞癌變的原因之一。
根據(jù)本發(fā)明，我們可以將從各種動物細胞中提取的Globoside(組分A)與各種制藥中的載體(組分B)配制成藥物組合物，從而治療腦膠持質(zhì)瘤、腎癌和肺癌等腫瘤。
組分(A)的來源新鮮豬腦、牛腦、羊腦、動物血細胞、正常人血細胞，經(jīng)勻漿器勻漿或超聲粉碎，分別以2∶1、1∶2、1∶1的氯仿/甲醇溶液提取總脂，總體積為組織的20倍，最后一次在4℃下過夜。濾紙過濾、收集并合并三次濾液，39±3℃下減壓蒸餾，得到淡黃色油狀物，即為總脂，以1∶1氯仿/甲醇溶液溶解，-20℃保存?zhèn)溆肈EAE-Sephadex A-25柱層析物取2.2gDEAE-Sephadex A-25置一廣口瓶中，加30mlB液(氯仿∶甲醇∶0.8M醋酸鈉為60∶30∶8混合物)，振蕩30分鐘，靜置，去上清，如此重復(fù)三次，最后一次讓樹脂浸泡在B液中4℃下過夜。B為新鮮配置。次日用30mlA液(氯仿∶甲醇∶水為60∶30∶8混合物)洗樹脂3-4次，最后懸浮于10mlA液中倒入外徑為14mm的層析柱中，柱中先放少許A液，讓樹脂自然沉降，溶劑流出，再用60-80mlA液洗滌以去除全部醋酸鈉。各種組織的總脂置入A液中緩慢上柱，速度為0.2ml/分，上柱后過夜使總脂與樹脂充分交換。次日再以A液80ml洗脫，收集洗脫液，39±3℃下減壓蒸餾，即為中性鞘糖脂粗提物；同樣方法將粗提物過Flossil層析柱，得到純化中性鞘糖脂。
純化中性鞘糖脂以1∶1氯仿/甲醇溶液溶解，拌硅膠H(10-40u)加壓柱層析，以不同濃度氯仿/甲醇溶液梯度洗脫，分管收集，于TLC板點樣檢測，60∶35∶8氯仿/甲醇/水展開，碘顯色，并與標準中性鞘糖脂比較，收集純化的Globoside,TLC板點樣一個斑點，Rf值0.45，減壓蒸干得到白色固體1NMR、FAB質(zhì)譜儀鑒定結(jié)構(gòu)，為三～六糖基神經(jīng)鞘氨醇。
各種來源的Globoside，結(jié)構(gòu)如下Globotriaosyl cermide(Gb3)GalNAc(betal-3)Gal(alphal-4)Gal(betal-4)Glc-cerGb5:Gal(betal→3)GalNAc(betal-3)Gal(alphal-4)Gal(betal-4)Glc-CerGL7:sialyl Gal(betal→3)GalNAc(betal-3)Gal(alphal-4)Gal(betal-4)Glc-CerGlobo H:Fuc(alphal→2)Gal(betal→3)GalNAc(betal→3)Gal(alphal→4)Gal(betal→4)Glc-Cer{GalNAc:(N-acetylgalactosamine)N-乙酰氨基半乳糖Gal:(galactose)半乳糖Glc:(9lucose)葡萄糖Fuc:(fucose)巖藻糖Cer:(ceramide)神經(jīng)酰胺}各種來源Globoside的結(jié)構(gòu)分別是羊腦細胞提取三糖基神經(jīng)鞘氨醇；牛腦細胞提取四和五糖基神經(jīng)鞘氨醇；豬腦細胞提取四和五糖基神經(jīng)鞘氨醇；人紅細胞提取四和五糖基神經(jīng)鞘氨醇；豬紅細胞提取六糖基神經(jīng)鞘氨醇；組分(B)為(1)助溶劑，包括酒精、二甲基亞砜、水(2)其它賦形劑組分(A)溶解于助溶劑中經(jīng)超聲乳化或加入其它賦形劑配制成溶液，也可以采用冷凍干燥法制成粉劑，或?qū)⒎蹌┰賶嚎s成片劑。
組分(A)和組分(B)配制成品的有效濃度3～100％(V/V)。最佳濃度范圍為25～100％(V/V)。
本發(fā)明提出的藥物組合物是可應(yīng)用于治療腫瘤的藥物，因Globoside干擾腫瘤細胞有絲分裂和DNA合成，阻斷腫瘤細胞周期時、信號傳導(dǎo)和生長增殖，抑制腫瘤細胞基因表達，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。
下面結(jié)合附圖
詳細說明本發(fā)明的實施例。
附圖為本發(fā)明的細胞生長曲線圖。
實施例1實驗材料(1)將Globoside和助溶劑配制成100％的組合物。
(2)細胞株體外SWO-38、SK-RC-49、SPC-A-1細胞株于含10％小牛血清的RPMI-16-40的培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)傳代。
(3)動物SCID裸小鼠，雄性，體重20-26g，由中山醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，合格證號96015。
