專利名稱：靶向c－raf癌基因的反義硫代寡核苷酸,含它們的藥物組合及其用于治療癌癥的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及靶向c-raf癌基因的反義硫代寡核苷酸，含它們的藥物組合物及其用于治療癌癥的用途。
癌是由至少兩種癌基因經(jīng)多階段變化而引起的，傳統(tǒng)的基于細(xì)胞毒化學(xué)治療具有選擇性差、毒副作用強(qiáng)等缺點(diǎn)，尋找特異性強(qiáng)、尤其是干擾與腫瘤行為密切相關(guān)的基因表達(dá)的藥物是人們所希望的。反義藥物是利用Watson-Crick堿基配對(duì)原理與靶mRNA結(jié)合，干擾特定基因翻譯的脫氧寡核苷酸類藥物。反義藥物在治療基因異常表達(dá)或外來基因組表達(dá)所致疾病(如癌癥和病毒感染)有著廣闊的前景。Raf基因包括三個(gè)成員，即A-raf、B-raf、C-raf。c-raf基因表達(dá)的蛋白激酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增生的信號(hào)傳導(dǎo)過程中起重要的作用。許多人腫瘤細(xì)胞中有C-raf基因的突變激活(5’端缺失)或過度表達(dá)(Rapp et al.，The oncogenne handbook，EPReddy，AM Skalka and T Curran，eds.Elsevier Science Publishers NewYork，1988，pp.213-253)。1996年Monia等選擇c-raf mRNA上5’端、3’端和蛋白編碼區(qū)的34個(gè)位置作為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)了靶向c-raf mRNA的反義硫代脫氧寡核苷酸，但只有個(gè)別(ISIS132)的有較強(qiáng)的體內(nèi)外抗腫瘤效應(yīng)(BP monia et al.Nat Med 1996；2(6)668～675)。反義脫氧寡核苷酸的設(shè)計(jì)體現(xiàn)為在mRNA上選擇不同的位置，在一個(gè)靶mRNA(如c-raf mRNA含2977個(gè)堿基)上可設(shè)計(jì)出千萬(wàn)個(gè)不同長(zhǎng)度的反義寡核苷酸，通常一個(gè)堿基的差別往往會(huì)表現(xiàn)為藥效相差很大。人們認(rèn)為反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)、開發(fā)有較大的隨機(jī)性(W Roush Science 1997；2761192～1193)，因此反義藥物的選擇還缺乏理論指導(dǎo)。
本發(fā)明的目的是尋找靶向c-raf癌基因的反義核苷酸藥物。
本發(fā)明者經(jīng)廣泛深入研究，通過固相合成法合成了一系列硫代寡核苷酸并進(jìn)行了篩選。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)下面四個(gè)對(duì)癌癥中c-raf基因異常表達(dá)如肺腺癌A549細(xì)胞株和胃癌BGC細(xì)胞株有良好抑制作用的反義硫代寡核苷酸。
因此，本發(fā)明第一方面涉及的是具有下面序列1-4的靶向c-raf癌基因的反義硫代寡核苷酸序列15’-GCCTGTGACATGCATTCCTC-3’，今后簡(jiǎn)稱為BIRM2480-20，序列25’-AGTCCCGCCTGTGACATGCATTCC-3’，今后簡(jiǎn)稱為BIRM 2482-24，序列35’-AAAGTCCCGCCTGTGACATG-3’，今后簡(jiǎn)稱為BIRM2488-20，序列45’-GCATACGACGCATAGTCAAA-3’，今后簡(jiǎn)稱為BIRM762-20。
本發(fā)明再一方面涉及的是藥物組合物，其包括具有下面序列的反義硫代寡核苷酸及藥用載體和賦形劑。
序列15’-GCCTGTGACATGCATTCCTC-3’，今后稱為BIRM2480-20，序列25’-ATTCCCGCCTGTGACATGCATTCC-3’，今后簡(jiǎn)稱為BIRM 2482-24，序列35’-AAAGTCCCGCCTGTGACATG-3’，今后簡(jiǎn)稱為BIRM2488-20，序列45’-GCATACGACGCATAGTCAAA-3’，今后簡(jiǎn)稱為BIRM762-20。
本發(fā)明再一方面涉及的是下列序列的反義硫代核苷酸用于治療癌癥的用途本發(fā)明再一方面涉及的是上述下列序列的反義硫代核苷酸用于制備用于治療癌癥的藥物的用途。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的反義硫代寡核苷酸序列1-4是以c-raf mRNA的3’-非翻譯端(5’-GAGGAATGCATGTCACAGGC-3’，5’-GGAATGCATGTCACAGGCGGGACT-3’，5’-CATGTCACAGGCGGGACTIT-3’)和蛋白編碼區(qū)(5’-TTTGACTATGCGTCGTATGC-3’)為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成與以上靶點(diǎn)反向互補(bǔ)的硫代脫氧寡核苷酸，其對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞株和胃癌BGC細(xì)胞株有良好的抑制作用，因此本發(fā)明的靶向c-raf癌基因的反義硫代寡核苷基因的反義硫代寡核苷酸可用作抗癌藥物。
