專利名稱：一種腫瘤血管生成抑制素的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是血管形成抑制素(angiogenesis inhibitor，AI)，尤其是涉及具有穩(wěn)定生物活性的血管形成抑制因子(Endostatin(ES)和Angiostatin(AS))的技術領域。
實體瘤治療方法很多，包括外科和內(nèi)科療法，但多是針對腫瘤細胞本身，而用抑制劑抑制腫瘤血管形成阻斷其血液供應而抑制腫瘤生長的療法較少，其中包括TNP-470，COL-3，IL-2，鯊魚軟骨制劑，Endostatin，Angiostatin和干擾素等。腫瘤血管是腫瘤惡性轉化、生長和轉移的病理基礎，與傳統(tǒng)抗癌治療相比，抗腫瘤血管形成治療具有許多優(yōu)勢①不易產(chǎn)生耐藥性。②內(nèi)皮細胞與血液直接接觸，藥物能直接發(fā)揮作用，劑量少療效高。③正常成年人血管形成基本停止，抗腫瘤血管形成具有良好的特異性(副作用少)。
AS和ES是特異性地針對血管內(nèi)皮細胞生長的強抑制劑，它們的作用機理目前尚不完全清楚?？赡苡幸韵聨讉€作用途徑①干擾血管內(nèi)皮細胞的粘附、識別、接觸抑制和生長等，與整聯(lián)蛋白(Integrin)、鈣粘著蛋白(Cadherin)、選擇蛋白(Selectin)有關，如ES含有E-選擇蛋白(E-Selectin)特異的識別區(qū)點CRD等。②干擾腫瘤細胞的粘附。惡性腫瘤細胞有許多種肝素樣的受體，通過此受體與血管內(nèi)皮細胞粘附而發(fā)生轉移生長，ES具有特異性與這些受體結合的功能，因而阻止了腫瘤細胞的粘附和轉移。
AS和ES已有基因工程產(chǎn)品，但用量大、療程長(20mg/kg/d，30天，小鼠1周期)相當人的劑量(2-3mg/kg/d，180-360天1周期)。因此，如果按此方案生產(chǎn)一個人一天的用量(120-180mg)，需要成本10,000元左右，因而從產(chǎn)量上限制了上述兩種產(chǎn)品的推廣應用。
本發(fā)明的目的在于提供一種采用生化提取和中空纖維超濾制備高濃度，高產(chǎn)量，低成本和活性高的血管生長抑制素的制備方法。選用健康哺乳類動物的軟骨、肌腱、真皮、肝、肺組織，采用生化提取和中空纖維超濾，可以制成口服液，也可制備注射藥。
本發(fā)明的目的可通過以下的技術措施來達到選用健康哺乳類動物的軟骨、肌腱、真皮、肝、肺組織，用任何機械方式搗碎→-20℃深凍→融解后加濃鹽酸，攪拌均勻→加熱→恢復至室溫→凍存→融解后，離心→取沉淀，按每Kg沉淀加水2L溶解，加蛋白酶消化或其它方法消化→離心，取上清液→過正壓截留柱→取濾液→除菌→分裝，包裝，制備注射藥或加調味劑制作抑瘤口服液。
在上述方案中，健康哺乳類動物可選自豬，牛，馬，羊，狗，兔等。
在上述方案中，優(yōu)選加濃鹽酸的比例為每10L液體加1ml濃鹽酸，濃鹽酸的加入量可從1ml至數(shù)百ml。
在上述方案中，加熱溫度可在40-95℃范圍內(nèi)，優(yōu)選70-80℃。加熱時間為10-200分鐘，優(yōu)選120-180分鐘。
在上述方案中，加入的用于消化的蛋白酶可以是胃蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，糜蛋白酶，膠原蛋白酶，彈性蛋白酶等；濃度為0.001-1％，消化時間5-4000分鐘不等，優(yōu)選60-120分鐘。