(4)主要試劑MTT(Sigma產(chǎn)品)實驗方法MTT實驗取指數(shù)生期內(nèi)的腫瘤細胞株如SWO-38、SK-RC-49、SPC-A-l，以2×102孔接種于96孔板內(nèi)，5％CO2、37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)24hr；分別加入不同來源濃度梯度的Globoside，每種濃度設(shè)3個復(fù)孔，并設(shè)立不同來源CDH和空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)48hr；測試前4hr每孔加入MTT(5mg/ml)液10ul,4hr后每孔加入DMSO溶液200ml，于酶聯(lián)免疫儀570mm下測定每孔的OD值。以濃度的對數(shù)對抑制率作圖，求得各種Globoside的IC50值為23.4±4.54。不同來源Globeside對SWO-38、SK-RC-49、SPC-A-1細胞株的IC50(單位ug/ml)牛腦豬腦 羊腦 人血細胞 豬血細胞 人白細胞SWO-3821.326.4 29.216.5 27.6367SK-RC-49 24.523.1 28.618.4 26.7358SPC-A-1 23.622.4 26.017.4 26.9396細胞生長曲線取指數(shù)生長期的SWO-38、SK-RC-49、SPC-A-1，細胞株，1×105孔接種于24孔板內(nèi)，并于每孔加入不同來源的Globoside,5％CO2、37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)；次日測定第一組三個孔內(nèi)的細胞株總數(shù)，依次測定7天，繪制成細胞生長曲線，可見不同來源Globoside均能抑制SWO-38、SK-RC-49、SPC-A-1細胞生長(見附圖，橫坐標為Globoside的濃度，縱坐標為抑制率％)。
Globoside誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞株凋亡流式細胞儀檢測Globoside作用于SWO-38、SK-RC-49、SPC-A-1細胞株后，按常規(guī)方法收集細胞，上流式細胞儀檢測，每例樣品測1萬個細胞核，檢測結(jié)果輸至計算機作數(shù)據(jù)處理，專用軟件作細胞周期分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Globoside可抑制腫瘤細胞DNA合成，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。
DNA電泳檢測凋亡梯形帶Globoside作用于SWO-38、SK-RC-49、SPC-A-1細胞后細胞bcl-2、c-fos、c-myc等基因表達的變化情況。Globoside作用后的SWO-38、SK-RC-49、SPC-A-1細胞依次加入鼠抗人一抗，熒光標記的羊抗鼠二抗后，上流式細胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)上述基因表達減少弱。
對荷人腫瘤小鼠的影響研究(1)荷瘤小鼠模型的建立取一定數(shù)量、指數(shù)期生長、活力在95％以上的SWO-38、SK-RC-49、SPC-A-1細胞，依次接種于裸鼠右后肢大腿內(nèi)側(cè)肌肉，約1×105個瘤細胞；
(2)用藥方法腫瘤移植后第4天，可觸及移植局部稍有隆起時，將裸鼠隨機分為4組，Globoside組和生理鹽水組，各12只。實驗組分別給予瘤體局部注射或口服Globoside10mg/kg，對照組相應(yīng)部位注射生理鹽水或口服賦形劑；(3)取材與制片腫瘤移植后的14天，各組處死4只，取瘤體、同側(cè)腹主動脈旁淋巴、腋窩淋巴結(jié)，瘤體以電子天平稱重，淋巴結(jié)測量長、寬，計算體積。組織均以福爾馬林固定，石蠟包埋切片，HE染色鏡檢；(4)結(jié)果實驗組瘤體重量平均較對照組減輕，具有統(tǒng)計意義；實驗組淋巴體積較對照組減小，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
不同來源的Globoside對荷人腫瘤小鼠的影響大體觀察小鼠移植瘤后第4天即可觸及瘤結(jié)，以后腫瘤增長迅速，患肢功能受限。處死前均呈消瘦狀態(tài)。
牛腦豬腦羊腦 人血細胞豬血細胞 生理鹽水組腫瘤重量g 1.54 1.69 1.82 1.701.635.16淋巴結(jié)大小 0.01 0.01 0.01 0.010.010.036P＜0.05毒理學(xué)實驗(1)不同來源的Globoside作用于腫瘤細胞株的同時，測定其對正常人白細胞的IC50值，結(jié)果人白細胞的IC50值遠遠高于腫瘤細胞。可見Globoside對正常血細胞的毒性低；(2)觀察Globoside對正常小鼠腦組織的作用Balb/c小鼠，雌雄兼有，體重23-259，共99只，隨機分為9組，每組11只；分別給予下列藥物或試劑生理鹽水、溶劑、賦形劑、動物來源的Globoside及正常人血細胞Globoside，對照采用吐溫；將小鼠用乙醚麻醉后，開顱或靜脈注身各種來源的Globoside；分別觀察小鼠呼吸、心率、意識、肢體活動情況、及有無抽搐、嘔吐、體重變化等。