在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方案中，優(yōu)選作用于肺腺癌A549細(xì)胞株的本發(fā)明序列2的反義硫代寡核苷酸(BRIM2482-24)。
在本發(fā)明另一具體優(yōu)選方案中，優(yōu)選作用于胃癌BGC細(xì)胞株的本發(fā)明序列1和序列2的反義硫代寡核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的藥物組合物中還有含有作用于靶點(diǎn)其它靶點(diǎn)的反義寡核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明藥物組合物優(yōu)選含有序列2的反義硫代寡核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明藥物組合物優(yōu)選含序列1和/或2的反義硫代寡核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選將本發(fā)明序列2反義硫代寡核苷酸用于制備用于治療肺癌的藥物。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選將序列1和2的反義硫代寡核苷酸用于制備用于治療胃癌的藥物。
下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但不意味著對(duì)本發(fā)明任何限制。
實(shí)施例一反義硫代寡聚脫氧核苷酸(PS-ODN)的設(shè)計(jì)和合成1.人腫瘤細(xì)胞系(A549等)的培養(yǎng)及反義寡核苷酸的處理接種細(xì)胞于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中(補(bǔ)充青、鏈霉素各100ku·L-1)培養(yǎng)器皿置于37℃含有5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到50～60％融合時(shí)，用無血清培養(yǎng)基沖洗2遍。按Gibcl BRL公司脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書的要求，將反義寡核苷酸導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞內(nèi)。將脂質(zhì)體/無血清培養(yǎng)基＝1/5的比例，配制成脂質(zhì)體溶液，室溫下靜置30～40分鐘。等體積混合用無血清培養(yǎng)基溶解的不同濃度的反義寡核苷酸，靜置10～15分鐘后，加入到培養(yǎng)器皿中，迅速補(bǔ)充4倍的無血清培養(yǎng)基。置于37℃含5％CO2的培養(yǎng)箱中6小時(shí)后，換正常培養(yǎng)基，培養(yǎng)48～72小時(shí)后MTT法測(cè)定細(xì)胞活度。對(duì)照組僅含等濃度的脂質(zhì)體。
2.靶向c-raf mRNA的反義硫代寡核苷酸對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺腺癌A549細(xì)胞或其它的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，4000個(gè)細(xì)胞/孔。培養(yǎng)18～24小時(shí)，按上述方法，加入不同濃度的反義寡核苷酸反應(yīng)終體積均為200μl。換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48～72小時(shí)，棄上清。每孔加入200μl新鮮配制的含0.5mg/ml四氮唑鹽(MTT)的無血清培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)4小時(shí)后棄上清。以200μl DMSO溶解甲月替。輕度振蕩后，用酶標(biāo)儀在檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm、參比波長(zhǎng)為450nm下測(cè)定光吸收值。
本發(fā)明反義硫代寡核苷酸(BIRM2480-20～BIRM762-20等)對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞系、胃癌BGC細(xì)胞系有較強(qiáng)的抑制作用。