在上述方案中，優(yōu)選截留柱的截止分子量為1000-100,000道爾頓。正壓0.1-1.0×104Pa，其組合方式為單柱或多柱組合使用。
在上述方案中，優(yōu)選將所制備的截止分子量≤100,000道爾頓，優(yōu)選≤50,000道爾頓的血管生長抑制素(AI)，在制備過程到除菌一步時加入調味劑分裝成品，制成抑瘤口服液；將制備的截止分子量≤20,000，優(yōu)選≤10,000道爾頓的血管生長抑制素(AI)，制成注射液，或與其它藥物配伍靜脈滴入給藥。
本發(fā)明方法進一步的優(yōu)選方案如下選用健康哺乳類動物如豬，牛，馬，羊，狗，兔等的軟骨、肌腱、真皮、肝、肺組織，用任何機械方式搗碎→-20℃深凍→融解后按照每10L液體加入1ml濃鹽酸的比例加入濃鹽酸，攪拌均勻→在40-95℃加熱10-200分鐘→恢復至室溫→-10℃凍存→融解后，離心→取沉淀，按每Kg沉淀加水2L溶解，加濃度為0.001-1％的蛋白酶消化5-4000分鐘，或其它方法消化→離心，取上清液→過正壓為0.1-1.0×104Pa的正壓截留柱，截留柱的截留分子量為1000-100,000道爾頓→取濾液→除菌→分裝，包裝，制備注射藥或加調味劑制作抑瘤口服液。
本發(fā)明的方法制備的血管生長抑制素(AI)是一類具有抑制新生血管內(nèi)皮細胞增殖和腫瘤血管增生的分子量為1000-100,000的多肽或蛋白混合物。按照本發(fā)明方法制備的血管生長抑制素(AI)按每Kg體重25-100毫克腹腔注射入已接種S180-纖維肉瘤和HepA肝癌的小鼠，能抑制腫瘤血管增生和腫瘤生長。臨床上可用于治療類風濕病、糖尿病后遺癥和惡性腫瘤等疾病。
下面，將用實施例進一步詳述本發(fā)明。實施例1取乳豬肝臟勻漿，→-20℃深凍→融解后按照每10L液體加入1ml濃鹽酸的比例加入濃鹽酸，攪拌均勻→在90℃加熱15分鐘→恢復至室溫→-10℃凍存→融解后，離心→取沉淀，按每Kg沉淀加水2L溶解，加濃度為0.001％的胃蛋白酶消化120分鐘，→離心，取上清液→過正壓為1.0×104Pa的正壓截留柱，截留柱的截留分子量為1000-100,000道爾頓→取截止分子量≤10,000的血管生長抑制素(AI)的濾液→除菌→分裝，制備注射液，每毫升含蛋白5.0mg。實施例2取乳豬肝臟勻漿，→-20℃深凍→融解后按照每10L液體加入1ml濃鹽酸的比例加入濃鹽酸，攪拌均勻→在40℃加熱150分鐘→恢復至室溫→-10℃凍存→融解后，離心→取沉淀，按每Kg沉淀加水2L溶解，加濃度為0.01％的胃蛋白酶消化60分鐘，→離心，取上清液→過正壓為1.0×104Pa的正壓截留柱，截留柱的截留分子量為1000-100,000道爾頓→取截止分子量≤10,000的血管生長抑制素(AI)的濾液→除菌→分裝，制備注射液，每毫升含蛋白5.0mg。實施例3取鼠肝臟勻漿，→-20℃深凍→融解后按照每10L液體加入1ml濃鹽酸的比例加入濃鹽酸，攪拌均勻→在90℃加熱150分鐘→恢復至室溫→-10℃凍存→融解后，離心→取沉淀，按每Kg沉淀加水2L溶解，加濃度為1％的胃蛋白酶消化5分鐘，→離心，取上清液→過正壓為1.0×104Pa的正壓截留柱，截留柱的截留分子量為1000-100,000道爾頓→取截止分子量≤10,000的血管生長抑制素(AI)的濾液→除菌→分裝，制備注射液，每毫升含蛋白5.0mg。