之后，于第2、4、6天每組取2只小鼠處死后取腦組織做病理切片，第7天后將所有小鼠處死做腦組織及重要臟器病理不同來源Globoside對小鼠生命體征及腦組織的影響異常表現(xiàn)及死亡情況第七天平均體重(g)牛腦 無 24.5豬腦 無 25.9羊腦 無 25.8豬紅細胞 1只鼠嗜睡 23.1人紅細胞 無 24.6生理鹽水組 無 23.8溶劑組 無 24.8賦形劑組1只鼠活動性差，無死亡 25.1吐溫對照組 普遍進食差，死亡9只 14.2P＜0.05(3)慢性毒性實驗受試小鼠長期口服或靜脈注射不同來源Globoside，觀察對器官系統(tǒng)的損害情況，并設(shè)立BCNU對照組。
結(jié)果與陽性對照組比較，小鼠長期應(yīng)用Globoside未見明顯器官損害。
實施例2將各種不同來源的Globoside和助溶劑配制成3％的組合物，然后按照實施例1的方法進行(1)MTT實驗、(2)細胞生長曲線、(3)Globoside誘導(dǎo)瘤腫細胞株凋亡、(4)對荷人腫瘤小鼠的影響研究、(5)毒理學(xué)實驗，可以得出以下結(jié)論，3％的Globoside組合物能抑制腫瘤細胞生長，且毒副作用小。
實施例3將各種不同來源的Globoside和助溶劑配制成50％的組合物，然后按照實施例1的方法進行(1)MTT實驗、(2)細胞生長曲線、(3)Globoside誘導(dǎo)腫瘤細胞株凋亡、(4)對荷人腫瘤小鼠的影響研究、(5)毒理學(xué)實驗，可以得出以下結(jié)論50％的Globoside組合物能抑制腫瘤細胞的生長、且毒副作用小。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，含Globoside(紅細胞糖苷脂)組分(A)和制藥可接受的載體(B)其特征在于組分(A)為各種結(jié)構(gòu)的Globoside結(jié)構(gòu)如下globotraosyl ceramide(Gb3)GalNAc(betal-3)Gal(alphal-4)Gal(betal-4)Glc-CerGb5:Gal(betal→3)GalNAc(betal-3Gal(alphal-4)Gal(betal-4)G1c-CerGlobo H:Fuc(alphal→2)Gal(betal→3)GalNAc(betal→3)Gal(alphal→4)Gal(betal→4)Glc-Cer{GalNAc:(N-acetylgalactosamine)N-乙酰氨基半乳糖Gak:(galactose)半乳糖Glc:(glucose)葡萄糖Fuc:(fucose)巖藻糖Cer:(ceramide)神經(jīng)酰胺}組分(B)為(1)助溶劑，包括酒精、二甲基亞砜、水(2)其它賦形劑組分(A)溶解于助溶劑中經(jīng)超聲乳化或加入其它賦形劑配制成溶液，也可以采用冷凍干燥法制成粉劑，或?qū)⒎蹌┰賶嚎s成片劑。
2.按照權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于組分(A)和組分(B)配制成品的有效濃度3～100％(V/V)。
3.按照權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于組分(A)和組分(B)配制成品的最佳濃度范圍為25～100％(V/V)。
4.按照權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于；Globoside為三～六糖基神經(jīng)鞘氨醇，并且來自于不同的動物細胞，分別是羊腦細胞提取三糖基神經(jīng)鞘氨醇；牛腦細胞提取四和五糖基神經(jīng)鞘氨醇；豬腦細胞提取四和五糖基神經(jīng)鞘氨醇；人紅細胞提取四和五糖基神經(jīng)鞘氨醇；豬紅細胞提取六糖基神經(jīng)鞘氨醇；
5.按照權(quán)利要求1至4中所述的任何一種組合物作為治療腦膠質(zhì)瘤、腎癌、肺癌等腫瘤藥的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含Glodoside(紅細胞糖苷脂)的藥物組合物及其應(yīng)用,該組合物是將Globoside(紅細胞糖苷脂)溶解于助溶劑中經(jīng)超聲乳化或加入其它賦形劑配制成溶液,也可以采用冷凍干煉法制成粉劑,或?qū)⒎蹌┰賶嚎s成片劑,該組合可作為治療腦膠質(zhì)瘤,腎癌,肺癌等腫瘤藥的應(yīng)用。
文檔編號A61K31/70GK1235831SQ9911607
公開日1999年11月24日 申請日期1999年3月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月2日
發(fā)明者張積仁, 張健, 張宗誠 申請人:第一軍醫(yī)大學(xué)珠江醫(yī)院