表1～4顯示本發(fā)明反義硫寡核苷酸對(duì)A549肺腺癌細(xì)胞體外增殖的抑制作用，并與對(duì)照核苷酸序列ISIS5132進(jìn)行了比較。表明BIRM2482-24效應(yīng)大于國(guó)外對(duì)照ISIS5132，其它與ISIS5132的效應(yīng)接近(N＝4，對(duì)照組為脂質(zhì)體對(duì)照)。
表1 BIRM2480-20(n＝4)
表2 BIRM2482-24
表3 BIRM 2488-20<
表4 BIRM762-20
表5顯示反義硫代寡核苷酸對(duì)BGC胃癌細(xì)胞體外增殖的抑制作用，并與國(guó)外的陽(yáng)性藥ISIS5132的效應(yīng)進(jìn)行比較。表明BIRM2480-20和BIRM2482-24對(duì)BGC胃癌細(xì)胞系的體外抑制作用大于ISIS132(n＝4，對(duì)照為完全空白)。表5
合成方法簡(jiǎn)介寡核苷酸固相合成亞磷酰胺法，使用美國(guó)ABI公司生產(chǎn)的ABI 390Z核酸合成儀的25umol合成程序合成程序合成。主要原料為四乙基秋蘭姆(TETD)、亞磷酰胺單體(phosphoramidite monomers)。制備時(shí)，將固相支持物連接保護(hù)的、通過固相合成的含本發(fā)明核苷酸序列的硫代寡核苷酸脫保護(hù)，從固相支持物上切離。用HPLC法進(jìn)行純化。
序列表(1)一般資料I.序列數(shù)量4(2)序列BIRM2480-20的資料II.序列特征a)核苷酸長(zhǎng)度20b)類型核酸c)鏈型單鏈d)拓?fù)涮卣麈湢領(lǐng)II.是否反義反義IV.序列描述BIRM 2480-20GCCTGTGACA TGCATTCCTC 20(2)序列BIRM2482-24的資料II.序列特征a)核苷酸長(zhǎng)度24b)類型核酸c)鏈型單鏈d)拓?fù)涮卣麈湢領(lǐng)II.是否反義反義IV.序列描述BIRM 2482-24AGTCCCGCCTGT GACATGCATTCC 20(2)序列BIRM2488-20的資料II.序列特征a)核苷酸長(zhǎng)度20b)類型核酸c)鏈型單鏈d)拓?fù)涮卣麈湢領(lǐng)II.是否反義反義
IV.序列描述BIRM 2488-20AAAGTCCCGC CTGTGACATG 20(2)序列BIRM762-20的資料II.序列特征a)核苷酸長(zhǎng)度20b)類型核酸c)鏈型單鏈d)拓?fù)涮卣麈湢領(lǐng)II.是否反義反義IV.序列描述BIRM 762-20GCATACGACG CATAGTCAAA 20
權(quán)利要求
1.靶向癌基因c-raf基因的未修飾或修飾的具有序列1-4的反義硫代寡核苷酸序列1 5’-GCCTGTGACATGCATTCCTC-3’，序列2 5’-AGTCCCGCCTGTGACATGCATTCC-3’，序列3 5’-AAAGTCCCGCCTGTGACATG-3’，序列4 5’-GCATACGACGCATAGTCAAA-3’。
2.權(quán)利要求1的反義硫代寡核苷酸，其中反義硫代寡核苷酸具有序列1和2序列1 5’-GCCTGTGACATGCATTCCTC-3’，序列2 5’-AGTCCCGCCTGTGACATGCATTCC-3’，
3.權(quán)利要求2的反義硫代寡核苷酸，反義硫代寡核苷酸具有序列1 5’-GCCTGTGACATGCATTCCTC-3’，
4.權(quán)利要求2的反義硫代寡核苷酸，反義硫代寡核苷酸具有序列2 5’-AGTCCCGCCTGTGACATGCATTCC-3’，
5.藥物組合物，其包括作為活性成份的具有序列1-4的反義硫代寡核苷酸和可藥用載體。
6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述反義硫代寡核苷酸具有序列1和2序列1 5’-GCCTGTGACATGCATTCCTC-3’，序列2 5’-AGTCCCGCCTGTGACATGCATTCC-3’，
7.權(quán)利要求6的藥物組合物，其中所述反義硫代寡核苷酸具有序列1序列1 5’-GCCTGTGACATGCATTCCTC-3’，
8.權(quán)利要求6的藥物組合物，其中所述反義硫代寡核苷酸具有序列2序列2 5’-AGTCCCGCCTGTGACATGCATTCC-3’，
9.具有序列1-4的反義硫代寡核苷酸用于制備用于治療癌癥的藥物的用途。
10.治療癌癥的方法，其中包括給患有癌癥的動(dòng)物治療有效量的權(quán)利要求1中具有序列1-4的反義硫代寡核苷酸或權(quán)利要求5的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及靶向c－raf癌基因的反義硫代寡核苷酸,含它們的藥物組合物及其用于治療癌癥的用途。
文檔編號(hào)A61K31/519GK1270173SQ9910495
公開日2000年10月18日 申請(qǐng)日期1999年4月12日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月12日
發(fā)明者袁守軍, 湯仲明, 宋海峰, 朱寶珍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所