實施例4S180-纖維肉瘤細胞，Hep-A肝癌細胞和昆明小鼠引自中山醫(yī)科大學實驗動物中心。瘤細胞株接種于F12/DME培養(yǎng)基內(nèi)(含10％小牛血清和青鏈霉素)，當細胞長滿培養(yǎng)瓶壁時，用胰酶消化，將細胞用培養(yǎng)基配成1-2×107個/ml濃度，腹腔接種于昆明小鼠體內(nèi)，0.2ml/鼠。當腫瘤細胞長滿整個腹腔時，抽取腹水，離心，收取沉淀，用生理鹽水將細胞稀釋成1-2×108個/ml，接種于昆明小鼠背部中線皮下，0.2ml/鼠。(I)AI對KM鼠接種HepA肝癌的影響實驗分對照組；預防組，于接種時注射AI 50和100mg/Kg體重連續(xù)28天；治療組，于腫瘤長至50-100mm3時注射AI 50和100mg/Kg體重連續(xù)10天；結果見表1。
表1.對KM鼠接種HepA肝癌的影響(x±s，作用24天)4癌重(g) 抑制率(％)P值對照組 47.0±1.632預防組(28天)(25mg/kg) 43.15±1.47 55 ＜0.05(50mg/kg) 42.66±1.26 62 ＜0.01治療組(10天)(25mg/kg) 43.50±2.29 50 ＜0.05(50mg/kg) 43.20±2.03 54 ＜0.05(II)AI對KM鼠接種S180纖維肉瘤的影響實驗分對照組；阿霉素組，10mg/Kg體重連續(xù)24天；AI組，25-100mg/Kg體重連續(xù)24天；結果見表2。
表2.對KM鼠接種S180肉瘤的影響(x±s，作用24天)
n 瘤重(g) 抑制率(％) P值對照組81.76±1.03阿霉素組 40.91±0.78 48.2 ＜0.05AI組(mg/kg)10050 41.04±0.74 41.0 ＜0.0525 42.49±0.51 72.2 ＜0.0140.93±0.70 47.2 ＜0.05實施例5本發(fā)明是采用生化提取，裂解膠原蛋白，通過調控裂解速度來保證產(chǎn)品的生物學活性和安全性，利用中空纖維超濾技術制備血管生長抑制素(AI)；同目前最先進的基因工程生產(chǎn)的ES和AS相比，具有濃度高，產(chǎn)量高，活性相似和成本低的特點。它們的比較結果見表3。(蛋白含量測定采用改良Lowry′s法活性測定)。
表3生化提取法與基因工程法比較生化提取法基因工程法品名 AIAS產(chǎn)量 10mg/g組織** 4.0mg/g工程菌*多肽含量(mg/ml)5.0 0.1-0.2最佳抑瘤劑量 100-150 100-120(mg/Kg WB/日)最佳抑瘤率(％) 7090以上成本(元/mg)0.5 400用量(mg/人/日)250-300180-220藥費(元/人/日)300-40030,000以上*，表中基因工程法AS的數(shù)據(jù)為估計值。**，組織是指軟骨、肌腱、真皮、肝和肺組織。
從表3可以看出，用基因工程法生產(chǎn)AS，就目前的技術水平，其產(chǎn)量難以滿足臨床應用的需要，費用十分高昂，因此，生化提取仍不失為一種行之有效的方法。
權利要求
1.一種穩(wěn)定的血管生長抑制素(AI)的制備方法，其特征是選用健康哺乳類動物的軟骨、肌腱、真皮、肝、肺組織，用任何機械方式搗碎→-20℃深凍→融解后加濃鹽酸，攪拌均勻→加熱→恢復至室溫→凍存→融解后，離心→取沉淀，按每Kg沉淀加水2L溶解，加蛋白酶消化或其它方法消化→離心，取上清液→過正壓截留柱→取濾液→除菌→分裝，包裝，制備注射藥或加調味劑制作抑瘤口服液。
2.權利要求1所述的制備方法，其特征在于健康哺乳類動物可選自豬，牛，馬，羊，狗，兔等。
3.權利要求1所述的制備方法，其特征在于加濃鹽酸的比例為每10L液體加1ml濃鹽酸，濃鹽酸的加入量可從1ml至數(shù)百ml。
4.權利要求1所述的制備方法，其特征在于加熱溫度可在40-95℃范圍內(nèi)，加熱時間為10-200分鐘。
5.權利要求4所述的制備方法，其特征在于加熱溫度可在78-80℃范圍內(nèi)，加熱時間為120-180分鐘。
6.權利要求1所述的制備方法，其特征在于，加入的用于消化的蛋白酶可以是胃蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，糜蛋白酶，膠原蛋白酶，彈性蛋白酶等；濃度為0.001-1％，消化時間5-4000分鐘不等。
7.權利要求6所述的制備方法，其特征在于，消化時間為60-120分鐘不等。
8.權利要求1所述的制備方法，其特征在于，截留柱的截止分子量為1000-100,000道爾頓，正壓0.1-1.0×104Pa，其組合方式為單柱或多柱組合使用。
9.權利要求1所述的制備方法，其特征在于，將所制備的截止分子量≤100,000道爾頓的血管生長抑制素(AI)，在制備過程到除菌一步時加入調味劑分裝成品，制成抑瘤口服液；將制備的截止分子量≤20,000的血管生長抑制素(AI)，制成注射液，或與其它藥物配伍靜脈滴入給藥。
10.權利要求9所述的制備方法，其特征在于，將所制備的截止分子量≤50,000道爾頓的血管生長抑制素(AI)，在制備過程到除菌一步時加入調味劑分裝成品，制成抑瘤口服液；將制備的截止分子量≤10,000的血管生長抑制素(AI)，制成注射液，或與其它藥物配伍靜脈滴入給藥。
11.權利要求1所述的制備方法，其特征在于，選用健康哺乳類動物如人，豬，牛，馬，羊，狗，兔等的軟骨、肌腱、真皮、肝、肺組織，用任何機械方式搗碎→-20℃深凍→融解后按照每10L液體加入1ml濃鹽酸的比例加入濃鹽酸，攪拌均勻→在40-95℃加熱10-200分鐘→恢復至室溫→-10℃凍存→融解后，離心→取沉淀，按每kg沉淀加水2L溶解，加濃度為0.001-1％的蛋白酶消化5-4000分鐘，或其它方法消化→離心，取上清液→過正壓為0.1-1.0×104Pa的正壓截留柱，截留柱的截留分子量為1000-100,000道爾頓→取濾液→除菌→分裝，包裝，制備注射藥或加調味劑制作抑瘤口服液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腫瘤血管生成抑制素的生產(chǎn)工藝,它是一種從健康哺乳動物的軟骨、肌腱、肝和肺組織中,在低溫下用生物化學技術提取,中空纖維超濾制備的具有抑制血管內(nèi)皮細胞生長的生物活性物質的方法。該方法提取的分子量為1000—100,000道爾頓的產(chǎn)物,和現(xiàn)有基因工程方法生產(chǎn)的產(chǎn)品相比,具有產(chǎn)量高、濃度高、活性相似、成本低可滿足大規(guī)模生產(chǎn)和臨床應用的需要。臨床上可用于治療類風濕病、糖尿病后遺癥和惡性腫瘤等疾病。
文檔編號A61K38/17GK1265891SQ9910274
公開日2000年9月13日 申請日期1999年3月4日 優(yōu)先權日1999年3月4日
發(fā)明者鄒清雁, 孔祥平, 曾平魯 申請人:中國人民解放軍第458醫(yī)院